Ein Protokoll für die Analyse von Hepatitis-C-Virus-Replikation

Hepatitis-C-Virus (HCV) verursacht Leberzirrhose und Leberkrebs. Es betrifft 170 Millionen Menschen weltweit mit 350.000 Menschen sterben jährlich ^1-3. HCV ist ein positiver Strang-RNA-Virus mit einer Genomgröße von 9,6 kb. Das HCV-Genom als ein einzelnes Polyprotein von ca. 3000 Aminosäuren, das proteolytisch durch verschiedene zelluläre und virale Proteasen gespalten, in 10-Polypeptide translatiert wird. HCV-Virus ist der Prototyp der Gattung Hepacivirus und gehört zur Familie der Flaviviridae ^4. Bei der Belichtung stellt chronischer HCV-Infektion in 80% der Individuen. Die Infektion ist meist asymptomatisch und rechtzeitige Diagnose kann die therapeutische Intervention zu Leber Verschlechterung verhindern können. Die derzeitige Behandlung nicht optimal sein und kein Impfstoff verfügbar ist ^5,6.

Die Ätiologie der Hepatitis C wurde erstmals 1989 ⁷ beschrieben. Studieren HCV-Replikation ist wichtig für die Hepatitis-C-Impfstoff-und Behandlungsforschung, aber es warlang durch das Fehlen eines effizienten Viruskultursystem behindert. Ein molekularer Klon des HCV Infektions wurde gezeigt, bei Schimpansen auf intra-Impfung ⁸ sein. Anschließend wurden HCV subgenomische Replikon beschrieben, die das virale Genom-Replikation Stufe in einem Zellkultursystem erlaubt ^9,10 sezieren. Entdeckung einer Genotyp HCV 2a isolieren JFH-1 (Japanese Fulminante Hepatitis-1), infizieren Zellkultur eröffnet neue Wege für die HCV-Replikation Forschungs ^11-13. Genotyp 2a Stamm JFH-1-Basis inter-und intra-und genotypische chimären Viren vom Genotyp 1 HCV Infektions basierend Kultursysteme sind auch ^{14 bis 18} erhältlich.

Wir haben erfolgreich JFH-1-Stamm-und HCV-intragenotype 2a chimären Virus verwendet, um die hochauflösenden funktionellen Profilierung Karte von Proteindomänen und cis-aktiven RNA-Elemente ^19,20 zu erhalten. Demnach beschreiben wir eine effektive Kultursystem routinemäßig verwendet, die ermöglichtStudium der verschiedenen Stadien des HCV-Replikationszyklus und Wirt-Pathogen-Interaktion. Wir präsentieren virologische Untersuchungen auf virale Genom-Replikation und de novo Infektiosität von HCV intragenotype 2a und einem Renilla-Luciferase Reporter basierend HCV beurteilen.

Ein allgemeiner Überblick über das Protokoll ist in Fig. 1 dargestellt.

1. Cells

1. Vorbereitung vollständige Wachstumsmedium, das 10-15% fötalem Rinderserum (FBS), 10 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 10 mM Hepes, Penicillin (100 Einheiten / ml), Streptomycin (100 mg / ml) und 2 mM L-Glutamin enthält.
2. Pflegen Huh-7.5.1-Zellen in ¹³ komplette Wachstumsmedium, das die oben genannten Ergänzungen für in-vitro-Analyse von Hepatitis-C-Virusreplikationszyklus.
3. Kultur Virusstämme in Huh-7.5.1-Zellen mit den angegebenen Wachstumsmedium ergänzt bei 37 ° C mit 5% CO _2.

2. Viren und Plasmid-Konstrukte

1. Erzeugen, die komplementäre DNA (cDNA)-Form von HCV-RNA und klonen in einen Plasmidvektor für einfache genetische Manipulation. Hinweis: Die Entdeckung der japanischen fulminante Hepatitis 1, JFH-1 (HCV Genotyp 2a), Isolat HCV kritisch für Forschung gewesen undin erster Linie verwendet, um die HCV-Replikationszyklus ^11-13 studieren. Inter-und intragenotypic chimären Viren basierend auf JFH-1 HCV sind häufig in Forschungs ^14-18 verwendet. Konstruktion von synthetischen intragenotype 2a chimären Virus, FNX-HCV und einem monocistronischen chimären Reporterstamm wurde zuvor ¹⁹ und konstruktive Details sind nicht Gegenstand dieses Protokolls beschrieben.
2. Verwenden Sie die pFNX-HCV intragenotype 2a Virus als es enthält eine 5'-NTR-, Struktur-Regionen und P7, und ein Teil der NS2 nicht-strukturellen Regionen (Nukleotide 1-2878) des J6CF Elternstamm (NCBI Zugangsnummer. AF177036), als sowie die nicht-strukturellen Komponenten des JFH-1-Virusstamm (NCBI Zugangsnummer. AB047639). Hinweis: FNX-HCV wurde basierend auf der Sequenz von Jc1 intragenotype 2a chimären HCV synthetisiert zuvor berichtet ^15.
3. Generieren Sie eine monocistronischen chimären Reporter virales Konstrukt, das pFNX-Rluc, auf der Grundlage der pFNX-HCV-Stamm (oben in Schritt 2.2), indem Sie einen Renilla Luciferase-Gen zwischen der 5 'NTR und Core-Gen (nt zwischen 388 und 389). Anschließend verbinden Sie das Luciferase-Gen-Gen-und Kern dieses Konstrukts mit einem Maul-und Klauenseuche-Virus 2A (F2A) Peptidsequenz, die als Spaltsignal funktionieren würde.
4. Ingenieur die RNA-Polymerase-Null (Pol-) virales Konstrukt entweder mit dem pFNX-HCV oder pFNX-Rluc viralen Hintergrund. Ersetzen die katalytischen Reste NS5B Polymerase GDD (aa 2759-2761; nt 8615-8623), der eine dieser viralen Rückgrat mit AAG Aminosäureresten.

3. In-vitro-HCV-RNA-Transkription

1. Verwenden Sie ein intragenotype 2a chimären Virus FNX-HCV und HCV-FNX Pol null (Pol-) HCV für die Bewertung der viralen Replikation (Abbildung 2A).
2. Linearisieren die viralen Plasmide mit XbaI Restriktionsenzym und dann mit Mungobohnennuclease um glatte Enden zu erzeugen behandeln. Reinigung der verdauten Plasmide durch Anionenaustauschchromatographie. Überprüfen Sie die Integrität of Das linearisierte Plasmid indem DNA-Gelelektrophorese (Fig. 2B) Agarose.
3. Übertragen Sie die linearisierte Plasmide mit Hilfe der viralen T7-RNA-Polymerase.
4. Reinige den neu synthetisierten DNase behandelte RNA unter Verwendung eines RNA-Reinigungs-Kits.
5. Überprüfen Sie, ob die RNA-Produktion durch Agarose-Gelelektrophorese (Abbildung 2C).
6. Quantifizierung der RNA durch Spektrophotometrie.
7. Lagern Sie den erzeugten RNA in -80 ° C in 10 ug Arbeits Aliquots. Hinweis: Um die Veränderung der RNA-Qualität innerhalb der einzelnen Versuchsplanung zu minimieren durch Transkription aller RNA für jede Virusprobe und Kontrolle zugleich.

4. HCV-RNA-Transfektion und Probenentnahme

1. Ernten Sie die Huh-7.5.1-Zellen mit Trypsin.
2. Um Zellen, Zentrifuge spülen und resuspendieren Suspension zweimal mit kaltem niedrigen Serum-Medien. Resuspendieren der Zellen in Medien mit niedrigem Serumgehalt 1 x 10 ⁷ Zellen pro ml beträgt.
3. Mischen Sie insgesamt 10 & #956; g transkribierte Virus-RNA mit 400 ul der resuspendierten Zellen (4 × 10 ⁶ Zellen) in einer 0,4-cm-Elektroporationsküvette transferiert. Transfektion von Zellen mittels Elektroporation bei 270 V, 100 Ω und 950 uF.
4. Resuspendieren der Elektroporation Zellen in 10 ml Vollwachstumsmedium mit 15% FBS. Hinweis: Erhöhte Überlebensfähigkeit von Zellen elektroporiert wird gesehen, wenn die Huh-7.5.1-Zellen wurden in 15% fötalem Rinderserum kultiviert.
5. Platte, die Zellen in beiden T-25-Kolben (~ 1,2 × 10 ⁶ Zellen pro Kolben) und 48-Well-Platten (1 × 10 ⁴ Zellen pro Vertiefung) für jede der folgenden Zeitpunkten: 4, 48 und 96 Stunden.
6. Ersetzen Sie die Medien bei 4-8 Stunden nach der Transfektion mit frischem ergänzten Wachstumsmedium mit 10% FBS, um abgestorbene Zellreste aus den kultivierten Flaschen und Platten entfernen.
7. Erntezellkulturüberständen an den 48, 96 h Zeitpunkte und Entfernen von Zelltrümmern von gesammelten Proben durch Zentrifugation der Zellen bei 1500 UpM für 10 min bei 4 º C.
8. Bewahren Sie die zellfreien Überstände bei -80 º C. Lyse der Zellen, die für Protein-und RNA-Analyse durch Western-Blot und Reverse Transkription-PCR quantitativ zu den angegebenen Zeitpunkten.

5. Reverse Transkription-quantitative PCR (RT-qPCR) für die Beurteilung der HCV-Genom-Kopien

1. Führen eine Zwei-Schritt-RT-qPCR die genomische HCV-RNA Kopienzahl zu bestimmen.
2. Revers transkribieren 1 ug zelluläre Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase und eines Primers spezifisch für HCV-sense-Strang, der 5 'NTR (JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3') bindet, oder ein Primer, die spezifisch für Haushaltsgens Peptidylprolyl Isomerase G (R ppig : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 '). Auch Reverse Transkription FNX-HCV-RNA (in Schritt 3 erzeugte) bekannter Genomkopien ^{(10. Januar-10.} September Standard) mit HCV-Sense-Strang Primer.
3. Führen Sie qPCR unter Verwendung von 50 ng der resultierenden cDNA transkribiert mit spezifischen HCV-Primer (JFH RTQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') und DNA-Bindung grüne Farbstoff, der qPCR Super-Mix. Führen qPCR für Housekeeping-Gen sowie ppig (ppig Primer F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; ppig R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3') Anmerkung: Für die Berechnung der genauen intrazellulären HCV-RNA-Ebene über die Stichproben verwenden zellulären Housekeeping-Gen, ppig , Expressionsniveau (Ct-Zyklus) für die Normalisierung. Verwenden Sie die Kopienzahl des FNX-HCV-Genom als Standard für die Bestimmung der Kopienzahl.
4. Verwenden Sie die folgenden Bedingungen bei der Ausführung von qPCR auf HCV-RNA-Kopienzahl zu bestimmen: 95 ° C für 15 Sekunden und 60   º C für 30 Sekunden (40 Zyklen) mit Echtzeit-PCR-System.
5. Siehe Fig. 3A und 3B für die Genomreplikation Ergebnisse.

6. Western Blot-Analyse zum Nachweis von HCV-Protein-Expression (Fig. 3C)

1. Verwenden Zelllysate from Virus-RNA bei 96 Stunden nach der Transfektion für Protein-Western-Blot-Analyse transfiziert.
2. Lösen das Zelllysat unter Verwendung von SDS-PAGE und Transfer auf Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran.
3. Blockieren der Membran mit einer Blockierungslösung, enthaltend 5% Magermilch, 0,2% Tween 20 in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
4. Inkubation der Membran mit primären monoklonalen Maus-Antikörper NS3 (1 von 1.000 Verdünnung) und beta-Aktin (1 in 5000 Verdünnung).
5. Hinzufügen Ziege-anti-Maus-IgG, das mit Meerrettich-Peroxidase (1 in 5.000 verdünnt) konjugiert und durch Chemolumineszenz nachzuweisen.

7. Immunfluoreszenz-Assay (IFA)

1. Beheben die HCV-infizierten und transfizierten Zellen unter Verwendung von Methanol für 30 min bei -20 º C für Immunfluoreszenz-Assay.
2. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und Block mit IFA Blockierungspuffer.
3. Verwenden polyklonalen Kaninchen anti-NS5A in erster Linie Antikörper oder monoklonalen Maus-Anti-DSR (freundlicherweise von Dr. Dasgupta, UCLA Verfügung gestellt)NA J2 Antikörper bei einer Verdünnung von 1:200 (1 ug / ml) und Inkubation für 5 h bis über Nacht bei 4 º C.
4. Dreimal nach dem primären Antikörper Waschen der Zellen mit PBS.
5. Hinzufügen Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundär 488 polyklonalen Antikörper oder Ziege-anti-Maus-IgG-Sekundär 594 polyklonalen Antikörper in einer 1:1000 Verdünnung (1 ug / ml) und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur.
6. Waschen der Zellen mit PBS dreimal und Fleckenkerne mit Hoechst-Farbstoff und Ansicht mit Fluoreszenzmikroskop (Fig. 3D).

8. Mess Virus Titer

1. Platte naiv Huh-7.5.1-Zellen bei etwa 3 x 10 ³ Zellen / Well unter Verwendung eines 96-Well-Platte. Am nächsten Tag, führen das 10-fache serielle Verdünnungen der zellfreien Kulturüberstand von HCV-RNA-transfizierten Zellen mit Wachstumsmedium geerntet und in dreifacher Ausfertigung auf impfen Huh-7.5.1-Zellen.
2. Fix-Zellen bei 72 Stunden nach der Infektion mit Methanol (30 min bei -20
3. Verwenden Sie die höchste Verdünnung, die für die NS5A positive Foci zählen und berechnen die durchschnittliche Anzahl der Schwerpunkt Bildungseinheit (FFU) pro Milliliter. Siehe Abbildung 4 für die HCV-Titer.

9. Renilla Luciferase Reporter Assay für virale Genom-Replikation und Infektiosität

1. Für die Beurteilung viralen Genomreplikation, Platte HCV-RNA-Elektroporation Huh-7.5.1-Zellen in dreifacher Ausfertigung in 48-Well-Platten (1 x 10 ⁴ Zellen / well).
2. Lyse die Zellen mit 75 ul der passiven Lyse-Puffer an der 6 h, 48 h und 96 h nach der Transfektion.
3. Schaukeln Sie die Platten vorsichtig für 15 Minuten bei Raumtemperatur und bei -80 º C.
4. Zur Messung der Renilla-Luciferase-Enzymaktivität, die Protein-Lysat auftauen und Renilla-Luciferase-Assay-Reagenzien auf Raumtemperatur.
5. In 20 ul Proteinlysat pro Vertiefung einer 96-wel l weiße Lumineszenz Platte und legen Sie die Platte in einem Luminometer.
6. Pipettieren von 100 ul Renilla Luciferase-Assay-Reagenz (Coelenterazin Substrat + Puffer) pro Vertiefung und nach einer 2 Sek. vor, lesen Verzögerung; integrieren, das emittierte Licht für 10 Sekunden.
7. Mittelwert und Standardabweichung für jede Probe aus den Luciferase-Werte der biologischen Triplikaten und unterziehen die Daten einer statistischen Analyse (Abbildung 5).
8. Zur Beurteilung Infektiosität inokulieren 500 ul zellfreier Überstand aus HCV-RNA-transfizierten Zellen für die angegebenen Zeitpunkten (48 h und 96 h) in dreifacher Ausfertigung in 48-Well-Platten auf naiven Huh-7.5.1-Zellen erhalten.
9. Ersetzen Sie die viralen Inokulum mit 500 ml frisches Medium pro Well nach 6 Stunden nach der Infektion.
10. Lyse der Zellen bei 48 Stunden nach der Infektion und nach Renilla-Luciferase-Assay, wie in Schritten von 8,2 bis 8,7 (Fig. 5) beschrieben.

1. Die Fehlerbalken in den Diagrammen zeigen die Standardabweichungen (SD). Die P-Werte wurden mit dem ungepaarten t-Test berechnet.

Hepatitis C-Virus ist ein RNA-Virus ist. Somit zur genetischen Manipulation Zweck hat die genomische HCV-cDNA in einen bakteriellen Plasmid-Vektor kloniert. Ein T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenz wurde unmittelbar vor dem 5'-Ende des HCV-Genoms eingeführt. Eine allgemeine Übersicht der HCV-Analyse-Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt. Um genomische HCV-RNA mit präziser 3-Ende erzeugen, wird das HCV-Genom-Plasmid, das mit XbaI Restriktionsenzym und die erzeugte Einzelstrangüberhang wurde mit Mungbohnen-Nuklease Verdauung stumpf geschnitten . Die Qualität des linea HCV Plasmid wurde durch Agarose-Gelelektrophorese (Fig. 2B) beurteilt. Das HCV-DNA wurde T7-RNA-Polymerase in vitro Transkription vermittelte unterworfen und die resultierende RNA ergab ein einziges Produkt mit 9,6 Kilobasen (Fig. 2C).

Wir testeten die Wachstumskinetik eines intragenotype 2a HCV (Abbildung60, 3). Die Huh-7.5.1-Zellen wurden mit in vitro transkribierten RNA von Wildtyp (WT) und Polymerase null Viren elektroporiert. Wir untersuchten die viralen Genomreplikation Sinne von RT-qPCR. Ergebnisse zeigten, dass die WT-Virus repliziert das Genom effizient (3A und 3B). Das Wildtyp zeigte 2.59 log höhere Genomreplikation im Vergleich zu der Pol-Virus. Der WT-Virus produziert das NS3-Protein (3C), die in viralen Proteinspaltung (Protease-Aktivität) beteiligt ist, und Genom-Replikation (Helikase Aktivität). Auch die WT Virus exprimiert NS5A-Protein, wie durch Immunfluoreszenz-Test (3D) bewertet. NS5A-Protein ist Teil der HCV-RNA-Replikase-Komplex. Virale Genomreplikation zu visualisieren, prüften wir die Gegenwart von doppelsträngigen (ds) HCV-RNA unter Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch dsRNA. Während HCV-Genom-Amplifikation ist die Sense-Strang-RNA-cAntisense-Genom opied, wodurch die doppelsträngige RNA-Zwischenprodukte sind in der infizierten Zellplasmas vorhanden. Das NS5A-Protein und dsRNA Zusammenarbeit lokalisiert im Zytoplasma (3D) von WT transfizierten Zellen hindeutet, die aktive virale Replikation. Zusammengenommen ist die WT-Virus fest aktive Replikation in transfizierten Huh-7.5.1-Zellen.

Fortschritte in HCV Forschung war aufgrund des Fehlens von einem infektiösen Zellkultursystem beschränkt. Die Entdeckung JFH-1-Stamm von HCV und die anschließende Charakterisierung von chimären Laborstämme konnten wir die gesamte HCV-Replikationszyklus in der Zellkultur zu untersuchen, einschließlich Viruseintritt, RNA-Translation, RNA-Replikation und die Bildung infektiöser Virusnachkommen. Um die HCV-Titer und de novo-Infektiosität zu beurteilen, beimpft man die Zellkulturüberstände von HCV-RNA-transfizierten Zellen gewonnen. Die HCV-Infektion wurde durch Nachweis der HCV-Protein NS5A visualisiert und berechnetder virale Titer durch Auszählen der Infektionsherde (Abbildung 4). Wir als isoliert Cluster von Zellen (über 2 Zellen) positiv für NS5A als Einzel Fokus. Die Ergebnisse zeigten, dass die WT-Virus ist ansteckend und produziert über 10 4 Schwerpunkte bildenden Einheiten / ml infektiöse Partikel.

Außerdem haben wir einen Reporter HCV-Virus beherbergen, Renilla-Luciferase (Rluc) Reporter-Gen (5A). Ein Reporter HCV kann zum Testen große Anzahl von Mutanten-Viren als auch für High-Content-Screening-Assays verwendet werden. Hier präsentieren wir die Beurteilung der Wachstums Phänotypen von WT-und Pol-Reporter Viren. Wenn das virale Genom repliziert, würde die Luciferase-Aktivität nach der Transfektion Überstunden erhöhen. Die erhöhten Genomreplikation Niveaus von einer höheren Luciferase-Aktivität abgeleitet werden. Daher stellt indirekt die Luciferase-Aktivität der Messung der Höhe der Genom-Replikation. Die aus WT-oder Pol-vi geerntet Lysatenral RNA transfizierten Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten wurden für die Luciferase-Aktivitäten getestet. Bei 6 h nach der Transfektion sowohl WT-und Pol-Viren hatten ähnliche Luciferase-Aktivitäten, was auf ähnliche Eingangspegel des RNA transfiziert, die übersetzt worden waren (5B). Jedoch bei 48 h und 96 h nach der Transfektion zeigten die WT-Virus im Vergleich zu dem Pol-Virus-Genom-Replikation erhöht Ebenen. Auch die WT Virus produziert virale NS3-Protein durch Western-Blot-Analyse (Abbildung 5C) verifiziert. Anschließend testeten wir die Infektiosität von WT-und Pol-Reporter Viren durch Impfen naiven Huh-7.5.1-Zellen mit den zellfreien Überstände von 48 h und 96 h nach der transfizierten Zellkulturen gesammelt. Die Pol-Virus gehabt Basisebene Luciferase-Aktivität, während die WT-Virus hatte 2-3 Protokoll höhere Replikation der von Pol-Reporter-Virus (5D). Die Ergebnisse zeigen, dass wir eine robuste HCV Infektions Zelle kul re System.

Abbildung 1. Allgemeine Gliederung der HCV-Replikation Analyse-Workflow. Linearisierter HCV-Plasmid-Konstrukt, das T7-RNA-Polymerase-Promotor (T7P), die in-vitro-Transkription unterzogen. Das gereinigte HCV-RNA-Genom in Huh-7.5.1-Zellen elektroporiert und in Kolben und 48-Well-Platte plattiert. Bei 4 h, 48 h und 96 h nach der Transfektion werden die zelluläre RNA und Kulturüberständen aus den Kolben entnommen. Die Zellen aus 48-Well-Platte werden für die Ernte Proteinlysats verwendet und für Immunfluoreszenz-Assay festgelegt. Genom-Kopienzahl-Analyse mittels RT-qPCR, Western-Blot-und Mess virale Titer sind getan, um die HCV-Replikation zu beurteilen.

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2. Herstellung von genomischen HCV-RNA durch in vitro-Transkription von Plasmid-DNAs konstruiert. A) Genomische Organisation der J6CF/JFH-1 intragenotype 2a chimären Viren, FNX-HCV und HCV FNX-Pol null. Der Stamm J6CF Region (5'-NTR, Teil NS2) in dunkelgrau und dem JFH-1-Stamm-Bereich (Teil NS2 zu 3'NTR) dargestellt ist hellgrau angezeigt. NS5B Polymerase katalytischen Domäne Mutation (GDD zu AAG) ist mit einem Stern. B) Schritte bei der Erzeugung linearisierte Plasmid HCV beteiligt angezeigt. Gel Bild zeigt die linearisierte, stumpf ended Plasmid durch XbaI und Mungbohnen-Nuklease Verdauung produziert DNAs, bereit für in-vitro-Transkription. 0,8% Agarosegel wurde zur Lösung des DNA verwendet. C) Gel-Bild zeigt die genomische HCV-RNA durch in vitro-Transkription unter Verwendung der T7-RNA-Polymerase-System hergestellt. WT: Wildtyp; Pol-: Polymerase-null; M:Markierung.

3. Bewertung des Wachstums Phänotypen von HCV Konstrukten. A) Auswertung der Genomreplikation Kinetik der Wildtyp (WT) und Polymerase-null (Pol-) Viren. Die Genom-Kopienzahlen von sense-RNA-Strang durch RT-qPCR bewertet werden im Balkendiagramm dargestellt. Die viralen Genomkopien von Pol-Virus gesunken anzeigt replikationsdefizient Phänotyp. B über den Zeitraum) Relative Genomreplikation Niveau der Wildtyp-HCV ist, dass der Pol-Virus. C) Western-Blot-Analyse der HCV-Proteinexpression verglichen. HCV-Protein NS3 erkannt und beta-Aktin als Zellkontrolle. D) Immunfluoreszenz-Assay zur Untersuchung von Virusreplikation verwendet. Bei 96 Stunden nach der Elektroporation wurden die Zellen fixiert und imm zogenunostaining HCV-NS5A-Protein und doppelsträngiger RNA (ds RNA), einem Marker für die HCV-RNA-Replikationszwischenprodukte. Die Kerne wurden mit Hoechst-Färbung (Maßstabsbalken 50 um) visualisiert. hpt:. Stunden nach der Transfektion Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Untersuchung der Infektiosität von Wildtyp-HCV-und Mess Virustiter. A) Naive Huh-7.5.1-Zellen wurden zur Infektion Studien verwendet. Der zellfreie Überstand bei 48 und 96 h nach der Transfektion (hpt) von HCV-RNA wurden gesammelt, um das 10-fache Reihenverdünnung unterzogen und zu den Zellen in einer Platte mit 96 Vertiefungen in dreifacher Ausführung. 72 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen fixiert und für HCV NS5A Protein immun. Die Zellen mit NS5A positive Färbung (rot) sind mit einem Virus infiziert. Zur Beurteilung Foci Forming Unit (FFU) wurden die positive Foci bei der höchsten Verdünnung gezählt. Repräsentative Platten von Bildern gezeigt (Maßstab 100 um). B) Mittelwerte und Standardabweichungen von viralen Titer in FFU pro Milliliter sind in der Grafik dargestellt. Die Polymerase-Nullmutante nicht produzieren infektiöse Partikel. WT: Wildtyp; Pol-:. Polymerase null Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5. Auswertung der Genom-Replikation und Infektiosität von HCV-Reporter. A) Eine Karikatur intragenotype 2a Reporter chimären Virus wird vorgestellt. Die Renilla-Luciferase-Gen eingefügt Inframe zwischen 5 'NTR und Kern B). Die Genomreplikation Kinetik der Wildtyp-und Mutanten-Pol-Reporter Viren in den angegebenen Zeitpunkten nach der Transfektion wird in der Grafik dargestellt. Protein-Lysate wurden bei 6 h, 48 h und 96 h Zeitpunkte für die Messung Renilla Luciferase enzymatische Aktivität geerntet. Der Mittelwert und die Standardabweichung von Dreifach Renilla-Luciferase-Werte (RLV) für jedes Virus berechnet sind in dem Diagramm. C) Western-Blot-Panel zeigt die HCV-NS3-Protein-Expression dargestellt. Ein von NS3 primären Antikörper nachgewiesen unspezifische Antigen wirkt als Ladekontrolle. Wildtyp (WT)-Reporter-Virus produziert hohe NS3-Protein. D) Analyse der Infektiosität des Virus. Naive Huh-7.5.1-Zellen wurden mit dem zellfreien Überstand von transfizierten Kultur bei 48 h und 96 h Zeitpunkten erhalten geimpft. Wurden Renilla Luciferase-Aktivitäten von infizierten Zellen bei 48 Stunden nach der Infektion gemessen.Mittelwerte mit Standardabweichung werden in dem Diagramm gezeigt. Die Pol-Reporter-Virus infizierten Zellen hatten nur Hintergrundniveau der Luciferase-Aktivität, während WT-Reporter-Virus zeigte hohe Infektiosität.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.