Eine Strategie für einfühlsam, Large Scale Quantitative Metabolomics

Zusammenfassung

Metabolite Profiling hat sich in der Studie der Stoffwechsel in Gesundheit und Krankheit ein wertvolles Gut. Verwendung normaler-Phasen-Flüssigkeits-Chromatographie, um hochauflösende Massenspektrometrie mit Polaritätsumschaltung und eine schnelle Arbeitszyklus gekoppelt ist, beschreiben wir ein Protokoll zur Analyse der Stoffwechselpolar Zusammensetzung von biologischem Material mit hoher Empfindlichkeit, Genauigkeit und Auflösung.

Zusammenfassung

Metabolite Profiling hat sich in der Studie der Stoffwechsel in Gesundheit und Krankheit ein wertvolles Gut. Allerdings haben aktuelle Plattformen verschiedene limitierende Faktoren, wie arbeitsintensive Probenvorbereitungen, niedrige Nachweisgrenzen, langsamen Scan-Geschwindigkeiten, intensive Methodenoptimierung für jeden Metaboliten, und die Unfähigkeit, sowohl positiv messen und negativ geladenen Ionen in einzelnen Experimenten. Daher könnte ein Roman Metabolomics-Protokoll Metabolomics-Studien voranzubringen. Amid-Basis hydrophilen Chromatographie ermöglicht polare Metabolitenanalyse ohne chemische Derivatisierung. Hochauflösende MS mit der Q-Exactive (QE-MS) hat Ionenoptik verbessert, erhöhte Scan-Geschwindigkeiten (256 ms bei einer Auflösung von 70.000), und hat die Fähigkeit der Durchführung von positiven / negativen Schalt. Mit einem kalten Methanol-Extraktionsstrategie und Koppeln eines Amid-Säule mit QE-MS ermöglicht robuste Detektion von 168 gezielte polaren Metaboliten und Tausende von zusätzlichen Funktionen gleichzeitig. Dateine Verarbeitung wird mit im Handel erhältlichen Software in sehr effizienter Weise durchgeführt, und unbekannte Funktionen aus den Massenspektren extrahiert können in Datenbanken abgefragt werden.

Einleitung

Metabolomics, definiert als ein Experiment, das mehrere Metabolite gleichzeitig misst, hat eine Fläche von großem Interesse. Metabolomics bietet eine direkte Auslesen der molekularen Physiologie und hat Einblicke in Entwicklung und Krankheit wie Krebs ^4.1 zur Verfügung gestellt. Kernspinresonanz (NMR) und Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) gehören zu den am häufigsten verwendeten Instrumente ^5-9. NMR, vor allem für Fluss Experimente seit schweres Isotop markierten Verbindungen, wie ¹³ C-markierten Metaboliten verwendet wurde, sind NMR-aktiven ^10,11. Diese Strategie erfordert jedoch relativ hohe Probenreinheit und großen Probenmenge, die ihre Anwendungen in der Metabolomics begrenzt. Inzwischen Daten aus NMR gesammelt braucht intensive Analyse und Zuordnung der komplexen Verbindung NMR-Spektren ist schwierig. GC-MS wurde weithin für Polar-und Lipidstoffwechselstudien verwendet, aber es erfordert flüchtigen Compounds und daher oft Derivatisierung von Metaboliten, die manchmal mit komplexen Chemie, die zeitaufwendig sein kann und führt experimentelle Rauschen.

Flüssigkeitschromatographie (LC), um Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie verwendet den ersten Quadrupol zum Auswählen der intakten Elternionen, die dann in der zweiten Quadrupol fragmentiert werden, während der dritte Quadrupol wird verwendet, um charakteristische Fragmente oder Folgeionen zu wählen. Diese Methode, die den Übergang von der Mutterionen zu bestimmten Tochterionen erfasst wird multiple reaction monitoring (MRM) bezeichnet. MRM ist eine sehr empfindlich, spezifisch und robuste Methode sowohl für Kleinmolekül-und Protein-Quantifizierung ^12-15,21. Allerdings MRM hat seine Grenzen. Um eine hohe Spezifität zu erreichen ein MRM-Methode muss für jeden Metaboliten gebaut werden. Dieses Verfahren besteht aus der Identifizierung eines spezifischen Fragments und entsprechend optimierten Kollisionsenergie, die vor der Kenntnis der prope erfordertrties der Metaboliten von Interesse, wie die chemischen Strukturinformation. Daher, mit einigen Ausnahmen, die die neutralen Verlust von gemeinsamen Fragmenten, ist es nicht möglich, unbekannte Metaboliten mit dieser Methode zu identifizieren.

In den letzten Jahren haben die hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS) Instrumente veröffentlicht worden, wie der LTQ-Orbitrap und Exactive Serie, die QuanTof und TripleTOF 5600 ^16-18,22. HRMS kann eine Masse bereitzustellen Verhältnis (m / z) von intakten Ionen innerhalb eines Fehlers von einigen ppm berechnen. Daher kann eine HRMS Instrument der Erfassung aller Vorläuferionen (dh Scan-Modus) betrieben direkte Strukturinformation von der exakten Masse und der daraus resultierenden elementaren Zusammensetzung des Analyten zu erhalten, und diese Informationen können verwendet werden, um potentiellen Metaboliten zu identifizieren. In der Tat können alle Informationen über eine Verbindung mit einer exakten Masse erhalten werden, bis auf die Ebene der strukturellen Isomere. Auch eine VollScan-Methode erfordert keine Vorkenntnisse von Metaboliten und nicht Methodenoptimierung erfordern. Darüber hinaus, da alle Ionen mit m / z in den Scan-Bereich fallen, kann analysiert werden, hat HRMS eine nahezu unbegrenzte Kapazität in Bezug auf die Anzahl der Metaboliten, die in einem einzigen Lauf quantifiziert kann im Vergleich zu der MRM-Methode werden. HRMS ist auch vergleichbar mit einem Triple-Quadrupol-MRM in der quantitativen Kapazität aufgrund der kurzen Arbeitszyklus, was zu einer vergleichbaren Anzahl von Datenpunkten, die in einem Voll MS erhalten werden, können zu scannen. Daher stellt HRMS einen alternativen Ansatz für die quantitative Metabolomics. Vor kurzem hat eine verbesserte Version des HRMS bezeichnet Q-Exactive Massenspektrometrie (QE-MS) können unter dem Wechsel zwischen positiven und negativen Arten mit ausreichend schnellen Zykluszeiten in einer einzigen Methode, die den Erfassungsbereich ¹⁹ erweitert betrieben werden. Hier beschreiben wir unsere Metabolomics-Strategie mit der QE-MS.

Protokoll

1. Herstellung von LC-MS-Reagenzien, Einrichtung einer Chromatographie-Methode und Einrichtung von Instrumenten Operating Procedures

1. Herstellung von LC-Lösungsmittel
   1. Bereiten 500 ml mobilen Phasen. Eine 20 mM Ammoniumacetat und 15 mM Ammoniumhydroxid in 3% Acetonitril / Wasser, End-pH 9,0; und B ist 100% Acetonitril.
   2. Lose Kappe der Flasche, legen Sie sie in einem Wasser Ultraschallbad und beschallen für 10 Minuten ohne zusätzliche Heizung. (Dieser Schritt stellt sicher, dass alle Ammoniumsalze vollständig zu lösen, und dass es keine Restluftblasen.)
   3. Übertragungs 250 ml des Lösungsmittels in einen 250 ml Glasflasche für LC-MS verwenden, und halten den Rest bei 4 ° C
2. Bereiten Sie die niedrigen Massenbereich Kalibrierungslösung. Es ist wichtig, eine maßgeschneiderte niedrigen Massenbereich Kalibrierung Mischung für Metabolomics-Anwendungen verwenden, um sicherzustellen, dass die genaue Massen werden bei niedrigen Molekulargewichten nachgewiesen.
   1. Wiegen 5 mg sowohl sodiähm Fluoracetat und Homovanillinsäure und in 5 ml Wasser auflösen, um eine endgültige Konzentration von 1 mg / ml zu machen. Auflösen Diazinon in Methanol, um eine Endkonzentration von 10 mg / ml zu ergeben.
   2. Um 1 ml negativen geringe Masse Kalibrierungslösung, mischen Sie 960 ml Thermo negativen Kalibrierungslösung mit 20 ml Natrium fluoroaceate und Homovanillinsäure Lösung. Zu 1 ml positive geringe Masse Kalibrierungslösung zu machen, mischen Sie 990 ml Thermo positive Kalibrierungslösung und 10 ml Diazinon Lösung. (Die geringe Masse Kalibrierungslösung bei 4 ° C gelagert werden und alle 2 Monate frisch zubereitet werden.)
3. Kalibrierung von QE-MS an einer Low Mass Bereich
   1. Bevor niedrigen Massenbereich Kalibrierung, Durchführung einer Standard-Massenkalibrierung (m / z, 150-2,000) in positive und negative Arten auf Basis der Anweisungen des Herstellers.
   2. Sobald eine regelmäßige Massenkalibrierung spielt um 60 bis 900 m / z in der Bedienkonsole einstellen Scan-Bereichund eine Quelle CID von 25 eV für positiven Modus und 35 eV für Negativmodus angewendet wird. (Dies gibt robuste Signale des Koffein-Fragment-Ion und dem Sulfat-Ion. Die Scan-Bereich hier ist festgelegt, weil die letzte m / z sollte nicht größer als 15x des Ausgangs m / z)
   3. Sobald die Ionenquelle ist stabil, dann die kundenspezifische Kalibrierung. Anmerkung: Eine stabile Quelle wird als weniger als 10% der Gesamtionenstromverlauf in positiven Modus von weniger als 15% im negativen Modus definiert und. Die kundenspezifischen Eichionen und entsprechenden m / z sind in Tabelle 1 aufgeführt.
4. Stellen Sie den LC-MS-Instrumentierung für polare Metabolit-Analyse. LC ist mit einem QE-MS für Metabolit Trennung und Detektion gekoppelt.
   1. Anlegen der QE-MS mit einem Elektrospray-Ionisation Beheizte Sonde (H-ESI). Stellen Sie die entsprechenden Tuning-Parameter für die Sonde wie aufgelistet: Heizungstemperatur, 120 ° C; Gashülle, 30; Hilfsgas, 10; fegen Gas, 3; Spritzspannung 3,6 kV fürpositiven Modus und 2,5 kV für negativen Modus. Stellen Sie die Kapillare Temperatur bei 320 ° C und S-Linse 55.
   2. Bauen Sie einen Scan-Methode wie folgt: Voll Scan-Bereich: 60 bis 900 (m / z); Auflösung: 70.000; maximale Einspritzzeit: 200 ms mit typischen Einspritzzeiten um 50 ms; automatische Verstärkungsregelung (AGC): 3.000.000 Ionen. Diese Einstellungen führen zu einem Tastverhältnis von etwa 550 ms durchzuführen Scans in positiven und negativen Modus.
   3. Stellen Sie die Chromatographie-Verfahren. Beschäftigen ein Amid-Säule (100 x 2,1 mm ID, 3,5 mm) für die Verbindung Trennung bei Raumtemperatur ^13,15. Die mobile Phase A ist, wie oben beschrieben, und die mobile Phase B ist Acetonitril. Verwenden Sie einen linearen Gradienten wie folgt: 0 min, 85% B; 1,5 min, 85% B, 5,5 min, 35% B; 10 min, 35% B, 10.5 min 35% B, 14.5 min 35% B, 15 min, 85% B und 20 min, 85% B. Die Fließgeschwindigkeit beträgt 0,15 ml / min von 0 bis 10 min und 15 bis 20 min und 0,3 ml / min von 10,5 bis 14,5 min.

2. Preparation Metabolit von Proben

1. Bereiten Sie eine Extraktionslösungsmittel. Mischen Sie 40 ml Methanol (LC-MS-grade) und 10 ml Wasser (LC-MS-grade) in einem 50-ml-Tube, und halten Sie sie in -80 ° C-Gefrierschrank für mindestens 1 Stunde vor dem Gebrauch. Hinweis: Dieses Verfahren und die Schritte zur Extraktion von biologischem Gewebe und Flüssigkeitsproben modifiziert werden.
   1. Kultur Darmkrebs HCT 8 Zellen in drei 10-cm-Schalen oder 6-Well-Platten mit voller Wachstumsmedium RPMI 1640 mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 100.000 Einheiten / l Penicillin und 100 mg / L Streptomycin.
   2. Wenn die Zellen 80% Konfluenz erreichen, das Medium schnell zu entfernen und die Schale oder Platte oben auf Trockeneis ^13,15. 1 ml Extraktionslösung sofort (80% Methanol / Wasser), und übertragen Sie die Platte an den -80 ° C Gefrierschrank. Für eine 10 cm Schüssel, 3 ml der Extraktionslösung in jede Vertiefung. (Versuchen Sie, das Medium so viel wie möglich, um den Ionenunterdrückungseffekt durch Restsalze aus Medium zu vermeiden entfernen.)
   3. Lassen Sie die Platte für 15 min. Entfernen Sie es aus der Tiefkühltruhe, und kratzen Zellen in das Lösungsmittel auf Trockeneis. Die Lösung wird in 1,7 ml Eppendorf-Röhrchen und Zentrifugieren mit der Geschwindigkeit von 20.000 × g bei 4 ° C für 10 min. (Bereiten Zellmetaboliten aus drei verschiedenen Gerichten zu drei Parallelproben zu machen. Zweck des Haltens zwei Röhren ist es, eine als Datensicherung zu haben.)
   4. Den Überstand in zwei neuen Eppendorf-Röhrchen, und trocknen Sie sie in einer Geschwindigkeit Vakuum. Dies dauert etwa 3-6 Stunden abhängig von der Geschwindigkeit Vakuum verwendet. (Die Proben können auch über Nacht unter Stickstoff getrocknet werden.)
   5. Nach dem Trocknen die Röhrchen jeder Probe in der -80 ° C-Gefrierschrank. Wenn Sie bereit sind, zu rekonstruieren einer Probe in 20 ml Wasser (LC-MS-grade) und 5 ml injizieren zu LC-QE-MS für die Analyse.

3. Aufbau der Probensequenz

1. Nachdem die Kalibrierung ordnungsgemäß ausgeführt wurden, auf der QE-MS, LC-Säule ins Gleichgewicht für 5 min mit 85% A bei einer FlussRate von 0,15 ml / min, die den Ausgangszustand der LC-Gradienten ist.
2. Richten Sie die Probensequenz in zufälliger Reihenfolge. Anmerkung: Auf diese Weise verteilt es die durch die LC-MS zu jeder Probe eingeführt Schwankungen und gewährleistet einen genaueren Vergleich zwischen den verschiedenen Proben. Alle 6 Proben, einen Waschdurchlauf, der den gleichen MS-Verfahren teilt, mit Ausnahme der LC-Gradienten von 95% A für 10 min, gefolgt von einer 5 Minuten Äquilibrierung der Säule bei 85% A mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,15 ml / min. Leerproben (100% Wasser) nach jeder Wäsche run um das System Hintergrund bewerten und über die Höhe tragen.
3. Speichern Sie die Sequenz, und sobald das LC-Säule zeigt stabile Druck rund 400 psi, starten Sie die Reihenfolge laufen. Wenn es keine anderen Probe nach dieser Reihenfolge ausgeführt werden, dann einen Stoplauf am Ende der Sequenz, die einen Durchfluss von 0 ml / min am Ende des Gradienten hat und "Bereitschaft" nach Beendigung der Folge.
4. Re-Run die gleiche Probe eingestellt 12 Stunden nach der Kalibrierung. (Diese is, die Masse Fehler Fluktuation nach der Kalibrierung zu beurteilen.)

4. Beitrag Analysis Instrument Reinigung und Wartung

1. Am Ende der Sequenz, Waschen der Säule mit 95% A bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml / min für 2 h und falls erforderlich, umgekehrt die Säule vor dem Waschen.
2. Entfernen Sie das LC-Säule und direkt an den LC zu der Ionenquelle von einer Gewerkschaft. Bereiten Sie Reinigungsmittel, Wasser / Methanol / Ameisensäure (v: v: v, 90:10:0.2), setzen MS auf den Standby-Modus, und die Wasch LC-MS-System bei einer Durchflussrate von 0,1 ml / min für 1 h zu entfernen die Restausgefällten Salze oder andere Verunreinigungen. Senken Sie die Durchflussmenge, wenn es zu viel Systemdruck.
3. Stellen Sie die Kapillare Temperatur bei 50 ° C, und entfernen Sie die Ionen-Käfig. Sie vorsichtig die Ionen-Sweep-Konus und die Ionentransportrohr nach der Kapillar-Temperatur fällt auf 50 ° C. Verwenden eine grobe Maschen, wie Sandpapier, um Verunreinigungen auf der Oberfläche belassen des Ionensweepkonus entfernen.
4. Setzen Sie den IonentransferRohr in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen mit 10 ml 90% Wasser / Methanol mit 0,1% Ameisensäure. Nach der Beschallung der Röhre in einem Wasser Ultraschallbad für 20 min, dekantieren des Lösungsmittels im Inneren, ersetzen Sie es mit 10 ml reinem Methanol und beschallen für weitere 20 min. (Wenn notwendig, kann die Ultraschallbehandlung bei 40 ° C oder eine noch höhere Temperatur, um eine bessere Reinigungsergebnisse zu erzielen geführt werden.)

5. Analyse der LC-MS-Daten

1. Um die Probensequenz reibungslos abläuft, nach Abschluss der ersten beiden Proben in der Reihenfolge, überprüfen Peaks für unbekannte Metaboliten. Verwenden Sie eine CSV-Datei Auflistung Metabolit Namen, neutral chemische Formel und Erkennungsmodus (entweder positiv oder negativ), wie die Eingabedatei und die Ausgabedatei enthält extrahiert Spitzen und Massenfehler in ppm. Wenn der Peakform anormal oder die Massenfehler ausgeschaltet ist um mehr als 5 ppm beträgt, dann wird der Rest der Sequenz angehalten werden muss und Fehlerbehebung getan werden muss.
2. Wählen Sie die Methode der "Spitzen Ausrichtungund Rahmen-Extraktion "auf handelsübliche Software. Wählen Sie Rohdaten von LC-MS und gruppieren Sie sie. Pick-Proben in der Mitte der Ablaufreihenfolge wie Chromatographie Referenzprobe für die Spitzen Ausrichtung. Laden Sie einen Rahmen Saatgut einschließlich bekannter Stoffwechselmetabolite für die gezielte Analyse mit Daten gesammelt und der entsprechenden Rahmen Samen.
3. Führen Sie die Datenanalyse im positiven und negativen Modus getrennt. Verwenden Sie die Standardeinstellung für andere Parameter. Schalten Sie die Suchfunktion Datenbank und führen Sie den Workflow. Exportieren Sie die bearbeiteten Daten als Excel-Tabelle enthält Peakfläche von jedem Rahmen. Die ersten Sätze von Rahmen entsprechen den Metaboliten in der Zielliste. Anmerkung: Für einen gezielten Stoffwechselanalyse wird die Metaboliten Informationen basierend auf den früheren Studien ^13,15 erhalten.
4. Für eine ungezielte Metabolitenanalyse, wählen Sie die Methode der "Komponente Extraktion". Legen Leerproben für die Hintergrund Subtraktion. Stellen Sie Spitzenintensitätsschwelle ein10 t ^5, m / z Breite von 10 ppm und das Signal-Rausch-Verhältnis von 3.
5. Verwenden menschlichen Metabolom-Datenbank für unbekannte Verbindungen Identifikation. Verwenden Sie einen CV-Filter, um die Komponenten mit großen Lebensläufe im Wiederholungsproben zu entfernen. Manuell durch jede Komponente gehen und diejenigen mit gut definierten Peak oder relativ großen Unterschied in verschiedenen Proben-Typen für Datenbank-Suche. Exportieren von Daten mit Hits in der Datenbank. (Spitzen Ausrichtung könnte umgangen werden, wenn der Spitzen Alignment-Score ist zu niedrig.)

Ergebnisse

Die Genauigkeit der Metabolomics-Daten hängt stark von der LC-MS-Gerät QE-Leistung. Zu beurteilen, ob das Gerät in einem guten Zustand betrieben wird, und ob die angewendete Methode ist die richtige, sind verschiedene bekannte Metaboliten LC-Peaks von der Gesamt Ionenchromatographie (TIC) extrahiert, wie in Fig. 1 gezeigt. Polaren Metaboliten, einschließlich Aminosäuren, Glykolyse Zwischen , TCA Zwischenprodukte, Nukleotide, Vitamine, ATP, NADP ⁺ und so weiter haben gute Retention auf die Spa...

Diskussion

Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Metabolite Profiling in Zellen mit diesem Protokoll sind: 1) die Steuerung des Wachstumsmediums und sorgfältige Entnahme der Zellen; 2) Einstellen des LC-Verfahren auf Basis von MS-Methode Einrichtung, um sicherzustellen, gibt es genug (in der Regel mindestens 10) Datenpunkte über einen Peak für die Quantifizierung; 3) macht einen geringen Masse Kalibrierung, bevor Sie Proben; 4) Einspritzen nicht mehr als 5 ml Retentionszeit zu vermeiden und Schaltspitzenverbreiterung durc...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Positive Kalibriermischung	Thermo Scientific	#88323	Es ist lichtempfindlich. Bei 4 Grad lagern; C
Negative Kalibriermischung	Thermo Scientific	#88324	Bei 4 & Grad lagern; C
Diazinon	Sant Cruz Biotechnologie	#C0413	Es verursacht Augenreizungen, also arbeiten Sie in der Kapuze. Bei 4 Grad lagern; C
H-ESI Nadeleinsatz	Fisher Scientific	#1303200	Dieser kann bei Verstopfung durch 5% Ameisensäure/Wasser ersetzt oder mit 5% Ameisensäure/Wasser (Gummiring entfernen) gereinigt werden.
Xbridge Amidsäule	Wasser	#186004860	Die Vorsäule wird empfohlen, um die Lebensdauer der Säule zu verlängern.