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Methodenartikel

Histochemische Färbung von

42.1K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/51381

⸱

13. Mai 2014

 , 
1Feedstocks Division, Joint Bioenergy Institute, 2Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Zusammensetzung der pflanzlichen Zellwand variiert je nach Gewebetyp und kann Lignin, Zellulose, Hemicellulosen und Pektin umfassen. Es wurden verschiedene Färbetechniken entwickelt, um Unterschiede auf Zelltypebene sichtbar zu machen. Dieser Artikel ist eine Zusammenstellung häufig verwendeter Techniken zur Zellwandfärbung.

Zusammenfassung

Arabidopsis thaliana ist ein Modellorganismus, der häufig verwendet wird, um verschiedene zelluläre Prozesse in Pflanzen zu verstehen und zu manipulieren, und er wurde ausgiebig bei der Untersuchung der sekundären Zellwandbildung eingesetzt. Die Ablagerung der sekundären Zellwand erfolgt, nachdem die primäre Zellwand abgelegt wurde, ein Prozess, der ausschließlich von spezialisierten Zellen durchgeführt wird, wie z. B. solchen, die Gefäß- und Fasergewebe bilden. Die meisten sekundären Zellwände bestehen aus Cellulose (40–50 %), Hemicellulose (25–30 %) und Lignin (20–30 %). Mehrere Mutationen, die die Biosynthese der sekundären Zellwand beeinflussen, wurden isoliert, und die entsprechenden Mutanten können offensichtliche Veränderungen der biochemischen Zusammensetzung oder visuelle Phänotypen aufweisen oder auch nicht, da diese Mutationen durch kompensatorische Reaktionen maskiert werden könnten. Färbeverfahren wurden in der Vergangenheit verwendet, um Unterschiede auf zellulärer Basis aufzuzeigen. Bei diesen Methoden handelt es sich ausschließlich um visuelle Analysemittel; Nichtsdestotrotz ist ihre Rolle bei der schnellen und kritischen Analyse von großer Bedeutung. Kongorot und Calcofluorweiß sind Färbungen, die zum Nachweis von Polysacchariden verwendet werden, während Mäule und Phloroglucinol häufig zur Bestimmung von Unterschieden im Lignin verwendet werden, und Toluidinblau O zur unterschiedlichen Färbung von Polysacchariden und Lignin. Die scheinbar einfachen Techniken des Schneidens, Färbens und Darstellens können für Anfänger eine Herausforderung sein. Beginnend mit der Probenvorbereitung unter Verwendung des A. thaliana-Modells beschreibt diese Studie die Protokolle einer Vielzahl von Färbemethoden, die leicht für die Beobachtung der Zell- und Gewebeorganisation in sekundären Zellwänden von Pflanzen implementiert werden können.

Einleitung

Die Pflanzenzellwand hält eine Fülle von Informationen innerhalb seiner verschiedenen Komponenten: Lignin, Cellulose, Hemicellulose (Xylan, Glucuronoxylan, Xyloglukan, Arabinoxylans, gemischte Verknüpfung Glucan oder Glucomannan) und Pektin. Die histologische Techniken liefern wichtige visuelle Hinweise in Studium Unterschiede innerhalb der sekundären Zellwände auf organisatorischer und zellulärer Ebene. Verschiedene histologische Techniken wurden entwickelt und kann in der Literatur gefunden werden, aber diese Techniken kann schwierig und zeitaufwendig für Anfänger sein, weil sehr ausführliche Protokolle mit einfachen visuellen Anweisungen sind selten, wenn überhaupt vorhanden. Das Ziel dieser Studie ist es, einfache Richtlinien zur histologischen Färbung Techniken bieten, um qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten.

Unterteilen des Schaftgewebe ist der erste Schritt bei der Visualisierung von Zellwänden und Zellformen. Obwohl von Hand geschnitten Abschnitte sind kostengünstig und weniger Zeit für die Vorbereitung, die Verwendung eines Vibratom bietet Kontinuität undliefert qualitativ hochwertige Bilder. Mit einem Vibratom ermöglicht die Herstellung besserer Datenqualität durch die Erzeugung auch Abschnitte mit der gleichen Stärke, die hilft, scharfe Bilder und reduziert das Risiko der Herstellung ungenau Unterschiede zwischen den Proben, die einfach von einer schlechten Probenvorbereitung verursacht werden würde. Mit Harze an die frische Proben zu beheben, kann eine Herausforderung für Anfänger und kann immer noch zeitaufwändig sein, selbst für Experten, wenn eine Analyse muss schnell durchgeführt werden. Darüber hinaus wird es unmöglich, irgendeine biologische Aktivität der Probe zu messen, wenn es in ein Harz eingebettet sind. Eine einfache Technik, die Agarose und eine hausgemachte Form beschäftigt ist hilfreich für die Einbettung von Stammzellen Gewebe, und es kann auch in anderen Anwendungen Dissektion der Weichteile erfordern, genutzt werden. Im Vergleich zu Proben in Harz eingebettet, hat dieses Verfahren den Vorteil, dass das Gewebe gesund und reduzierendem Probenmanipulation. Schneiden Gewebe über einen Vibratoms ist sehr präzise und homogen erzeugtschiedenen Abschnitten, die je nach dem Ziel der Studie kann dann mit verschiedenen Färbetechniken verwendet werden.

Die einfachsten Methoden, um Lignin und andere Aromaten visualisieren beschäftigen ultraviolettem (UV) Licht. Anregung der aromatischen Moleküle auf durch UV-Licht ist eine alte Technik, aber es ist immer noch eine der schnellsten Ansätze zur Visualisierung von Lignin. Doch tatsächlich ist die UV-Visualisierung nicht ideal für die Erkennung Lignin, weil UV-Licht werden andere Aromaten zu erregen. 1-3: Lignin besteht hauptsächlich aus drei Bausteinen, die Monolignole (Coniferylalkohol, Sinapylalkohol und p-Cumarylalkohol hydroxycinnamyl Alkohole) gemacht. Phloroglucin Flecken können Hinweise auf den Umfang der in das Xylem, Fasern und Luftröhrengewebe 4 vorhanden Zimtaldehyde bereitzustellen. Phloroglucinol ist ein guter Indikator für die allgemeine Zimtaldehyde und kann zwischen Zimtaldehyde und anderen Aromaten unterscheiden. Die Sinapylalkohol Monomere nachgewiesen werden kannund differenziert durch die Verwendung Maule Fleck. Toluidinblau O eine polychromatische Farbstoff und hat die Fähigkeit, verschiedene Elemente der Zellwand in verschiedenen Farben färben daher 5,6. Der primäre Einsatz von Toluidinblau O ist es, Pektin und Lignin 5,6 zu erkennen. Der Vorteil der Verwendung von Toluidinblau O ist, dass viele Elemente der Zellwand kann in einem einzigen Schritt dargestellt werden. Sowohl Calcofluor weiß und Kongorot sind leicht zu verarbeiten und kann verwendet werden, um Zellulose zu visualisieren. Calcofluor weißen Flecken Cellulose, Callose und andere nicht-substituierten oder schwach substituierten β-Glucane 6-9, während Kongorot Flecken direkt an β-(1 → 4)-Glucane und insbesondere zu Cellulose 10,11. Das Ziel dieser Studie ist es, einfache Richtlinien für die Verwendung der oben genannten Färbetechniken, um qualitativ hochwertige Bilder von A zu erhalten bieten thaliana stammt.

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Protokoll

1. Stem Einbetten

  1. Machen Sie einen 7% igen Lösung in Wasser (7 g Elektrophorese-Grade Agarose in 100 ml destilliertem Wasser). Ige Agarose durch Autoklavieren für 20 min oder durch Mikrowellenbehandlung für 20 min bei geringsten Intensität (z. B. 10% Intensität eines 1250 Watt Mikrowelle).
  2. Bereiten Sie eine hausgemachte Form für die Einbettung der Stiele mit Kunststofffläschchen.
    1. Mit einer Rasierklinge, schneiden Sie die konischen Boden einer 2 ml mit Schraubverschluss-Mikrozentrifugenröhrchen (Teil A). Mit einer Spritzennadel, durchstoßen eine Bohrung in der Rohrkappe geringfügig größer als der Durchmesser des Schaftes eingebettet werden. Als nächstes schneiden 0,5 cm aus dem Boden eines 0,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen (Teil B).
    2. Hinzufügen des abgeschnittenen 0,5 cm Abschnitt der 0,6 ml-Mikrozentrifugenröhrchen in die vorgeschnittenen 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verschließen Sie die beiden Teile mit Parafilm (Abbildung 1). HINWEIS: Der Boden der Röhre geschnitten wird, um die Entfernung der eingebetteten Probe zu erleichtern, nachdem die Agarose erstarrt. Ter Loch in der Kappe wird das Halten der Stamm stabil, wenn der Schaft in Agarose eingebettet unterstützen. Die Form wird dazu dienen, die Agarose halten und halten den Stamm gerade bei der Einbettung. Der Parafilm werden die beiden Teile A und B zu halten, bis die Agarose eingestellt ist und der Schaft eingebettet ist.
    3. Mit einer Rasierklinge, schneiden Sie ein Stammabschnitt aus dem Bereich der Zinsen, (zB Mitte der ersten Stamm Internodium). HINWEIS: Im Idealfall sollte der Stamm kurz vor der Zerstörung durch die Einbettung Austrocknung zu vermeiden geschnitten werden. Alternativ kann der Stiel vorübergehend in einer Platte, die ein Filterpapier mit Wasser benetzt gespeichert werden. Diese Platte kann auf Eis, bis bereit, um eingebettete Gewebe Austrocknung und Verformung zu verhindern platziert werden. Speichern Sie den Vorbau für Zeiträume von mehr als 30 Minuten ohne hohe Feuchtigkeit bewirkt, dass die Stammzellen zu trocknen.
  3. Schmelzen Sie die Agarose in der Mikrowelle bei niedriger Intensität. ACHTUNG: Die Flasche, die Agarose kann heiß sein. Verwenden Sie einen Handschuh zu holen die Flasche. Lassen Sie die geschmolzene Agarose stand bei Raumtemperatur (zwischen 20 ° C und 25 ° C) bis auf ca. 50 ° C abkühlt
  4. Langsam Pipette 5 ml der Agarose in die vorgefertigten Kunststoffform, um das Fläschchen zu füllen. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in den Formen. Luftblasen werden Lücken in der Agarose-Form führen und wird nicht vollständig den Stamm Probe, die schließlich zu einer ungleichmäßigen Schneiden der Probenabschnitte führen zu decken.
    1. Lassen Sie die Agarose abkühlen für 30 bis 60 Sekunden halbfester zu werden. Testen Sie mit einem kleinen Zahnstocher, um sicherzustellen, dass es zu durchdringen und aufstehen, aber nicht schwimmen, in der Agarose kann. HINWEIS: Wenn der Schaft platziert, wenn die Agarose noch heiß es wird die Probe durch schrumpf den Schaft beschädigen, zerstören die Zellmorphologie.
    2. Setzen Sie den Stiel in diesem Agarose-Fläschchen gefüllt. Stellen Sie sicher, dass der Schaft bleibt gerade. Platzieren Sie die perforierte Kappe derart, daß die Spitze des Schafts von der Kappe gehalten wird. Schalten Sie den Schraubverschluss. Irgendwann mehr als einen Stamm (von einer einzigen Art) können embe seinin einer einzigen Ampulle dded; aber in diesem speziellen Fall, verwenden Sie nicht die Kappe. HINWEIS: Wenn die Schraubkappe eingeschaltet ist, wird der Stamm verdrillt.
  5. Belasse das Röhrchen bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C für 10-30 min, bis es erstarrt.
  6. Entfernen Sie die Form durch vorsichtiges Schieben Sie es aus der Röhre. Öffnen Sie die Parafilm. Drücken Sie den unteren Teil B der Form vorsichtig mit dem Daumen auf die erstarrte Agarose aus Teil A auf einen Glasobjektträger zu lösen.
  7. Schneiden der Agarose eingebettete Stiel in drei etwa gleich große Stücke von 1,2 cm Länge. Schneiden Sie den Teil des Stammes, das war nicht in der Agarose und entsorgen.
    1. Bewahren Sie diese Stücke von Agarose mit der eingebetteten Stiele in luftdichten 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen in einer dunklen Box bei 4 ° C bis zu seiner Seite. Alternativ speichern die Röhrchen bei 4 ° C für maximal eine Woche. HINWEIS: Lagerung möglich ist, sondern der Versuchs muss sich bewusst sein, dass das eingebettete stammt noch am Leben und in Abhängigkeit des ExperimentsKönnte möglicherweise Artefakte eingeführt werden.

2. Stem Schnitte

  1. VORSICHT: Lesen Sie die Bedienungsanleitung sorgfältig Vibratoms und befolgen Sie alle Sicherheitshinweise.
  2. Stellen Sie sicher, dass die Objektplatte ist sauber und vollständig trocken (frei von festen oder flüssigen). Reinigen Sie die Probenscheibe mit einer Rasierklinge, um restliche Klebstoff von vor Experimenten zu entfernen und mit Wasser waschen. Dann trocknen Sie mit einem Papiertuch. HINWEIS: Dadurch wird sichergestellt, dass der Klebstoff funktioniert gut und bindet an die Agarose-Probe. Wenn dieser Schritt nicht richtig gemacht, ist es möglich, dass die Probe nicht an der Scheibe haften und wird später führen, dass die Probe von der Scheibe beim Schneiden fällt.
    1. Weichen Papiertücher verwenden, um die Feuchtigkeit aus dem Agarose-Block, der die Proben zu entfernen.
    2. Setzen Sie einen kleinen Tropfen Gewebekleber auf dem Probenteller. Streak aus dem Klebstoff auf den Bereich in der Mitte der Platte mit der Spitze der Klebeflasche zu decken. Schnell Ortdie Agarose-Block, so daß die Proben entweder senkrecht oder parallel zu der Platte für Quer-oder Längsquerschnitt auf. Den Kleber, um die Probe auf die Probenscheibe bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C für 10-30 min zu fixieren. HINWEIS: Dies ist eine zeitkritische Schritt.
  3. Befestigen Sie die Objektplatte an Ort und Stelle auf der Pufferwanne oder Trog. Die Block / s aus Agarose mit den Abschnitten sollten parallel mit der Rasierklinge sein. Füllen der Pufferschacht mit destilliertem Wasser bei Raumtemperatur, bis die Proben vollständig eingetaucht.
  4. Schneiden Sie eine Rasierklinge in der Mitte und dann schneiden Sie die Enden mit einer stabilen Schere, so dass die Klinge bleibt völlig flach. Befestigen Sie die Hälfte der vorgeschnittenen Rasierklinge auf den Messerhalter.
    1. Den Winkel am Messerhalter um 84 °, wird die Geschwindigkeit auf 0,90 mm / sec (Position 8 auf der Vibratom) und die Frequenz auf 50 Hz (Position 5 auf der Vibratom). Schneiden Abschnitte von 100 um Dicke. Verwenden kontinuierlichen Modus. NOTE: Diese Dicke wurde gewählt, um zu gewährleisten, dass das Gewebe der verschiedenen Säure-und Basenbehandlung in einigen der Färbungsprotokolle verwendet zu widerstehen. Stellen Sie die Fenster zum Schneiden und lassen 15-20 min auf einer kontinuierlichen Modus für die Vibratom Abschnitt ein Agarose-Block von ca. 1,2 cm.
  5. Sammeln Sie die Abschnitte mit einem Einweg-Plastikpipette beim Schneiden in der Pufferwanne. Alternativ können die Abschnitte aus der Pufferwanne in ein Becherglas zu einem klaren Petrischale überführt werden und dann. Übertragen paar Abschnitte zu den 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Die Proben werden von einer Petrischale gesammelt, da es einfacher ist, die Abschnitte auf einem klaren Hintergrund zu sehen, und da der Puffer Fach kann für die nächsten Probe grundiert werden.
  6. Die Abschnitte können in einem 50-ml-Röhrchen bei 4 ° C für 30 bis 60 min, gespeichert oder gesammelt und in 1,5 bis 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen gelagert. HINWEIS: Speichern Sie die Abschnitte für einen längeren Zeitraum in einer schlechten Bildqualität führen.

3. Mikroskop und Kamera-Einstellung für Imaging

  1. Stellen Sie die Köhler-Beleuchtung am Mikroskop. Wählen Sie ein Ziel. Konzentrieren Sie sich auf die Probe zuerst. Bringen Sie die Lichtintensität auf die Hälfte oder weniger. Schließen Sie die Feldblende (FD) und Blende (AP) oder bringen Sie es auf die niedrigste mögliche Einstellung an diesem Ziel.
    1. Je höher die Vergrößerung, desto größer wird der Ring sein. Verwenden Sie den Kondensator mit Schwerpunkt Knopf, um die Feldblende so scharf wie möglich zu konzentrieren.
    2. Langsam bringen das Bild der Feldblende (sechseckigen kleinen Ring) in der Mitte mit den Kondensator-Zentrierung Knöpfe (stiftförmigen Schrauben rund um den Kondensator). Steigern Sie langsam die Membran (FD), so dass die Feldblende den Rand erreicht. Stoppen Sie die Erhöhung der FD nur, nachdem das Feld Iris hat den Rand geleitet.
    3. Erhöhen Sie langsam die Öffnung (AP), um den Kontrast einzustellen. Passen Sie die Lichtintensität je nach Bedarf. HINWEIS: Köhler-Beleuchtung muss für jeden o eingestellt werdenIEL, jeder experimentellen Tag. Beachten Sie die nach der Einstellung für den Tag erhaltenen Zahlen. Diese Zahlen werden jedes Mal, dass Ziele hin und her für diesen besonderen Tag eingeschaltet wiederverwendet werden.
  2. Stellen Sie die Blende, Intensität, Belichtungszeit, Gain und Filter, wie in Tabelle 1 beschrieben. Diese Informationen sollten nur als Richtlinie verwendet werden.
  3. Verwenden Sie eine hochauflösende Digitalkamera mit einem Großformat-Interline-CCD-Chip ohne mechanischen Verschluss, um die Fluoreszenz Bilder zu erfassen; und eine hohe Auflösung, High-Speed-Kamera für Hellfeld-Bilder.
  4. Verarbeiten Sie die Folien mit Standardsoftware. Laden Sie die Software. Klicken Sie auf "Acquire" und "Set Kamera / Board", wählen Sie dann die Kamera verwendet werden. Klicken Sie auf "OK". Klicken Sie auf "Erfassen", gefolgt von "Registerkarte Farbe." Unter "Registerkarte Farbe", wählen Sie "Bayer-Verfahren", gefolgt von "Durchschnitts vier." In den vorgeschlagenen Verstärkung (rot, grün, blau) herTabelle 1 m. Wählen Sie das Register "Einstellung speichern" und klicken Sie auf das Verzeichnis, in dem die Bilder gespeichert werden sollen. Stellen Sie "Belichtungszeit" von den Anregungen in Tabelle 1. Set "Binning" auf "1" und "Live-Binning" auf "1". Fokus auf die Region von Interesse und klicken Sie dann auf "Speichern zu Hause sind."
  5. Ausgabe von Bildern auf der Kamera-Software sind in der "TIF"-Format. Analysieren der Bilder für Histochemie der Zelltypen. Verwenden Sie Standard-Computer-Software für nachgelagerte Anwendungen von Präsentation und Veröffentlichung.

4. Ultraviolett-und Hellfeld-Imaging

  1. Verwenden Sie eine 1 ml-Pipette mit der Pipettenspitze geschnitten, so dass die Abschnitte können leicht pipettiert werden. Pipette vorsichtig Abschnitte in der Spitze und auf einem Objektträger. Decken Sie die Schnitte mit einem Deckglas. Beachten Sie die Abschnitte unter UV-Licht oder Hellfeldbeleuchtung.

5. Phloroglucinol-HCl (Wiesner) Färbung 12

  1. Lösen Sie 0,3 g Phloroglucin in 10 ml absolutem Ethanol, eine 3% Phloroglucin-Lösung herzustellen. Man mischt ein Volumen von konzentrierter HCl (37 N), um zwei Bände von 3% Phloroglucin in Ethanol; Diese Lösung ist Phloroglucin-HCl (pH-HCl) oder Wiesner Fleck. HINWEIS: Diese Lösung ist an die frische ist für den Tag der Färbung und kann nicht gespeichert werden, da die Lösung im Laufe der Zeit zersetzen und die Färbung wird unwirksam. ACHTUNG: HCl ist stark ätzend, also mit äußerster Vorsicht beim Umgang mit dem Ph-HCl Fleck.
  2. Bringen Stielabschnitte zu einem 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 1 ml des pH-HCl-Lösung zu der Röhre mit den Abschnitten und die Kappe sofort, weil die HCl in dem pH-HCl-Beize ist stark ätzend. Bewegen Sie vorsichtig das Rohr, um sicherzustellen, dass alle Abschnitte werden gefärbt. Eine Alternative zu diesem Schritt ist, den Tubenkappe offen halten, so daß der pH-HCl-Lösung auf und ab pipettiert werden, vorzugsweise ohne die störende sectionen. HINWEIS: Achten Sie darauf, um die Abschnitte in die Pipettenspitze pipettiert werden, da dies die Abschnitte beschädigen.
    1. Verwenden einer 1 ml-Pipette mit der Pipettenspitze geschnitten derart, dass die Abschnitte kann leicht pipettiert werden ohne Beschädigung. Vorsichtig pipettiert Abschnitte in der Spitze und auf einen Objektträger. Decken Sie die Schnitte mit Deckglas. Beachten Sie die Abschnitte unter Hellfeldbeleuchtung. HINWEIS: Der Ph-HCl-Lösung trocknet in 5-10 min, was eine Verschlechterung der Proben. Daher weist das Abbildungs ​​innerhalb dieser Zeit abgeschlossen werden.

6. Mäule Färbung 13,14

  1. Man löst 0,2 g Kaliumpermanganat in 40 ml destilliertem Wasser zu einer 0,5% Kaliumpermanganat-Lösung herzustellen. Speichern in einer dunklen Flasche bei Raumtemperatur für maximal 7 Tage.
    1. Bereiten Sie eine 3,7% HCl-Lösung durch Zugabe von 1 ml konzentrierter HCl (37 N) zu 9 ml destilliertem Wasser (1:10). Eine frische 3,7% HCl-Lösung auf dieTag des Experiments. Stellen Sie sicher, dass die 37 N HCl-Stammlösung verwendet wird, ist nicht zu alt. Konzentriertes Ammoniumhydroxid-Lösung (14,8 M) bei 4 ° C gelagert werden, um die Molarität der gesättigten Lösung abnimmt verhindern.
  2. Bringen Stielabschnitte zu einem 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 1 ml der 0,5% igen Kaliumpermanganatlösung mit dem Rohr, das die Abschnitte.
    1. Pipettieren Sie die 0,5% Kaliumpermanganat-Lösung oben und unten vorsichtig, vorzugsweise ohne die Abschnitte zu stören. Inkubation für 2 Minuten und wiederholen Sie das Pipettieren. Lassen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen stehen, bis alle Abschnitte niederzulassen. HINWEIS: Achten Sie darauf, um die Abschnitte in die Pipettenspitze pipettiert werden, da die Abschnitte können beschädigt werden. Es kann schwer sein, die Stielabschnitte zu sehen, wie die Lösung ist dunkel, so halten die Röhre mit den Abschnitten über Reagenzglasständer und es ihnen ermöglichen, für 2 min absetzen.
    2. Mit einer 1 ml Pipette, ziehen 700 ul 0,5% Kaliumpermanganat-Lösung.In 700 ul destilliertem Wasser zum Ausspülen des Kaliumpermanganat-Lösung. Wiederholen Sie die 3-4x oder bis das Wasser klar bleibt Lösung.
    3. Entsorgen Sie das Wasser. Schnelles Hinzufügen von 1 ml 3% HCl, bis die dunkelbraune Farbe wird aus den Abschnitten ausgetragen. Dies kann in ca. 3-5 min passieren oder 2 Wäschen von jeweils 5 min benötigen. Pipettieren Sie sich die 3% HCl-Lösung und sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.
    4. 1 ml konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung. Verwenden einer 1 ml-Pipette mit der Spitze geschnitten derart, dass die Abschnitte kann leicht pipettiert werden ohne Beschädigung. Vorsichtig pipettiert Abschnitte in der Spitze und auf einen Objektträger. Decken Sie die Schnitte mit einem Deckglas. Beachten Sie die Abschnitte unter Hellfeldbeleuchtung. ACHTUNG: Wegen Ammoniak ist stark ätzend, extra Pflege und Aufmerksamkeit erfordert es zu vermeiden, dass Korrosion auf die Bühne des Mikroskops oder Objektiv. HINWEIS: Die Ammoniumhydroxid Dämpfe können das Deckglas beschlagen, so dass es schwierig ist, die Probe zu beobachten. Daher besonders vorsichtig sein, bevor das Deckglas. Die Lösung trocknet in 5-10 min, so dass innerhalb dieser Zeit abgeschlossen werden die Abbildungs ​​hat.

7. Kongorotfärbung 11,15

  1. Lösen Sie 0,5 g Kongorot in 100 ml destilliertem Wasser zu einer 0,5% Kongorot Lösung herzustellen.
  2. Bringen Stielabschnitte zu einem 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 1 ml der 0,5% Kongorot-Lösung zu der Röhre. Pipette vorsichtig die 0,5% Kongorot-Lösung auf und ab, ohne die Abschnitte zu stören. HINWEIS: Achten Sie darauf, um die Abschnitte in die Pipettenspitze, da dies die Abschnitte beschädigen pipettieren.
    1. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min und wiederholen den Pipettieren. Folgen mit einem anderen 3-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur.
    2. Verwenden Sie eine 1 ml-Pipette zu ziehen 700 ul 0,5% Kongorot Lösung. In 700 ul destilliertem Wasser zum Ausspülen des Kongorot-Lösung. Wiederholen Sie den Wasch 3-4x, bis die Waschlösungist klar.
    3. Verwenden einer 1 ml-Pipette mit der Spitze geschnitten derart, dass die Abschnitte kann leicht pipettiert werden ohne Beschädigung. Vorsichtig pipettieren Abschnitte in die Spitze und auf einen Objektträger, und sie mit Deckglas. Beachten Sie die Proben auf dem Objektträger unter Blaulicht-Anregung mit einem Filter mit einem Bandpass von 560/40 liegt. HINWEIS: die Abschnitte in Wasser für die lange vor der mikroskopischen Analyse nicht lagern, da das Wasser wird in 10-30 min auswaschen Kongorot.

8. Calcofluor Weiß-Färbung 9

  1. Lösen 0,02 g Aufheller 28 (Calcofluor weiß M2R) in 10 ml destilliertem Wasser, um eine 0,2% ige Stammlösung herzustellen. Die 0,2% ige Lösung kann für sechs Monate in einer dunklen Flasche bei 4 ° C gelagert werden Bereiten Sie eine Arbeitslösung von 0,02% durch Verdünnen der Stammlösung 0,2% 10x mit destilliertem Wasser.
  2. Bringen Stielabschnitte zu einem 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen. In den Rohr 1 ml der 0,02% calcofluor weiße Lösung. Pipette vorsichtig die 0,02% Calcofluor weiße Lösung auf und ab. HINWEIS: Achten Sie darauf, um die Abschnitte in die Pipettenspitze, da dies die Abschnitte beschädigen pipettieren.
    1. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min und wiederholen den Pipettieren. Inkubieren der Abschnitt für weitere 3 min bei Raumtemperatur. HINWEIS: Lassen Sie die Abschnitte auf den Boden des Röhrchens absetzen, um es einfacher zu pipettieren, die Lösung ohne die Abschnitte.
    2. Verwenden Sie eine 1 ml-Pipette zu ziehen 700 ul von 0,02% Calcofluor weiße Lösung und fügen Sie 700 ul destilliertem Wasser; 5 Minuten warten zum Ausspülen des Calcofluor weiße Lösung. Wiederholen Sie den Wasch 3-4x. Verwenden Sie eine 1 ml-Pipette mit der Pipettenspitze Schnitt in so konzipiert, dass die Abschnitte können leicht pipettiert werden ohne Schaden.
    3. Vorsichtig pipettieren Abschnitte in die Spitze und auf einen Objektträger und bedecken sie mit einem Deckglas. Beachten Sie die Abschnitte unter UV-Licht.

9. Toluidine BluE O Färbung 16,17

  1. Lösen 0,02 g Toluidinblau O in 100 ml destilliertem Wasser zu einer 0,02%-Lösung herzustellen. HINWEIS: Die Toluidinblau O Lösung für zwei Wochen in einer dunklen Flasche bei Raumtemperatur gelagert werden.
  2. Bringen Stielabschnitte zu einem 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 1 ml der 0,02% Toluidinblau-O-Lösung zu der Röhre. Pipette vorsichtig die 0,02% Toluidinblau O-Lösung auf und ab. Dann Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min und wiederholen Sie das Pipettieren einmal. HINWEIS: Achten Sie darauf, um die Abschnitte in die Pipettenspitze, da dies die Abschnitte beschädigen pipettieren. Lassen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen stehen still, bis die Abschnitte niederzulassen. Das kann hart sein, um zu sehen, wie die Lösung ist dunkel, so halten die Röhre, die die Abschnitte über Reagenzglasständer und es ihnen ermöglichen, für 2 min bei Raumtemperatur zu regeln.
    1. Verwenden Sie eine 1 ml-Pipette zu ziehen 700 ul von 0,02% Toluidinblau O-Lösung. In 700 ul destilliertem Wasser zum Ausspülen des Toluidinblau O Solution. Wiederholen Sie die 3-4x oder bis der Waschlösung ist klar. Verwenden einer 1 ml-Pipette mit der Pipettenspitze geschnitten derart, dass die Abschnitte kann leicht pipettiert werden, ohne sie zu beschädigen.
    2. Vorsichtig pipettieren Abschnitte in die Spitze und auf einen Objektträger und bedecken sie mit einem Deckglas. Beachten Sie die Abschnitte unter Hellfeldbeleuchtung.

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Ergebnisse

Stem Einbetten und Schneiden:
Die Verwendung des hausgemachten Kunststoffform, um die Stiele einbetten in 7% Agarose erwies sich schnell und einfach (Abbildung 1). Die beiden Teile (A und B; Abbildung 1) des eingebetteten Ampullensystem machen es einfach, die einfache Wiedergabe der Stammzellen in Agarose eingebettet, wie die Agarose nicht den Fläschchen Teile, die inert sind, bleiben, damit das System sauber. Die Fläschchen können mehrmals über Jahre wiederverwendet werden. Die ...

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Diskussion

A. thaliana Stammabschnitte werden häufig verwendet, um die Organisation der Zellen in der sekundären Zellwand zu untersuchen und qualitativ untersuchen die Unterschiede zwischen Wildtyp und transgenen Pflanzen. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Schneiden der Proben sind direkte schneidend; oder, wenn Proben in Agarose-oder Fixiermittel eingebettet ist, kann mit einem Schnitt Vibratom oder Mikrotom durchgeführt werden. Im Gegensatz zu schneidend, die letzten beiden ermöglichen die Verringerung des Ris...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine finanziellen Konflikte offenzulegen.

Danksagungen

Wir sind dankbar für die Bearbeitung von Sabin Russell Unterstützung. Diese Arbeit war Teil des DOE Joint BioEnergy Institute (http://www.jbei.org) durch das US Department of Energy, Office of Science, Office of Biological-und Umweltforschung, unterstützt durch Vertrag DE-AC02-05CH11231 zwischen Lawrence Berkeley National Laboratory und das US Department of Energy.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AgaroseEMDMERC2125CAS-Nummer: 9012-36-6
PhloroglucinolSigmaP 35021,3,5-trihydroxybenzol [CAS-Nummer: 108-73-6]
SalzsäureEMDHX0603-75CAS-Nummer: 7647-01-0
AmmoniumhydroxidEMDAX1303-6CAS-Nummer: 1336-21-6
Toulidinblau OSigmaT3260Blutenchlorid, Toloniumchlorid [CAS-Nummer 92-31-9] 
KaliumpermanganatSigma223468CAS-Nummer 7722-64-7 
Ethanol 190 proofKOPTECV1401CAS-Nummer: 64-17-5
Congo RedSigma C6277Dinatrium-3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalin-1-sulfonat) [CAS-Nummer 573-58-0]
Fluoreszierender Aufheller 28/ Calcofluor WhiteStain SigmaF3543 4,4'-Bis[[4-[Bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilben-2,2'-disulfonsäure [CAS-Nummer 4404-43-7] 
VibratomeLeicaLeica Mikrotom mit vibrierender Klinge VT1000Shttp://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
RazorAmerican Safety Razor CompanyArtikel # 60-0139-0000 Doppelschneidige Klinge aus Edelstahl (Personna Super)
Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss (2 ml)VWR16466-044
Mikrozentrifugenröhrchen (0,6 ml)Axygen ScientificMCT-060-C
HandschuhBel-Art380000000SCIENCEWARE  Hot Hand Protector Mitt
Tissue AdhesiveTed Pella Inc10033Bei 4 & deg; C oder 20 &Grad; C für 3 Monate oder länger Lagerung
MikrowellePanasonicNN-SD762SPELCO Pro CA 44 Sofort-Tissue-Klebstoff
Kamera mit CCD-Chip ohne mechanischen VerschlussHamamatsuC4742-95
Hochgeschwindigkeits-Farbkamera     QImagingMicroPublisher 5.0 RTV-Kamera-Software
   Molecular DevicesMetaMorph Version 7.7.0.0
Imagining anaylsis Adobe Photoshop CS4
Micro Cover Brille, quadratisch, Nr. 1VWR48366-06722 x 22 mm (7/8 x 7/8") - Deckgläser sind korrosionsbeständig und gleichmäßig dick und flach. Die Dicke Nr. 1 beträgt 0,13 bis 0,17 mm.
Frosted Micro Slides, 1 mmVWR48312-00375 x 25 mm - 1 mm
Parafilm MAlcan VerpackungBRNDPM998
TX2 Filter WürfelLeica11513851/11513885Filter für die Kongorot-Analyse mit einem Bandpass von 560/40.

Referenzen

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