Juxtasomal Biocytin Labeling, um die Struktur-Funktions-Beziehung der einzelnen kortikalen Neuronen Studieren

Summary

Um die Struktur neuronaler Netze zu verstehen, funktionellen und morphologischen Charakterisierung der einzelnen Neuronen notwendig. Hier zeigen wir, juxtasomal Biocytin Etikettierung, die elektrophysiologischen Ableitungen in der extrazellulären Konfiguration ermöglicht, aber die Aufrechterhaltung der Fähigkeit, intrazellulär beschriften Sie die Neuron für Post-hoc-Rekonstruktion von dendritischen und axonalen Architektur.

Abstract

Die Hirnrinde von mehreren Schichten und viele verschiedene Zelltypen, die zusammen als ein Netzwerk für viele höhere kognitive Funktionen einschließlich Entscheidungen, sensorischen geführte Verhalten oder Speicher verantwortlich ist. Um zu verstehen, wie solche komplizierten neuronalen Netzwerken erfüllt die Aufgaben, ist ein wichtiger Schritt, um die Funktion (oder elektrische Aktivität) der einzelnen Zelltypen innerhalb des Netzes zu bestimmen, wenn das Tier bevorzugt ist die Durchführung einer entsprechenden kognitiven Aufgabe. Zusätzlich ist es ebenso wichtig, die anatomische Struktur des Netzwerks und der morphologischen Architektur der einzelnen Neuronen zu ermöglichen Reverse Engineering des kortikalen Netzwerks zu bestimmen. Technische Durchbrüche heute ermöglichen die Aufnahme Zellaktivität bei wachen, sich verhaltenden Tier mit der wertvollen Möglichkeit, Post-hoc-Identifizierung der aufgezeichneten Neuronen. Hier zeigen wir die juxtasomal Biocytin Markierungstechnik, die Aufzeichnungsaktion Potentiometer beinhaltetal Spick in der extrazellulären (oder lose-Patch)-Konfiguration mit herkömmlichen Patch-Pipetten. Die juxtasomal Aufnahmekonfiguration ist relativ stabil und zutreffend über Verhaltensbedingungen, einschließlich betäubt, betäubt, wach Kopf befestigt, und auch in der frei beweglichen Tier. Somit ermöglicht diese Methode die Verknüpfung Zelltyp-spezifische Aktionspotential Spick während das Verhalten der Tiere, um die Rekonstruktion der einzelnen Nervenzellen und letztlich der gesamten kortikalen Mikroschalt. In diesem Video-Manuskript, zeigen wir, wie einzelne Nervenzellen im juxtasomal Konfiguration kann mit Biocytin in der Urethan-narkotisierten Ratten für Post-hoc-Identifikation und morphologische Rekonstruktion gekennzeichnet werden.

Introduction

Neuronale Netzwerke bestehen aus mehreren Zelltypen, dadurch gekennzeichnet, hochspezifische morphologische und physiologische Eigenschaften ^1-7. Als eine Folge einzelner Zelltypen führen spezialisierte Aufgaben im Netzwerk (siehe beispielsweise Gentet et al. ⁸ und Burgalossi et al. ^9). Wir sind erst am Anfang, um die Zelltyp-spezifische Funktionen in neuronalen Netzwerken zu verstehen und ist immer noch viel zu entdecken. Zu diesem Zweck sind viele Labors experimentelle Ansätze anwenden, die die Analyse von morphologischen Eigenschaften des gleichen neuronalen Population, aus der physiologischen Parameter wurden erh....

Protocol

1. Vorbereitung der Tiere

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem niederländischen Gesetz und nach der Auswertung von einer lokalen Ethikkommission an der VU University Amsterdam, Niederlande, durchgeführt.

1. Betäuben einer Wistar-Ratte (P25-P45, ♂ / ♀) mit Isofluran (2-3% in Sauerstoff) und anschließend mit Urethan (20% in 0,9% NaCl, 1,6 bis 1,7 g / kg) durch intraperitoneale Injektion. Beurteilen Sie die Tiefe der Narkose durch Überwachung Prise Entzug, Augenlid Reflexe und Bewegungen Tasthaare.
2. Verwalten Sie eine zusätzliche Dosis von Urethan (10% der Anfangsdosis) im Falle das Tier nicht ausreichend Narko....

Results

Detaillierte Kenntnisse über 3D-Struktur der einzelnen Nervenzellen ist entscheidend für die Aufklärung Organisationsprinzipien neuronaler Netzwerke. Unsere Methode beinhaltet eine Pipeline, um qualitativ hochwertige Biocytin Kennzeichnung von einem in-vivo-Herstellung zu erreichen, wodurch post hoc neuronalen Klassifizierung und detaillierte Rekonstruktion von dendritischen und axonalen Architektur einzelner Neurone bei hoher Auflösung. Abhängig von der Qualität des juxtasomal Etikettierung werden Neu.......

Discussion

Die juxtasomal Verfahren ermöglicht die Aufnahme in vivo Aktionspotential Spicken von einzelnen Einheiten über Verhaltensbedingungen (narkotisiert, wach Kopf-fest oder frei zu bewegen) mit der Option der Biocytin-Beschriftung der aufgezeichneten Neuron für Post-hoc-Zelltyp Klassifizierung und / oder 3D-Rekonstruktion. Der große Vorteil ist, um physiologische Parameter in der extrazellulären (also nicht-invasive)-Konfiguration zu erhalten, noch in der Lage, das Neuron intrazellulär mit Biocytin ^16,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SM-6 Steuerung	Luigs Neumann
LN- Mini 23 XYZ
LN- Mini 55 Manipulatorblock X2
Lynx-8 Verstärker	Neuralynx
Axoclamp-2B Verstärker	Axon Instruments
Osada Modell EXL-M40	Osada, Inc.
Piezoelektrisches Bauelement	Physik Instrumente	PL140.10
LabView	National Instruments, Austin, TX, USA		LabView-Erfassungssoftware
Ntrode Virtual Instrument	R. Bruno, Columbia Univ., NY
Sugi absorbierende Tupfer	Kettenbach	30601
Cytochrom C aus Pferdeherz	Sigma	C2506
Katalase aus Rinderleber	Sigma	C9322
DAB	Sigma	D5637
H2O2	Boom	7047
Vectastain Standard ABC-Kit	Vector	PK6100
Triton X100	Sigma	T9284
Urethan	Sigma	U2500
Isofluran	Pharmachemie	45.112.110
Lidocain	Sigma	L5647
Simplex Zahnschnellzement	Kemdent	ACR308/ACR924
Biocytin	Molekula	36219518
PFA	Merck Millipore	8187151000
Trizma Base	Sigma	T4661
Mowiol 4-88	Aldrich	81381
Analytisches Glycerin	Fluka	49767
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma Aldrich	31434
KCl	Sigma Aldrich	60130
CaCl	Sigma Aldrich	22.350-6
MgCl2	Fluka	63072