Identifizierung neuer Gene, die mit Alginat-Produktion verbunden in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Mit Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon-vermittelte Mutagenese

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll, mit dem Mini-himar1 mariner Transposon-vermittelte Mutagenese zur Erzeugung einer hohen Dichte Insertionsmutante Bibliothek-Bildschirm, zu isolieren und zu identifizieren Roman Alginat-Regulatoren in der prototypischen Pseudomonas aeruginosa Stamm PAO1.

Zusammenfassung

Pseudomonas aeruginosa ist ein Gram-negatives, Umwelt Bakterium mit vielfältigen Stoffwechselfunktionen. P. aeruginosa ist ein opportunistischer bakteriellen Krankheitserreger, der chronische Lungeninfektionen bei Patienten mit zystischer Fibrose (CF) herstellt. Die Überproduktion von Kapsel-Polysaccharid Alginat genannt, die auch als mucoidy bekannt, fördert die Bildung von schleimigen Biofilms, die resistenter als Planktonzellen antibiotische Chemotherapie und Wirtsabwehr sind. Außerdem ist die Umwandlung von der nonmucoid zu schleimige Phänotyp ein klinischer Marker für die Entstehung von chronischen Infektionen bei Mukoviszidose. Alginat Überproduktion von P. aeruginosa ist ein Prozess, der endergonische Zellenergie stark besteuert. Deshalb wird Alginat Produktion hoch in P. geregelt aeruginosa. Alginat Regulation besser verstehen, ein Protokoll unter Verwendung des Mini-himar1 Transposon-Mutagenese für die Identifizierung von neuen Alginat Regler beschreiben wirs in einer prototypischen Stamm PAO1. Das Verfahren besteht aus zwei Schritten. Zuerst vom Host E. übertragen wir die Mini-Transposon himar1 (PFAC) coli SM10/λpir in Empfänger P. aeruginosa PAO1 über biparental Konjugation an ein High-Density-Insertionsmutante-Bibliothek, die auf Pseudomonas Isolation Agar-Platten mit Gentamycin ergänzt ausgewählt wurden, erstellen. Zweitens, gesiebt und isoliert die schleimige Kolonien, um die Einstichstelle durch inverse PCR Karte mit DNA-Primer zeigt vom Gentamycinkassette und DNA-Sequenzierung nach außen wir. Über dieses Protokoll haben wir zwei neue Alginat-Regulatoren, mucE (PA4033) und Kinb (PA5484), in Stamm PAO1 mit einem Wildtyp-Muça Codieren der Anti-Sigma-Faktor Muça für die Master-Alginat Regler Algu (ALGT, σ ²²⁾ identifiziert . Dieses High-Throughput-Mutagenese-Protokoll kann für die Identifizierung von anderen Virulenz-Genen verursacht Änderung Colo modifiziert werdenny Morphologie.

Einleitung

Die Fähigkeit des opportunistischen, Gram-negative Erreger Pseudomonas aeruginosa zu Alginat überproduzieren ist ein wichtiger Faktor in der Fähigkeit, einen Biofilm zu schaffen. Die Überproduktion von Alginat ein Phänotyp oft als mucoidy bezeichnet. Die Isolierung der schleimigen Kolonien von der Sputum von Patienten mit zystischer Fibrose (CF) betroffen ist, der eine chronische Infektion, und ist direkt mit einem generellen Rückgang in der Gesundheits ¹ des Patienten verbunden. Gegenwärtig ist zu verstehen, daß die Regelung und die Produktion von Alginat in P. aeruginosa tritt vor allem bei zwei Operonen. Die erste ist die Alginat-Biosy....

Protokoll

1. Vorbereitung der Bakterienstämme und biparental Konjugation

1. Impfen E. coli SM10/λpir/pFAC in 5 ml Luria Broth (LB) mit 15 ug / ml Gentamicin und in einem Schüttelinkubator über Nacht bei 37 ° C ergänzt
2. Impfen P. aeruginosa Stamm PAO1 in 5 ml LB, und in einem Schüttelinkubator über Nacht bei 42 ° C
3. Messen OD ₆₀₀ von Nacht-Kulturen und mischen gleiche Mengen von PAO1 und E. coli PFAC so daß das Endvolumen zwischen 1-1,4 ml.
4. Zentrifuge Mischung bei 6.000 × g für 5 min.
5. Inzwischen trocknen LB-Platten für die Konjugation: Lassen Platten in Inkubator offen bei 37 ° C für 10-15 min. ....

Ergebnisse

Wie in Fig. 1 dargestellt, der Mini-Transposon-Vektor himar1 mariner, PFAC enthält zwei 27 bp invertierten Wiederholungen mit TA Insertion flankieren das aacC1 Gentamycin-Resistenz-Kassette, mit σ ^{70-abhängigen} Promotor und eine multiple Klonierungsstelle (MCS). Zusätzlich enthält der Vektor Gene PFAC die hochaktiven himar1 Transposase, β-Lactamase (bla) und das Übertragungs tra-Operon codiert. Die TA Einführungsstellen ermöglichen eine effiziente .......

Diskussion

Es ist wichtig zu beachten, dass diese Methode auch in anderen Pseudomonas-Arten mit diesen Änderungen verwendet werden: P. inkubieren fluorescens und P. putida bei 30 ° C und P. stutzeri bei 42 ° C; P. stuzeri sollte auf LB-Platten mit 150 ug / ml Gentamycin ergänzt kultiviert werden; Schritt auf 1.11 P. stutzeri Zellen sollten in 500 ul LB statt 1 ml übertragen. Zusätzlich gibt es zwei kritische Schritte für dieses Protokoll. Erstens sollte der Empfängerst.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Luria Broth	Difco	240230	via Fisher Scientific
Pseudomonas Isolations-Agar	Difco	292710	via Fisher Scientific
Kleine Platten (100 O.D. x 10 mm)	Fisher Scientific	08-757-13
Große Platten (150 O.D. x 15 mm)	Fisher Scientific	08-757-14
Glycerin	Fisher Scientific	BP229-4
Tisch-Schüttelinkubator	New Brunswick Scientific	Innova 4080	Schütteln bei 200 U/min
Schrank-Inkubator	VWR	1540
Tisch-Mikrozentrifuge	Sorvall	75-003-287	über Fisher
Scientific SmartSpec Plus Spektralphotometer	Bio-Rad	170-2525	oder bevorzugte Methode/Anbieter
Einweg-Impfösen	Fisher Scientific	22-363-597
1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	05-408-129
2,0 ml Kryofläschchen	Corning	430659	über Fisher Scientific
15 ml Röhrchen	Fisher Scientific	05-539-12
Magermilch	Difco	DF0032-17-3	über Fisher Scientific
DNeasy Blut und Gewebe (250)	Qiagen	69506	oder bevorzugte Methode/bevorzugter Anbieter:
QIAquick PCR Purification Kit (250)	Qiagen	28106	oder bevorzugte Methode/bevorzugter Anbieter
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	oder bevorzugte Methode/bevorzugter Anbieter:
FastLink II DNA Ligation Kit	Epicentre Technologies	LK6201H	über Fisher Scientific
Accu Block Digital Dry Bath	Labnet	NC0205808	über Fisher Scientific
Sal1, Restriktionsendonuklease	New England BioLabs	R0138L
EasyStart Micro 50	Molecular BioProducts	6020	über Fisher Scientific
Taq DNA Polymerase	New England BioLabs	M0267L
iCycler, Thermocycler	Bio-Rad	170-8740
LE Agarose	Genemate	3120-500	über Fisher Scientific
Gentamycinsulfat	Fisher Scientific	BP918-1
2,0 ml Kryofläschchen	Corning	430659	über Fisher Scientific

: ,