Imaging Geräumte Intact Biological Systems auf zellulärer Ebene durch 3DISCO

Zusammenfassung

Um hochauflösende Bilder von fluoreszenzmarkierten Zellen in großen Geweben zu erhalten, sollten idealerweise die biologischen Proben ohne Schnitte abgebildet werden. 3DISCO ist ein unkompliziertes Gewebereinigungsverfahren, das auf sequentieller Inkubation mit organischen Lösungsmitteln basiert. Nach der Freigabe werden die Organe transparent, was einen End-to-End-Laserscan der Probe ermöglicht.

Zusammenfassung

Die Gewebereinigung und anschließende Bildgebung von transparenten Organen ist eine leistungsfähige Methode, um fluoreszenzmarkierte Zellen und Moleküle in 3D, in intakten Organen, zu analysieren. Im Gegensatz zu herkömmlichen histologischen Methoden, bei denen das interessierende Gewebe für die Fluoreszenzbildgebung geschnitten wird, ermöglicht die 3D-Bildgebung von geklärtem Gewebe die Untersuchung von markierten Zellen und Molekülen in der gesamten Probe. Zu diesem Zweck sollten optisch undurchsichtige Gewebe transparent gemacht werden, indem die refraktären Indizes im gesamten Gewebe aufeinander abgestimmt werden. Anschließend kann das Gewebe sofort mit Laser-Scanning-Mikroskopen abgebildet werden, um ein vollständiges hochauflösendes 3D-Bild der Probe zu erhalten. Eine wachsende Liste von Gewebe-Clearing-Protokollen, darunter 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2 und SeeDB, bietet Forschern neue Möglichkeiten, ihr interessierendes Gewebe als Ganzes abzubilden. Unter ihnen ist 3DISCO eine hochgradig reproduzierbare und unkomplizierte Methode, die verschiedene Arten von Geweben reinigen und mit verschiedenen Mikroskopietechniken verwendet werden kann. Dieses Protokoll beschreibt dieses einfache Verfahren und stellt seine verschiedenen Anwendungen vor. Es werden auch die Grenzen und möglichen Schwierigkeiten diskutiert und wie diese überwunden werden können.

Einleitung

Die histologische Untersuchung von biologischen Geweben ist ein grundlegender Ansatz für das Verständnis der Natur der Moleküle / Zellen in ihrem natürlichen Kontext. Idealerweise ist hochauflösende Bildgebung des gesamten Organs informativsten und erwünscht. Denn Licht hat eine begrenzte Eindringtiefe, durch Streuung ^ein, haben feste Organe, um hochauflösende mikroskopische Bildgebung durchführen geschnitten werden. Daher sind die meisten der histologischen Untersuchungen werden auf einigen Gewebeschnitten, die nur einen kleinen Teil des Organs erfolgt. In einigen Studien, zB solche, die mit dem Ziel zu verfolgen, aus neuronalen Verbindungen im Gehirn oder Rückenmark, alle Gewebeschnitte von den Zielorganen werden gesammelt und für eine 3D-Rekonstruktion abgebildet. , Gewebe-Schnitte und die anschließende Abbildung der einzelnen Abschnitte hat jedoch verschiedene Einschränkungen. Dazu gehören als zeitaufwendig und führt zu einer unvollständigen 3D-Rekonstruktion des Gewebes aufgrund mechanischer Verformungen und schwierign in der Ausrichtung der resultierenden Bilder.

Vor kurzem hat Clearing-und Imaging intakte Organe transparent als eine bedeutende Lösung für dieses Manko ^2,3 entwickelt. Beim Clearing wird das gesamte Organ transparent gemacht so dass die Abbildungslicht zu reisen Ende-zu-Ende (Abbildung 1), um hochauflösende Bilder der ungeschnittenen Orgel mit einem Laser-Scanning-Mikroskop wie ein Multi Photonen oder Lichtblatt-Mikroskop erzeugen ( Abbildung 2). Verschiedene Forschungsgruppen haben neue Gewebe Clearing-Protokolle entwickelt, um der Lage sein, ihre Bild Gewebe von Interesse für verschiedene Zwecke. Dazu zählen organische Lösungsmittel ^2-5, Wasser ^6,7 und Elektrophorese ⁸ Clearing-Protokolle. Unter diesen 3-dimensionalen Bildgebung von Organen oder Lösungsmittel gelöscht 3DISCO eine leicht anwendbare Protokoll auf einer Vielzahl von biologischen Proben, einschließlich des zentralen Nervensystems (ZNS) Organe Immunorganen und soliden Tumoren. In zusätzlichIonen, kann es mit verschiedenen Mikroskopietechniken wie leichtes Blatt Fluoreszenzmikroskopie (LSFM), Multiphotonen und konfokaler Laserscanning-Mikroskopie kombiniert werden. 3DISCO wird zum Löschen mit leicht verfügbaren und preiswerten Reagenzien, wie Tetrahydrofuran (THF) und Dibenzylether (DBE), ⁴ basiert. Das gesamte Protokoll kann so kurz wie 3-4 Stunden dauern. So ist 3DISCO eine robuste und schnelle Technik im Vergleich zu herkömmlichen histologischen Methoden, die Wochen bis Monate in Anspruch nehmen kann ^9.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit IACUC (Institutional Animal Care und Verwenden Committee) Vorschriften an Mäusen ~ 3-5 Monate alt durchgeführt. Der Autor erklärt keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

1. Tier Perfusion und Gewebepräparation

Timing: 30-60 min pro Maus + Postfixierung (wenige Stunden bis über Nacht).

1. Wiegen Sie das Tier zu betäuben und mit Ketamin (80-200 mg / kg) und Xylazin (7-20 mg / kg) oder 2,5% Avertin (0,5 ml/25 g Körpergewicht IP).
2. Warten Sie ein paar Minuten für die Anästhesie, komplette wirksam werden.
3. Drücken Sie den Zehen und Schwanz des Tieres, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig betäubt wird.
4. Perfuse das Tier zuerst bei RT mit 0,1 M Phosphatpuffer (PB) oder 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 5-10 min, bis das Blut vollständig aus dem Gewebe entfernt.
5. Schalten Sie die Durchblutung an Fixierungslösung: 4% PFA in 0,1 M PB (oder 0,1 M PBS) und weiter Perfusionmit 4% PFA für 30-40 min bei einer Geschwindigkeit von 3 ml / min.
6. Präparieren Sie die Orgel / s von Interesse sorgfältig ohne Beschädigung, z. B. Punktion zu vermeiden und Zusammendrücken des Gewebes, das seziert wird.
7. Entfernen Sie die umliegenden Organe (Bindegewebe, Hirnhaut-oder Dura mater) in einer Petrischale mit PBS gefüllt zusätzliche Gewebe.
8. Post-fix die Organe in 4% PFA für ein paar Stunden oder über Nacht bei 4 º C. Vermeiden Sie lange nach der Fixierung, weil PFA könnte das Signal zu löschen oder zu erhöhen autofluorecense ¹⁰ Überstunden vor allem für GFP-Kanal (die ein geringeres Problem in rot und rot-Kanäle weit ist).
9. Kurz vor dem Start der Clearing-Verfahren Waschen der Organe 2-3x mit PBS bei RT.

2. Tissue Clearing

Timing: 2-3 Stunden für kleine Organe und 1-4 Tage für große Organe.

Hinweise: Die Fluoreszenzmarkierung von den Geweben von Transgen-Expression, virale Transfektion Farbstoff Verfolgung oder AntiKörper Kennzeichnung sollte vor dem Löschen abgeschlossen sein. Alle Gewebe Clearing Schritte werden bei RT durchgeführt. Die Clearinglösungen THF, DBE, BABB (1 Teil Benzylalkohol und Benzylbenzoat Teil 2) und Dichlormethan sind giftig und Inhalation (Verhaltensexperimente in gut belüfteten Abzug) und der direkte Kontakt mit der Haut sollte vermieden werden (Verwendung Nitril-Handschuhe).

1. Vorbereitung 50% (Vol / Vol), 70% und 80% THF Verdünnungen in destilliertem Wasser in getrennten Glasflaschen wie folgt: Für 50% THF, z. B. mischen 25 ml THF und 25 ml destilliertes Wasser in eine Glasflasche mit einem Volumen von mehr als 50 ml beträgt.
2. Mix-Lösungen durch leichtes Schütteln der Flasche für einen 1-2 min.
3. Beschriften Sie die Glasflasche eindeutig.
4. Schließen Sie die Flaschen und halten die Arbeitslösungen in einem dunklen Schrank. Für die besten Ergebnisse, die nicht die gleichen Arbeitslösungen länger als 1-2 Wochen. Daher bestellen die Clearing-Lösungen wie die kleinste zur Verfügung stehende Volumen der Lage Verwendung frischen Reagenzien.
5. Füllen Sie die Glasfläschchen (z. B. 2-3 ml) mit dem ersten Clearing-Lösung, 50% THF, und übertragen Sie die Organe von PBS in Glasfläschchen zu Clearing starten.
6. Schließen Sie die Glas-Flaschen mit ihren Deckeln und mit einem Rotator (zB ein Rad-Rührer) gerührt.
7. Verwenden Sie Aluminiumfolie zu bedecken und halten die Glasflaschen in der Dunkelheit. Starten des Rotors, um die Proben in den Glasfläschchen für die angegebene Zeit (Tabelle 1) mit einer konstanten Geschwindigkeit (~ 30 min) gerührt.
8. Entfernen Sie die Clearing-Lösung und fügen Sie den nächsten in der Protokoll, wenn die in Tabelle 1 ist abgeschlossen.
9. Sammeln Sie die Clearing-Abfall in Glas Abfallbehälter, die in einer Haube gehalten werden.
   Wiederholen Sie diesen Schritt für jedes Clearing-Lösung in das Protokoll bis zum Ende. Verwenden Sie einen neuen Pasteur-Pipette, wenn eine neue Clearing-Lösung versetzt (zB Wechsel von THF zu DBE).
10. Bei der abschließenden Clearing Schritt mit BABB oder DBE, können die Inkubationszeit verlängert oder sh werdenortened, bis die Proben werden vollständig transparent im sichtbaren Licht (oder gelblich / transparent, wenn es eine sehr große Gewebe wie Gehirn).
11. Halten Sie die gelöscht Organe in der letzten Clearing-Lösung jederzeit einschließlich der bildgebenden Schritte.

3. Vorbereitung Geräumte Organe für Imaging

Timing: 5-15 min.

Hinweis: Bild gelöscht, die Organe, sobald eine vollständige Aufklärung erreicht. Zu diesem Zweck führen Sie die nächsten Schritte, um die Proben für die Lichtmikroskopie-Blatt (zB Ultramikroskopie) oder die konfokale / Multi-Photonen-Mikroskopie vorbereiten.

Hinweis: Gelöschte Organe werden ihre Fluoreszenzstärke über die Zeit verlieren (insbesondere z. B. fluoreszierende Proteine, GFP, Antikörpermarkierung ist widerstandsfähiger und kann sogar bessere Ergebnisse mit längeren Inkubationszeiten). Für die Bildgebung, können verschiedene Techniken der Fluoreszenzmikroskopie, so lange verwendet werden, wie die richtige Handhabung der Organe in der CleaRing-Lösung erreicht wird.

1. Für Licht-Blatt-Mikroskopie
   1. Setzen oder stellen Sie die Probe entsprechend.
   2. Befestigen Sie das gelöscht Orgel durch manuelles Drehen Sie die Schraube der Probenhalter ^4.
   3. Tauchen Sie die Probe in die Imaging-Kammer (vorzugsweise aus Glas) von Der Lichtblatt-Mikroskop, das mit BABB oder DBE, je nachdem, was in der letzten Clearing Schritt verwendet wurde gefüllt ist.
2. Für Mehrphotonen / konfokale Mikroskopie
   1. Montieren Sie die Probe auf einem Abbildungs ​​Schieber (oder einer Imaging-Kammer) mit der endgültigen Imaging-Lösung in der Lage, mit einem Multi Photonen-oder konfokalen Mikroskopie, die in der Regel Öl oder Wasser eingetaucht Ziele sein.
   2. Verwenden Sie Zahnzement um einen Rahmen um das Gewebe zu machen.
   3. Füllen Sie den Pool mit BABB oder DBE kurz vor Zahnzement wird komplett starr.
      Hinweis: Die Zahnzement verfestigt sich schnell; üben ein paar Mal, um sich mit ihm vertraut, bevor Sie die eigentlichen Proben.
   4. Sofort legendie gelöscht Probe in der Mitte des Pools und decken Sie es mit einem Deckglas.
   5. Drücken Sie die Abdeckung Glas, bis es vollständig von Zahnzement abgedichtet und landet an der Oberfläche des Organs gelöscht, die es erlauben Erreichen der maximalen Bildtiefe durch konfokale / Multi-Photonen-Mikroskopie.
      Hinweise: Diese sorgt dafür, dass kein Clearing-Lösung wird bei der Abbildung verschüttet werden. Vermeiden Sie das Eintauchen der Abbildungslinse direkt in Clearing-Lösung, die die Linse schädigen können, es sei denn es ist resistent gegen BABB / DBE ist oder eine Schutzhülle.

4. Imaging Geräumte Organe

Timing: 15-45 min.

1. Sammeln Sie eine z-Scan über den gesamten gelöscht Gewebe (wenn das verwendete Objektiv ermöglicht) zum besten Auflösung, die das Mikroskop liefern kann.
2. Zoom auf die Regionen von Interesse für Bilder mit höherer Auflösung zu sammeln.

5. Prüfung der Daten mit der Software Amira

1. Laden Sie das Bild series Software Amira mit ResolveRT-Modul.
2. Geben Sie die richtigen Größen in Voxel-Fenster und drücken Sie ok "Bild lesen Parameter".
3. Wählen Sie den "Multi-Hobel View" Sub-Applikation. Dann nutzen Sie die "Stärke"-Regler, um die optimale Schwelle für die Grauwerte wählen, die Anpassung der 2D-und 3D-Werte.
4. Visualisieren Sie die Probe, indem Sie die Scheiben in verschiedenen 2D-Orientierungen und mit Ernte-Ecke Modul in 3D-Ansicht.
   Hinweis: Eine ausführliche Anleitung zur Fehlersuche des Protokolls kann in Ertürk et al ⁴ gefunden werden.

Ergebnisse

Neuronen sind stark mit extrem langen Morphologie polarisiert Zellen. Ihre Funktion hängt von den Verbindungen, die sie untereinander und mit anderen Geweben zu bilden. Daher ist die Abbildung der Aufbauorganisation der Neuronen, um extrem wichtig zu verstehen, wie sie in Gesundheit und Krankheit zu funktionieren. Allerdings Tracing solche enormen neuronalen Verbindungen während der gesamten Nervensystem vor kurzem connectomics ¹¹ - immer noch eine der größten Herausforderungen in der Neurowissenschaft. Dazu haben sowohl die ^EU-12 und US ¹³ große Projekte initiiert, um das menschliche Gehirn abzubilden.

Während 3DISCO kann auf verschiedene Organe eingesetzt werden, hat sich als besonders nützlich, um lange neuronale Verbindungen im Rückenmark und im Gehirn zu verfolgen gewesen. Zum Beispiel mit Ultramikroskopie Scans von großen gelöscht Rückenmarksegmente, die axonalen Verbindungen können über Zentimetern in der Nagetier-Rückenmark (folgenAbbildung 2). In ähnlicher Weise kann die gesamte gelöscht Mausgehirn (Abbildung 3a) und Hippocampus (Fig. 3b) dargestellt werden, um neuronale Verbindungen im Gehirn zu folgen.

Wenn konfokalen oder Mehrphotonenmikroskopie auf gelöscht Organen verwendet wird, kann die Bildauflösung wesentlich verbessert werden, insbesondere in der z-Dimension. Zum Beispiel, Multi Photonen-Imaging geräumte Rückenmark von GFP-M-Linie Mäuse (Abbildung 4a) erreicht eine nahtloses Bild über die gesamte Tiefe (~ 1,5 bis 2 mm) des Rückenmarks. Konfokale Mikroskopie auf die freiRückenMark liefert eine verbesserte Auflösung in einer ähnlichen Art und Weise (Fig. 4b und c). Multiphotonenmikroskopie Bildgebung gelöscht Gehirn liefert sehr hochauflösende Bilder, feine Details der neuronalen Strukturen, einschließlich dendritischen Dornen (Abbildung 5) zu visualisieren. Die Proben für 3DISCO kann auf verschiedene Arten einschließlich Transgenexpression markiert werden, viral-Transfektion, Farbstoff Verfolgung und Antikörpermarkierung. Zum Beispiel ist es möglich, den gesamten Gefäßsystem des Gehirns (Fig. 6a und b) und Rückenmark (Fig. 6c und d) mit Lectin konjugiert fluoreszierende Tracer ^4, die verwendet werden können, um die Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen (BBB kenn ) in Gesundheit und Krankheit.

Beide Mikroglia und Astrozyten sind hoch in der Pathologie von Neurodegeneration wie Alzheimer-Erkrankungen und Traumata ^14,15 gebracht. Verwendung 3DISCO, ihre Dichte und Verteilung im Rückenmark (Fig. 7) oder des Gehirns untersucht werden.

Nicht-neuronalen Geweben können auch dargestellt werden. Zum Beispiel kann Clara-Zellen im gesamten Lunge mit Nagetier-Antikörpern immun und abgebildet ohne Schneiden zu Einzelzellebene (Fig. 8) werden. Ebenso ist es möglich, zu löschen und Bildzellen beispielsAlpha-Zellen in der ungeschnittenen Pankreasgewebe (Abbildung 9).

Abbildung 1. 3DISCO Gewebe Clearing macht ungeschnittenen Gewebe transparent für tiefe Gewebe-Bildgebung. Ungeklärten (a) und gelöscht (b) des Rückenmarkgewebes durch sichtbares Licht zu sehen. Beim Clearing, wird tiefe Gewebe-Laser-Scanning-Mikroskopie möglich. (C) Ungeklärten gelöscht und Rückenmark Gewebe wurden durch 2-Photonen-Mikroskopie abgebildet. Maßstabsbalken in einem, b = 0,5 mm und c = 100 &mgr; m.

Abbildung 2. 3DISCO Bildgebung des Rückenmarks zu axonalen Erweiterungen folgen. Seziert Das Rückenmark von Thy-1-GFP-transgene Mauslinie (GFP-M) wird in kleinere Stücke geteilt (~4 mm). Nach folgenden Clearing-Protokoll für kleine Gewebe (Tabelle 1) die transparenten Rückenmark wurden mit Ultramikroskopie visualisiert. 3D-Rekonstruktionen von ~ 4 mm Rückenmark Segment in horizontaler (a), koronare (b) und sagittale Ansicht (c). (D) Vertreter zurückzuführen Axonen (rot) sind in der Graustufen transparent dargestellt. (E) Hochvergrößerungsansicht des angegebenen Bereichs in (d). Maßstabsbalken in a, b, c, d = 0,5 mm und e = 20 &mgr; m.

Abbildung 3. 3DISCO Bildgebung des Gehirns und gelöscht Hippocampus. Beispiele gelöscht Gehirne und Hippocampus von GFP-M-Mäuse wurden mit einem Ultramikroskop abgebildet. 3D-Visualisierungen des gesamten Gehirns (a) und Hippocampus (b) Nachweis der neuronalen Netzwrks in der abgebildeten transparente Gewebe. Maßstabsbalken in A = 2 mm und b = 20 &mgr; m.

Abbildung 4. Tissue Clearing verbessert die durch Mehrphotonenmikroskopie und konfokaler Auflösung. Transparent Rückenmarksegmente von GFP-M Mäusen durch Multiphotonen (a) oder die konfokale Mikroskopie abgebildet (b, c). Beachten Sie, dass Clearing verbessert wesentlich die Auflösung und die Bildtiefe enthüllt die Feinstruktur von Axonen und Dendriten. Maßstabsbalken in einer = 100 pm und b, c = 20 um.

Abbildung 5. 3DISCO Bildgebung von dendritischen Dornen. Transparent Hirngewebe von GFP-M Mäusen durch Multiphotonen abgebildet. 3D-Visualisierungen von gescannten Kortex Region in Version vorgestelltsche (a) und horizontale Perspektiven (b). (C) ~ 50 &mgr; m aus den Projektions angegebenen Ebenen (a, b). (D) Hohe Vergrößerung der angegebenen Region in (c) zeigt die feinen Details der neuronalen Strukturen, einschließlich dendritischen Dornen (Pfeilspitzen). Maßstabsbalken in einem = 50 pm, b, c = 25 um, d = 5 um.

Abbildung 6. 3DISCO des Gefäßsystems. Um die Blutgefäße in den ganzen Organen beschriften, wurde Lektin-FITC-Farbstoff während der Perfusion (vor dem Löschen) verwendet, wie beschrieben ^16. Es ist bemerkenswert zu erwähnen, dass wir fanden, dass Schwanzvenen-Injektion des Tracers gibt bessere Signal über Herzdurchblutung des Tracers. Nach dem Sammeln der Fest Gehirn und Rückenmark, werden sie gelöscht und ich wurdenvon Ultramikroskopie maged. 3D-Visualisierung des gesamten Gefäßsystems im Gehirn der Maus Heatmap (a) und Graustufen (a). (B) 3D-Visualisierung des Gefäßsystems eines Rückenmark der Maus in heatmap Segment (c) und Graustufen (d). Die Heat wurden basierend auf der Intensität der Färbung Lektin erzeugt wird; blau: niedrige Intensität (Hintergrund) und rot: hohe Intensität (Gefäßsystem). Maßstabsbalken in der a = 2 mm, b = 1 mm, und c, d = 250 &mgr; m.

Abbildung 7. 3DISCO von Gliazellen im ZNS-Gewebe gelöscht. Die Rückenmark von transgenen Mäusen, die GFP in Mikroglia TgH (CX3CR1-EGFP) oder Astrozyten TgN (hGFAP-ECFP) wurden gelöscht und durch Mehrphotonenmikroskopie abgebildet. 3D-Rendering von Mikroglia als Oberflächenvolumenvisualisierung (a) und transparent (gezeigt (C) einem optischen Projektions (~ 50 &mgr; m) dargestellt, um die Details der Mikroglia im Rückenmark zu zeigen. 3D-Rendering von Astrozyten als Oberflächenvolumenvisualisierung (a) und transparent (b) gezeigt. (F) einem optischen Projektions (~ 50 &mgr; m) dargestellt, um die Details der Astrozyten im Rückenmark zu zeigen. Maßstabsbalken in a, b, d, e = 100 &mgr; m und c, f = 50 &mgr; m.

Figur 8. 3DISCO einer whole-mount Lungenlappen mit Antikörperfärbung von Clara-Zellen. Für die Whole-mount-Antikörper-Färbung von Lungenlappen, 10 Wochen alte weibliche BALB / c-Mäuse wurden durch die rechte Herzkammer mit PBS perfundiert, um Blut aus der Lunge zu entfernen. Lungen wurden anschließend mit 4% PFA mindestens das dreifache Volumen der th aufgeblasen und fest O / N bei RT in Fixative Gewebe. Am nächsten Tag wurden die Lungen kurz in PBS gespült und der rechte Lappen wurde in 5 ml 1% Triton X-100 in PBS für Permeabilisierung für 48 Stunden oder bis das Gewebe sank setzen. Alle Färbungen wurden in 0,2% Triton X-100 in PBS durchgeführt, das 5% FBS und 2% BSA und Spülungen wurden in 0,2% Triton X-100 in PBS. Die Färbung mit anti-CC10 wurde 72 h bei 4 ° C, gefolgt von umfangreichen Wasch etwa 6 Stunden. Fluoreszenz-Markierung des primären Antikörpers wurde mit Anti-Ziege-Alexa Fluor 594-Sekundär-Antikörper über Nacht bei 4 ° C durch extensive Waschungen für 6 h bis über Nacht, gefolgt erreicht. Am folgenden Tag wurden gefärbt durch Lappen 50%, 70% und 80% THF für 30 min geklärt jeweils gefolgt von drei 30-minütigen Waschungen in 100% THF, gefolgt von 20 min in DCM, gefolgt von 30 min in DBE. Maßstabsbalken in einer und b = 1 mm und c = 100 &mgr; m.

Abbildung 9. 3DISCO der Bauchspeicheldrüse. Nach Perfusion von Mäusen, wie oben beschrieben, in das Protokoll, das Pankreas wurde präpariert und mit dem Kurzprotokoll gelöscht. Die Fluoreszenz wird von LSL ROSA26 tdTomato Rekombination durch Tamoxifen-Behandlung von Mäusen, die eine 200 kb BAC Transgens überspannt den endogenen Maus-Glucagon Ortes mit CreERT2 in die ATG von Glukagon eingesetzt induzierte abgeleitet. Die Pfeilspitzen markieren einige der fluoreszenz-markiertem alpha-Zellen in der Insel. Maßstabsbalken in a, b und c = 1 mm und d = 500 &mgr; m.

Tabelle 1. Tissue Clearing-Protokolle für die verschiedenen Geweben. Beispiele für Gewebe Clearing-Protokolle für verschiedene Gewebe. Beachten Sie, dass die Clearingzeit für jeden Schritt kann verkürzt oder verlängert, wie nötig, um die Clearing-Leistung zu verbessern. Das ungefähre Gewicht der kleinen Geweben ~ 20-100 mg und Gehirn ist ~ 300-500 mg.TTPs :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.

Diskussion

Tissue Clearing-Methoden zielen darauf ab, Streuung von Abbildungslicht durch Anpassung der Brechungsindizes der verschiedenen Gewebeschichten in den Organen gelöscht reduzieren. Als Ergebnis kann die Abbildungs ​​Licht tief in das Gewebe eindringen und die markierten Zellen / Moleküle zu stimulieren. Das alte Konzept der Clearing ¹⁷ Gewebe wachsende Aufmerksamkeit nach der ersten anspruchsvolle Anwendung der Technik auf intakten Gehirn der Maus nach Dodt und Kollegen ² gewonnen. Seitdem gibt es eine schnell wachsende Liste der neuen Clearing-Methoden, einschließlich 3DISCO, Sca / e, ClearT2, CLARITY und SeeDB ^3,4,7,18-20. Im Grunde wollen sie alle, die Organe für tiefe Gewebedarstellung transparent durch die Erhaltung der Fluoreszenzmarkierung zu machen. Unter ihnen steht 3DISCO als einer der am einfachsten und reproduzierbaren Verfahren. Es ist relativ schnell im Vergleich zu anderen oben genannten Clearing-Verfahren (1-5 Tage vs 2-3 Wochen für erwachsene Gehirne jeweils) ^21. Es wurde bereits erfolgreichvollständig in verschiedenen Organen wie dem Gehirn, Rückenmark, Lymphknoten, Milz, Lunge, soliden Tumoren, Pankreas und Brustdrüsen ^3,4,9 aufgebracht. Darüber hinaus sind mehrere Publikationen von unabhängigen Forschungsgruppen bereits diese Methode verwendet, um Bildergebnisse zu erhalten ^22,23. Dennoch verschiedenen Gewebeclearingverfahren für unterschiedliche Bedingungen vorteilhaft sein könnte. Während beispielsweise Sca / e und SeeDB anwendbar sind am besten auf ^6,7 embryonalen Geweben, sind sie auf Wasserbasis Clearing-Methoden, die einfacher zu handhaben sein, während der Bildgebung konnte. Im Gegensatz dazu ist CLARITY eine komplizierte und kostspielige Clearing-Verfahren. Es ist aber vorteilhaft im Rahmen der Antikörpermarkierung sein kann, vor allem in großen Geweben wie Gehirn ^8.

Der wichtigste Schritt, um die besten Bildergebnisse zu erhalten, ist von 3DISCO Gewebe Kennzeichnung, die vor der Gewebe Lichtung erreicht wird. Es ist wichtig, mit der stärksten Fluoreszenzsignal möglich beginnen. Dies kann be auf verschiedene Weise einschließlich der transgenen Expression von fluoreszierenden Proteinen erreicht, das Aufspüren von synthetischen Farbstoffen, virale Transfektion oder Antikörpermarkierung. Es sollte bedacht werden, dass jede Clearingverfahren wird das Fluoreszenzsignal der Gewebe zu reduzieren. Daher, wenn das Fluoreszenzsignal nicht stark genug ist zu Beginn - dh es ist nicht leicht nachweisbar vor dem Clearing-Abbildung der gelöscht Gewebe liefern schlechte Ergebnisse.

Es gibt einige Einschränkungen von Beseitigungsverfahren, die für Verbesserungen warten. Eine kritische Beschränkung ist, dass, da Clearing Reagenzien verändern die Struktur der Organe gelöscht, können sie nicht auf lebendes Gewebe verwendet werden. Daher sollten Experimente wie mit photoaktivierbares mEos2 ²⁴ vor der Befestigung und Clearing durchgeführt werden. Beim Clearing, wird Super-Resolution Imaging des Fluoreszenzsignals von hell und photo Proteine ​​möglich. Darüber hinaus, weil die Clearing Protokoll verringert dieIntensität der fluoreszierenden Proteine ​​können die gelöscht Organe für längere Zeit nicht gelagert werden. Es ist wichtig zu beachten, dass einige Organe sind schwerer zu löschen. Insbesondere, wenn die Organe präpariert behalten hohe Mengen an Blutzellen (z. B. Milz, Leber), sie sind relativ schwer und Löschen. Es ist auch relativ schwieriger, eine vollständige Beseitigung großer Geweben, wie Gehirn erwachsenen Nagetieren zu erreichen. Solche Gewebe können längere Inkubationszeiten müssen, was andererseits zu verringern könnte das Fluoreszenzsignal. Darüber hinaus, das Bild große transparente Organe ist die Entwicklung von Methoden der Mikroskopie kann auf einmal bei einer hochauflösenden wartet eine Notwendigkeit, angegangen werden. Eine weitere wichtige Einschränkung der Technik ist die Kennzeichnung Gewebe. Während ein starkes Fluoreszenzsignal über genetische oder Virus-Expressions ideal ist, kann nicht jede Zelle oder Molekül genetisch oder viral gekennzeichnet werden. Auf der anderen Seite, ist Antikörpermarkierung von dicken Gewebe keine einfache Prozedur oder gar nicht possible in den meisten Fällen. Es können besondere Permeabilisierung Protokolle und lange Inkubationszeiten müssen (mehrere Tage bis zu einigen Wochen) ^3. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Gewebe schrumpfen ~ 20% in jeder Dimension (für Rückenmarksgewebe gemessen) nach dem Löschen vor allem wegen Austrocknung und Entfettung. Diese Schrumpfung tritt ratiometrisch und sollte Quantifizierungsschritten korrigiert werden. Wie in den vorgestellten Ergebnisse beobachtet, fluoreszenzmarkierten Strukturen erhalten bleiben, die die Angabe des Proteinintegrität in den Geweben ist gelöscht. Aufgrund der hydrophoben Natur des endgültigen gelöscht Gewebe, kann es nicht weiter mit Antikörpern gefärbt oder in Wasser enthaltenden Lösungen eingebettet werden z. B.-Focusclear die Klarheit oder 80% Glycerin verwendet wird. Schließlich ist es eine Herausforderung, überwältigend Größen von Bilddaten zu analysieren. Zum Beispiel, wenn eine ganze Maus-Gehirn auf zellulärer Auflösung gescannt, wäre es sehr schwierig zu verfolgen und zu quantifizieren gewünschten structures (zB neuronale Netze oder Gliazellen) und vergleichen Sie über verschiedene Proben in einem automatisierten Weg. Zusammenfassend, während Forscher wollen neue Clearing-Methoden herauszufinden, die verschiedenen Herausforderungen oben (Schwierigkeit Clearing verschiedenen Geweben, Imaging mit hoher Auflösung von größeren Flächen und komplizierte Datenanalyse) sollten parallel verbessert werden.

Abschließend neu entwickelte Gewebe Clearing-Techniken, einschließlich 3DISCO, elegant zeigen, dass hochauflösende 3D-Bildgebung von Organen intakt ist jetzt möglich. Mit Hilfe dieser Methoden können die Wissenschaftler anatomischen Informationen der Zellen und Moleküle im intakten Organ zu erhalten. Diese bahnbrechende 3D-Imaging-Studien auf transparenten Organen begeistern eine wachsende Zahl von Forschern, komplexe anatomische und molekulare Organisationen der Gewebe / Organe in Heide und Krankheit zu entschlüsseln.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
		Thy-1 GFP (GFP-M)	ist bei Jackson erhältlich.
CX3CR1 GFP-Maus			Kann im Littman-Labor an der NYU bezogen werden.
TgN(hGFAP-ECFP) Maus			Kann von Jackson bezogen werden.
Paraformaldehyd	Sigma	P6148
Na2HPO4	Mallinckrodt	7917-16
NaH2PO4	Mallinckrodt	7892-04
2-2-2 Tribromethanol	Sigma	T48402
2-Methyl-2-butanol	Sigma	152463	verwendet zur Herstellung der Avetin-Lösung.
Kochsalzlösung	Braun
Tetrahydrofuran	Sigma	186562-12X100ML
Dichlormethan	Sigma	270997-12X100ML
Dibenzylether	Sigma	Sigma, 108014-1KG
Benzylalkohol	Sigma	305197-100ML
Benzylbenzoat	Sigma	B6630-250ML
Lectin FITC	Sigma	L0401-1MG
anti-CC10	Santa Cruz	SC-9772	0,388888889
Heparin	APP Pharmazeutika	504001	Wird in der Perfusion verwendet.
Glasfläschchen	VWR	548-0554
Pinzette	FST	11251-10
Mini-Rotator	VWR	100498-878
Aluminiumfolie	Fisherbrand	01-213-104
100 ml Medienvorratsflaschen	Kimax Medienflaschen	EW-34523-00
Minipuls evolution Perfusionspumpe mit MF4* Pumpenkopf	mit mittlerem DurchflussGilson, Inc	F110701 und F117606
Mikroskopie-Objektträger	VWR	48311-703
FastWell	Grace Bio-Labs	FW20
Deckglas	Corning	2940-245
Petrischale aus Glas	Corning Pyrex	3160-101
Zahnzement	Lang Dental	1223PNK
Quantofix Peroxid-Test Strips	Sigma	37206
Amira mit RT Resolve Mikroskopie-Modul	Visage Imaging	Bildanalysesoftware
Imaris	Bitplane Imaging	Bildanalysesoftware
ImageJ	NIH	Freeware