Ein Protokoll für die Analyse von Hepatitis-C-Virus-Replikation

Summary

Hepatitis-C-Virus (HCV) ist ein wichtiger menschlicher Krankheitserreger, der Lebererkrankungen, einschließlich Leberzirrhose und Krebs, verursacht. Ein HCV-infektiöses Zellkultursystem ist essentiell, um den molekularen Mechanismus der HCV-Replikation zu verstehen und neue Therapieansätze zu entwickeln. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Untersuchung verschiedener Stadien des HCV-Replikationszyklus.

Abstract

Hepatitis-C-Virus (HCV) betrifft 3% der Weltbevölkerung und verursacht schwere Lebererkrankungen wie chronische Hepatitis, Leberzirrhose und Leberzellkarzinom. HCV ist ein umhülltes RNA-Virus aus der Familie Flaviviridae. Strombehandlung nicht wirksam ist und bewirkt, dass nachteilige Nebenwirkungen. Es gibt keine HCV-Impfstoff zur Verfügung. So wird fortgesetzt Aufwand für die Entwicklung eines Impfstoffes und eine bessere Therapie erforderlich. Einem HCV-Zellkultursystems ist kritisch für das Studium verschiedener Stadien der HCV Wachstum einschließlich Viruseintritt, Genom-Replikation, Verpackung und Austritt. In der vorgestellten aktuellen Prozedur verwendeten wir eine Wildtyp-intragenotype 2a chimären Virus, FNX-HCV, und ein rekombinantes FNX-Rluc Virus, eine Renilla-Luciferase-Reportergens um die Virusreplikation zu studieren. Eine menschliche Hepatom-Zelllinie (Huh-7-Basis) wurde für die Transfektion von in vitro transkribierten genomischen HCV-RNAs. Zellfreie Kulturüberstände, Protein-Lysate und total RNA wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Ernte Transfektion HCV Wachstum zu beurteilen. HCV-Genom-Replikation Status wurde durch quantitative RT-PCR und Visualisierung der Gegenwart von HCV-RNA-Doppelstrang ausgewertet. Die HCV-Proteinexpression wurde durch Western-Blot und Immunfluoreszenz unter Verwendung von für HCV-NS3-und NS5A-Proteine ​​Antikörper verifiziert. HCV-RNA-transfizierten Zellen freigesetzt infektiöse Partikel in Kulturüberstand und der Virustiter wurde bestimmt. Luciferase-Assays wurden verwendet, um die Replikationsebene und Infektiosität von HCV-Reporter beurteilen. Zusammenfassend stellen wir verschiedene virologische Tests zur Charakterisierung von verschiedenen Stufen des HCV-Replikationszyklus.

Introduction

Hepatitis-C-Virus (HCV) verursacht Leberzirrhose und Leberkrebs. Es betrifft 170 Millionen Menschen weltweit mit 350.000 Menschen sterben jährlich ^1-3. HCV ist ein positiver Strang-RNA-Virus mit einer Genomgröße von 9,6 kb. Das HCV-Genom als ein einzelnes Polyprotein von ca. 3000 Aminosäuren, das proteolytisch durch verschiedene zelluläre und virale Proteasen gespalten, in 10-Polypeptide translatiert wird. HCV-Virus ist der Prototyp der Gattung Hepacivirus und gehört zur Familie der Flaviviridae ^4. Bei der Belichtung stellt chronischer HCV-Infektion in 80% der Individuen. Die Infektion ist meist asymptomatisch und rechtzeitige Diagnose ....

Protocol

Ein allgemeiner Überblick über das Protokoll ist in Fig. 1 dargestellt.

1. Cells

1. Vorbereitung vollständige Wachstumsmedium, das 10-15% fötalem Rinderserum (FBS), 10 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 10 mM Hepes, Penicillin (100 Einheiten / ml), Streptomycin (100 mg / ml) und 2 mM L-Glutamin enthält.
2. Pflegen Huh-7.5.1-Zellen in ¹³ komplette Wachstumsmedium, das die oben genannten Ergänzungen für in-vitro-Analyse von Hepatitis-C-Virusreplikationszyklus.
3. Kultur Virusstämme in Huh-7.5.1-Zellen mit den angegebenen Wachstumsmedium ergänzt bei 37 ° C mit 5% CO _2.

Results

Hepatitis C-Virus ist ein RNA-Virus ist. Somit zur genetischen Manipulation Zweck hat die genomische HCV-cDNA in einen bakteriellen Plasmid-Vektor kloniert. Ein T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenz wurde unmittelbar vor dem 5'-Ende des HCV-Genoms eingeführt. Eine allgemeine Übersicht der HCV-Analyse-Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt. Um genomische HCV-RNA mit präziser 3-Ende erzeugen, wird das HCV-Genom-Plasmid, das mit XbaI Restriktionsenzym und die erzeugte Einzelstrangüberhang wurde mit M.......

Discussion

Diese Darstellung beschreibt ein Verfahren zum Analysieren des Hepatitis-C-Virus-Replikationszyklus. HCV ist ein humanes Pathogen und die vorgeschriebene Biosafety-Protokoll müssen strikt eingehalten werden. Infektiöse HCV-Zellkultursysteme wurden zuvor ^11-13,16,17 beschrieben. Es gibt nur wenige wichtige Punkte zu implementieren, wenn wir nach dem Protokoll dargestellt. Erstens, von hoher Bedeutung ist es, gute Qualität von intakten voller Länge viralen genomischen RNA für nachgeschaltete Studien. Die Eingan.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium (DMEM)	Fisher Scientific	10-017-CV
Nicht essentielle Aminosäure	Fisher Scientific	MT25025CI
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
Opti-MEM Reduziertes Serummedium, ohne Phenol Red	Life Technologies	11058-021
Huh-7.5.1	Das Scripps Research Institute		Die Zelllinie wurde freundlicherweise von Dr. Francis Chisari Dr. Arumugaswami im Rahmen einer ausgeführten MTA zwischen dem Scripps Research Institute und dem Cedars-Sinai Medical Center zur Verfügung gestellt
Plasmide (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc und pFNX-Rluc Pol null)	Cedars-Sinai Medical Center		Die HCV-Plasmide wurden von Dr. Arumugaswami unter Verwendung von überlappenden Oligonukleotiden synthetisiert.
XbaI	New England Biolabs Inc.	R0145S
Mungobohnen-Nuklease	New England Biolabs Inc.	M0250S
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
Elektroporationsküvette (4 mm)	Bioexpress	E-5010-4
Gene Pulser Xcell Total System	Bio-Rad	165-2660
monoklonaler Anti-dsRNA-Antikörper für Mäuse J2	Deutsch & Wissenschaftliche Beratung Kft.
Ziege Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11008
Ziege Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
PVDF Membran Paket	Bio-Rad	162-0263
Blotting Grade Blocker Fettfreie Trockenmilch	Bio-Rad	170-6404XTU
Tween-20	Bio-Rad	170-6531XTU
Anti-Hepatitis C Virus NS3 Antikörper [8 G-2]	Abcam	ab65407
Anti-Hepatitis C Virus NS3 Antikörper [H23]	Abcam	ab13830
Ziege Anti-Maus IgG, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (HRP)	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting-Detektionsreagenzien	GE Healthcare Life Sciences	RPN2236
SUPERSCRIPT III RT	Life Technologies	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX	Life Technologies	11744500
ViiA 7 Real-Time-PCR-System	Life Technologies	NA
Renilla Luciferase Assay System-Kit	Promega	E2810
RNase-freies DNase	Promega	M6101
GloMax-Multi-Nachweissystem (Luminometer)	Promega