Juxtasomal Biocytin Labeling, um die Struktur-Funktions-Beziehung der einzelnen kortikalen Neuronen Studieren

Summary

Um die Struktur neuronaler Netze zu verstehen, funktionellen und morphologischen Charakterisierung der einzelnen Neuronen notwendig. Hier zeigen wir, juxtasomal Biocytin Etikettierung, die elektrophysiologischen Ableitungen in der extrazellulären Konfiguration ermöglicht, aber die Aufrechterhaltung der Fähigkeit, intrazellulär beschriften Sie die Neuron für Post-hoc-Rekonstruktion von dendritischen und axonalen Architektur.

Abstract

Die Hirnrinde von mehreren Schichten und viele verschiedene Zelltypen, die zusammen als ein Netzwerk für viele höhere kognitive Funktionen einschließlich Entscheidungen, sensorischen geführte Verhalten oder Speicher verantwortlich ist. Um zu verstehen, wie solche komplizierten neuronalen Netzwerken erfüllt die Aufgaben, ist ein wichtiger Schritt, um die Funktion (oder elektrische Aktivität) der einzelnen Zelltypen innerhalb des Netzes zu bestimmen, wenn das Tier bevorzugt ist die Durchführung einer entsprechenden kognitiven Aufgabe. Zusätzlich ist es ebenso wichtig, die anatomische Struktur des Netzwerks und der morphologischen Architektur der einzelnen Neuronen zu ermöglichen Reverse Engineering des kortikalen Netzwerks zu bestimmen. Technische Durchbrüche heute ermöglichen die Aufnahme Zellaktivität bei wachen, sich verhaltenden Tier mit der wertvollen Möglichkeit, Post-hoc-Identifizierung der aufgezeichneten Neuronen. Hier zeigen wir die juxtasomal Biocytin Markierungstechnik, die Aufzeichnungsaktion Potentiometer beinhaltetal Spick in der extrazellulären (oder lose-Patch)-Konfiguration mit herkömmlichen Patch-Pipetten. Die juxtasomal Aufnahmekonfiguration ist relativ stabil und zutreffend über Verhaltensbedingungen, einschließlich betäubt, betäubt, wach Kopf befestigt, und auch in der frei beweglichen Tier. Somit ermöglicht diese Methode die Verknüpfung Zelltyp-spezifische Aktionspotential Spick während das Verhalten der Tiere, um die Rekonstruktion der einzelnen Nervenzellen und letztlich der gesamten kortikalen Mikroschalt. In diesem Video-Manuskript, zeigen wir, wie einzelne Nervenzellen im juxtasomal Konfiguration kann mit Biocytin in der Urethan-narkotisierten Ratten für Post-hoc-Identifikation und morphologische Rekonstruktion gekennzeichnet werden.

Introduction

Neuronale Netzwerke bestehen aus mehreren Zelltypen, dadurch gekennzeichnet, hochspezifische morphologische und physiologische Eigenschaften ^1-7. Als eine Folge einzelner Zelltypen führen spezialisierte Aufgaben im Netzwerk (siehe beispielsweise Gentet et al. ⁸ und Burgalossi et al. ^9). Wir sind erst am Anfang, um die Zelltyp-spezifische Funktionen in neuronalen Netzwerken zu verstehen und ist immer noch viel zu entdecken. Zu diesem Zweck sind viele Labors experimentelle Ansätze anwenden, die die Analyse von morphologischen Eigenschaften des gleichen neuronalen Population, aus der physiologischen Parameter wurden erhalten, ^1,10-15 ermöglichen. Hier zeigen wir die juxtasomal Markierungstechnik ^16,17, die elektrophysiologischen Ableitungen geht mit herkömmlichen Patch-Pipetten in der extrazellulären (also nicht-invasive)-Konfiguration in Kombination mit der Elektroporation aufgezeichnet Neuron mit Biocytin. Diegroße Vorteil dieses Ansatzes ist, dass die nicht-invasive Natur sorgt dafür, dass Aktionspotential Spicken von einzelnen Neuronen ohne Veränderung (zB Dialyse) den intrazellulären Inhalt der Zelle aufgezeichnet. Gefolgt durch Elektroporation bietet die juxtasomal Ansatz die Möglichkeit, Post-hoc-Zell-Identifikation und Rekonstruktion der Funktion (Physiologie), um die Struktur (Morphologie) zu verknüpfen. Typischerweise beinhaltet morphologische Rekonstruktion Rekonstruktion von dendritischen und axonalen Morphologie, die Quantifizierung der Wirbelsäule und / oder bouton Dichten oder auch Rekonstruktion von neuronalen Morphologie im Nanometerauflösung mittels Elektronenmikroskopie erweitert werden kann. Die juxtasomal Aufzeichnungstechnik kann für die in vivo-Aufnahmen von verschiedenen Zelltypen in kortikalen Schichten oder subkortikale Bereiche in einer Reihe von Arten verwendet werden, obwohl die meisten Studien haben die Technik in kleine Nagetiere wie Mäuse oder Ratten angewendet. Unsere Forschung ist auf die Aufnahme und Kennzeichnung Neuronen konzentriertaus Ratten primären somatosensorischen Kortex (S1) und beinhaltet visuelle Identifizierung der aufgezeichneten Neuronen ^18, dendritische Rekonstruktionen in Kombination mit präzise Erfassung in einem standardisierten Referenzrahmen Reverse Engineering kortikaler Netzwerke ^4,19 und detaillierte Rekonstruktion der axonalen Architektur zur Charakterisierung Zelltyp-spezifische lokale und langfristige Projektion richtet ^20.

Im Vergleich zu alternativen In-vivo-Aufnahmetechniken (intrazelluläre oder ganze Zellen), sind juxtasomal Aufnahmen relativ stabil und können daher über Verhaltenszustände einschließlich betäubt ^21,22 angewendet werden, sediert ^14, wach kopffesten ²³ oder sogar frei beweglichen Tieren ⁹ . Hier zeigen wir juxtasomal Kennzeichnung S1 eines Urethan-narkotisierten Ratten, obwohl wir betonen die allgemeine Anwendbarkeit dieser Technik auf viele Vorbereitungen der Wahl.

Protocol

1. Vorbereitung der Tiere

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem niederländischen Gesetz und nach der Auswertung von einer lokalen Ethikkommission an der VU University Amsterdam, Niederlande, durchgeführt.

1. Betäuben einer Wistar-Ratte (P25-P45, ♂ / ♀) mit Isofluran (2-3% in Sauerstoff) und anschließend mit Urethan (20% in 0,9% NaCl, 1,6 bis 1,7 g / kg) durch intraperitoneale Injektion. Beurteilen Sie die Tiefe der Narkose durch Überwachung Prise Entzug, Augenlid Reflexe und Bewegungen Tasthaare.
2. Verwalten Sie eine zusätzliche Dosis von Urethan (10% der Anfangsdosis) im Falle das Tier nicht ausreichend Narkosetiefe zu erreichen, oder wenn Tasthaare Zuckungen im Verlauf des Experiments beobachtet.
3. Setzen Sie den narkotisierten Tier auf der stereotaktischen Rahmen mit einem Heizkissen ausgestattet, legen rektale Temperatursonde und die Körpertemperatur des Tieres zu halten, bei 37,5 ± 0,5 ° C durch ein Heizkissen.
4. Positionieren Sie den Kopf des Tieres in der stereotaktischen Rahmen, schneiden Sie die Haare am Oberkopf mit einer Schere, um die Haut sichtbar zu machen.
5. Injizieren Sie 100 ul 1% Lidocain (in 0,9% NaCl) subkutan zur Lokalanästhesie an der Einsatzstelle und warten 3-5 min. Entfernen Sie die Haut, die die Oberfläche des Schädels durch Schneiden in der Schwanz-to-rostrale Richtung und reinigen Sie die restlichen Gewebe.
6. Reinigen Sie den Schädel ausgiebig mit 0,9% NaCl und saugfähige Tupfer.
7. Bestimmen der Koordinaten des Zielbereichs auf der linken Hemisphäre (zum primären somatosensorischen Kortex (S1): 2,5 mm posterior und 5,5 mm lateral zum Bregma). Markieren Sie die Stelle auf den Schädel mit einem chirurgischen Hautmarkierungsstift.
8. Abkratzen Knochen sanft von einem Zahnbohrer aus der Region von Interesse, bis der Knochen wird transparent und Blutgefäße sind deutlich sichtbar.
9. Einen 0,5 mm x 0,5 mm Kraniotomie, indem ein Fenster in der ausgedünnten Schädel mit einem Skalpell (Nr. 11), die Vermeidung von Schäden an der Dura materund Blutgefäße. Optional: Markieren Sie die Kanten der Kraniotomie mit einem chirurgischen Hautmarkierungsstift, um die Sichtbarkeit zu verbessern.
10. Tragen Sie eine dünne Schicht der Sekundenkleber auf die Trocken Schädel und Zahnzement, ein Bad (dh die Aufnahme Kammer), die den Kraniotomie zu konstruieren.
11. Trimmen der Whisker an der kontralateralen Seite genau 5 mm von der Whisker Follikel. Optional: Markieren Sie die Barthaare getrimmt mit schwarzer Mascara.

2. Juxtasomal Recordings und Biocytin Labeling

1. Machen Patch-Pipetten aus Borosilikatglas mit innen Spitzendurchmesser von ~ 1 um bis Elektroden mit 3-5 MOhm Widerstand zu erhalten. Hinweis: Die ideale Pipette Morphologie für die juxtasomal Aufnahme ist eine allmähliche Verjüngung schlank, eine niedrige Konuswinkel, und a ~ 1 um Spitze (Abbildung 1).
2. In Abhängigkeit von der Aufzeichnungstiefe (bezogen auf die Pia-Oberfläche), sollten die Abmessungen der Verjüngung der Aufzeichnungselektrode eingestellt werden. Von entscheidender Bedeutung ist, dass ter verjüngen Durchmesser sollte weniger als 75 um bereits am Eintrittspunkt in das Gehirn, um mechanische Beschädigungen oder Stress auf den Aufnahmebereich zu vermeiden. Dies zeigt, daß bei oberflächlichen kortikalen Aufnahmen, eine Verjüngung von 300-500 &mgr; m mit einem Außendurchmesser von maximal 75 &mgr; m erforderlich ist (Fig. 1A), während die Aufnahmen von relativ tiefen kortikalen Schichten erfordern eine längere Verjüngung 1.500-1.800 &mgr; m, wieder mit maximaler Außen Durchmesser von 75 &mgr; m (1,800 &mgr; m an der Elektrodenspitze).
3. Laden Sie die Patch-Pipette mit normalem Ratten Rufton (NRR), ergänzt mit 2% Biocytin (siehe Tabelle 1 für Lösungen und Reagenzien) und montieren Sie die Patch-Pipette auf einem Kopf Stufe auf einen Mikromanipulator befestigt.
4. Den Winkel des Elektrodenhalters bis 34 ° in Bezug auf die Sagittalebene, um gezielt die Kolonne D2 von Ratten-S1.
5. Schließen Sie das Kopfstufe mit einem Verstärker in Brücke-Modus (dh Stromzange).
6. Positionieren Sie den Patchpipettieren, in der Nähe der Kraniotomie. Füllen Sie die Badewanne mit 0,9% NaCl und bestimmen den Elektrodenwiderstand, der zwischen 3-5 MOhm, durch Anlegen einer Rechteckimpuls mit positiven Stromeinspeisung (1 nA, 200 ms an / aus) bewertet sein sollten.
7. Stellen Überdruck von 100 bis 150 mbar und vorab die Patch-Pipette in ein um Schritte, während die Anwendung positiver Strom als Rechteckimpulse (1 nA, 200 ms an / aus). Überwachen Sie die robuste Widerstandsänderung bei der Kontaktaufnahme mit der Dura mater. An diesem Punkt setzen die Koordinaten der Mikromanipulator auf "Null", um genaue Tiefenmessungen zu ermöglichen.
8. Geleistete in 1 um Schritt-Modus, bis der Patch-Pipette durchdringt die von einem plötzlichen Abfall des Elektrodenwiderstand angegeben Dura mater. Entfernen des Haltedrucks der Pipette.
9. Suche nach einzelnen Einheiten beim Vorrücken in 1 um Schritte. Überwachung der Elektrodenwiderstand kontinuierlich durch Anlegen von 200 msec ein / aus-Impulse. Eine Erhöhung der Elektrodenwiderstand typicVerbündeter zeigt die Nähe eines einzelnen Neurons. Schieben Sie die Elektrode, bis positive Aktionspotential (AP) Wellenformen von ~ 2 mV aufgezeichnet (2A und 2B).
10. Optional: Nimmt die spontane Spiking Muster der Neuronen zu bestimmen und Whisker-evozierte Spiking von, zum Beispiel, nach kaudal Ablenken einzelnen Whisker für 200 ms unter einem Winkel von 3,3 º mit einer piezoelektrischen Vorrichtung ^18.
11. Schieben Sie die Elektrode bis der Widerstand ist 25-35 MOhm und Spikes Amplituden von 3-8 mV optimale Bedingungen für juxtasomal Füllung erhalten. Starten des juxtasomal Füllung durch Anlegen von Rechteckimpulsen positiver Strom (1 nA, 200 ms EIN / AUS). Langsam und schrittweise Erhöhung der Strom, der durch Stufen von 0,1 nA, während die Überwachung der AP-Wellenform und Frequenz (2A und 2B).
12. Überwachen Sie die Membranöffnung als eine klare Zunahme der AP-Frequenz während der Ein-Phase des Blockimpuls (2C ). Die Spitzen-Wellenform während Füllung zeigt eine erhöhte Breite und reduziert nach-Hyperpolarisation (2C und 2D). Weitere Parameter sind eine erhöhte Lärm oder eine kleine (1-5 mV) negativen DC-Verschiebung.
13. Erhöhen oder verringern den Strom (1 nA) beim Ausfüllen stabile Biocytin Infusion erhalten. Reduzieren oder stoppen Sie die Stromimpulse auf plötzlichen Anstieg der AP-Frequenz, um die Toxizität durch Über Zustrom von extrazellulären Ionen wie Natrium-Ionen zu vermeiden. Hinweis: jedes Neuron wird unterschiedlich auf die Stromeinspeisung und juxtasomal Kennzeichnung Parameter müssen je nach individuellen Aufnahmebedingungen angepasst werden reagieren.
14. Das Signal nach dem Stoppen der Stromeinspeisung genau beobachten. Die Spitzen-Wellenform nach einer Füllung Sitzung ist in der Regel erweitert und zeigt eine Hyperpolarisation nach stark reduziert. Warten für die Wiederherstellung der Neuronen, die offensichtlich ist, wenn die Spitzen-Wellenform wieder seine ursprünglichen Eigenschaften (dh Gegenwartnormal nach-Hyperpolarisation, Abbildung 2).
15. Wiederholen Biocytin Sitzungen zum Ausfüllen nach der vollständigen Wiederherstellung des Neurons zu Biocytin Last für eine verbesserte Qualität der Färbung zu erhöhen.
16. Fahren Sie die Patch-Pipette in Schritten von 1 um, bis die Spitze Amplitude abnimmt, um mechanische Spannungen auf die Zelle zu reduzieren. Warten Sie mindestens 1 Stunde für die Biocytin intrazellulär diffundieren dabei eng Überwachung der Körpertemperatur des Tieres und die Atmung.

3. Perfusion der Tier-und Ausbau des Gehirns

1. Bereiten Sie die Setup-Perfusion, spülen, und Vorspannung der Schlauch mit 0,9% NaCl.
2. Positionieren Sie das Tier auf einem OP-Tray und mit Standard-Etikettenband. Für ausreichende Tiefe der Narkose; Fuß Prise Augenlid und Reflexe sollten nicht vorhanden sein.
3. Machen Sie eine medial Schnitt (5-6 cm) durch die Bauchwand direkt unter dem Brustkorb seitlich und fahren in posterior-anterior Richtung, um das Brustbein aus.Ziehen Sie das Brustbein nach vorne und vorsichtig die Leber von der Membran.
4. Einen kleinen Einschnitt in der Membran, durch die unteren Rippen geschnitten und weiter den Schnitt entlang der gesamten Länge der Bauchhöhle, um das Herz freizulegen.
5. Entfernen Sie den Herzbeutel.
6. Führen Sie die Nadel in die linke Herzkammer und einen Einschnitt in den rechten Vorhof. Perfusion mit 0,9% NaCl (~ 8 ml / min) bis zur Entfärbung der Leber vollständig ist.
7. Schalten Sie die Infusions bis 4% Paraformaldehyd (PFA), bis Steifigkeit des Vorderpfote und Unterkiefer ist offensichtlich.
8. Enthaupten die Ratte mit einer Schere
9. Entfernen Sie die restlichen Nackenmuskulatur und setzen den Schädel komplett.
10. Positionieren Sie die Schere im Hirnstamm auf der Rückenseite und schneiden Sie die Knochen vorsichtig entlang der Pfeilnaht, die Aufrechterhaltung der Rückenlage.
11. Entfernen der Knochen von beiden Seiten der Pfeilnaht um das Gehirn freizulegen mit einer Pinzette. Die Dura vorsichtig entfernen, um zu vermeiden, dAmage.
12. Einem stumpfen Spachtel vorsichtig in die Bauchseite des Gehirns und das Gehirn zu entfernen sanft.
13. Post-fix das gesamte Gehirn über Nacht in PFA bei 4 ° C Schalten Sie das Gehirn, um 0,05 M Phosphatpuffer (PB) und lagern bei 4 ° C

4. Slicing the Brain in Tangential Sections

1. Nehmen Sie das Gehirn aus dem 0,05 M PB und legte es auf ein Filterpapier zugewandten vorderen. Mit einem scharfen Rasierklinge schneiden Sie das Kleinhirn entlang der Frontalebene und trennen Sie die Hemisphären durch Schneiden entlang der mittlere Sagittalebene.
2. Sekundenkleber auf der Montageplattform und montieren Sie die linke Hemisphäre auf der Sagittalebene mit Front nach rechts. Die Montageplattform in einem Winkel von 45 ° auf einem Vibratom und tauchen das Gehirn in 0,05 M PB.
3. Sicherung einer Rasierklinge auf dem Vibratom und sicherstellen, dass der erste Kontakt mit der Hirnoberfläche ist in der Mitte der anterior-posterioren Ebene der Halbkugel. Cut 24 100 umAbschnitte und sammeln sie in einer 24-Well-Platte mit 0,05 M PB.

5. Die histologische Verfahren

1. Führen histologischen Protokolle für die Cytochrom-Oxidase-Färbung ²⁴ und der Avidin-Biotin-Peroxidase-Verfahren nach zuvor beschriebenen Verfahren ^25. Optional: visualisieren Biocytin mit fluoreszierenden Avidin / Streptavidin-Konjugate Alexa. Dies ermöglicht zusätzlich Doppelfärbung mit retrograde oder anterograde Tracing-Techniken.
2. Wash Abschnitte 5 x 5 min mit 0,05 M PB und bereiten die 3-3'-Diaminobenzidin (DAB)-haltigen Lösung für die Cytochrom-Oxidase-Färbung Fässer in Schicht 4 (L4) von S1 zu visualisieren (siehe Tabelle 2 für Lösungen und Reagenzien). Abschnitte 6-12 von Pia im vorgewärmten Lösung für 30-45 min bei 37 ° C.
3. Spülen Abschnitte mit 0,05 M PB für 6 x 5 min und stillen endogenen Peroxidase-Aktivität durch Inkubation alle Abschnitte in 3% H ₂ O ₂ in 0,05 M PB für 20 min bei Raumtemperatur (RT).
4. Spülen Abschnitte mit 0,05 M PB bei 5 x 10 min. Abschnitte in ABC-Lösung inkubiert (siehe Tabelle 3 für Lösungen und Reagenzien) über Nacht bei 4 ° C
5. Spülen Abschnitte mit 0,05 M PB für 5 x 10 min und bereiten die DAB-Lösung, um die Biocytin gefüllten Neuron visualisieren (siehe Tabelle 4 für Lösungen und Reagenzien). Abschnitte in gefilterten Lösung inkubieren 45-60 min bei RT.
6. Spülen Abschnitte mit 0,05 M PB bei 5 x 10 min. Berg Abschnitte auf Objektträger und Deckgläschen mit Mowiol (siehe Tabelle 5 nach Lösungen und Reagenzien).
7. Bestimmen Sie Etikettierqualität mittels Lichtmikroskopie.

Results

Detaillierte Kenntnisse über 3D-Struktur der einzelnen Nervenzellen ist entscheidend für die Aufklärung Organisationsprinzipien neuronaler Netzwerke. Unsere Methode beinhaltet eine Pipeline, um qualitativ hochwertige Biocytin Kennzeichnung von einem in-vivo-Herstellung zu erreichen, wodurch post hoc neuronalen Klassifizierung und detaillierte Rekonstruktion von dendritischen und axonalen Architektur einzelner Neurone bei hoher Auflösung. Abhängig von der Qualität des juxtasomal Etikettierung werden Neu...

Discussion

Die juxtasomal Verfahren ermöglicht die Aufnahme in vivo Aktionspotential Spicken von einzelnen Einheiten über Verhaltensbedingungen (narkotisiert, wach Kopf-fest oder frei zu bewegen) mit der Option der Biocytin-Beschriftung der aufgezeichneten Neuron für Post-hoc-Zelltyp Klassifizierung und / oder 3D-Rekonstruktion. Der große Vorteil ist, um physiologische Parameter in der extrazellulären (also nicht-invasive)-Konfiguration zu erhalten, noch in der Lage, das Neuron intrazellulär mit Biocytin ^16,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SM-6 Steuerung	Luigs Neumann
LN- Mini 23 XYZ
LN- Mini 55 Manipulatorblock X2
Lynx-8 Verstärker	Neuralynx
Axoclamp-2B Verstärker	Axon Instruments
Osada Modell EXL-M40	Osada, Inc.
Piezoelektrisches Bauelement	Physik Instrumente	PL140.10
LabView	National Instruments, Austin, TX, USA		LabView-Erfassungssoftware
Ntrode Virtual Instrument	R. Bruno, Columbia Univ., NY
Sugi absorbierende Tupfer	Kettenbach	30601
Cytochrom C aus Pferdeherz	Sigma	C2506
Katalase aus Rinderleber	Sigma	C9322
DAB	Sigma	D5637
H2O2	Boom	7047
Vectastain Standard ABC-Kit	Vector	PK6100
Triton X100	Sigma	T9284
Urethan	Sigma	U2500
Isofluran	Pharmachemie	45.112.110
Lidocain	Sigma	L5647
Simplex Zahnschnellzement	Kemdent	ACR308/ACR924
Biocytin	Molekula	36219518
PFA	Merck Millipore	8187151000
Trizma Base	Sigma	T4661
Mowiol 4-88	Aldrich	81381
Analytisches Glycerin	Fluka	49767
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma Aldrich	31434
KCl	Sigma Aldrich	60130
CaCl	Sigma Aldrich	22.350-6
MgCl2	Fluka	63072