Methodenartikel

Bio-Schicht-Interferometrie zur Messung der Kinetik der Protein-Protein-Interaktionen und allosterische Ligandeneffekte

DOI:

10.3791/51383

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18. Februar 2014

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, SUNY Upstate Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Protokolle beschreiben kinetische Untersuchungen von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Bio-Schicht-Interferometrie. F-ATP-Synthase, die in der zellulären Energiestoffwechsel beteiligt ist, kann durch die ε-Untereinheit in Bakterien gehemmt werden. Wir haben Bio-Schicht Interferometrie geeignet ist, Wechselwirkungen des katalytischen Komplexes mit inhibitorischer C-terminalen Domäne ε zu studieren.

Zusammenfassung

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Wir beschreiben die Verwendung von Bio-Schicht Interferometrie inhibitorische Wechselwirkungen der ε-Untereinheit mit dem katalytischen Komplex von Escherichia coli ATP-Synthase zu studieren. Bakterielle F-ATP-Synthase ist das Ziel eines neuen, von der FDA zugelassene Antibiotikum zur Bekämpfung der medikamentenresistenten Tuberkulose. Verständnis bakterienspezifischen Auto Hemmung der ATP-Synthase durch die C-terminale Domäne von ε-Untereinheit kann ein neues Mittel, um das Enzym für die Entdeckung der antibakterielle Medikamente an. Die C-terminale Domäne von ε erfährt eine dramatische Konformationsänderung, wenn das Enzym die Übergänge zwischen den aktiven und inaktiven Zuständen und katalytischen Ort Liganden beeinflussen, welche von Konformationen ε vorherrschende ist. Die Assay-Maßnahmen Kinetik der ε die Bindung / Dissoziation mit der katalytischen Komplex und indirekt mealeistet die Verschiebung des enzymgebundenen ε zu und von der scheinbar nondissociable inhibitorische Konformation. Die Bio-Schicht Interferometrie Signal nicht überempfindlich auf Lösungszusammensetzung, so kann es auch verwendet werden, um allosterische Effekte von katalytischen Ort Liganden auf Konformationsänderungen ε überwachen werden.

Einleitung

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Protein-Protein-Wechselwirkungen sind wichtig für viele biologische Prozesse und markierungsfreie optische Methoden wie Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) wurden in vitro verwendet worden, um die Kinetik der Bindung und Dissoziation 1 studieren. Die meisten markierungsfreien Methoden ein Biomolekül Immobilisierung auf einer Sensoroberfläche und verwenden Sie ein optisches Signal an einen Bindungspartner aus der Lösung zu erkennen, wie es mit dem immobilisierten Biomolekül 1 zuordnet. Während SPR ist ein hochempfindliches Verfahren, ist es anfällig für Störungen aufgrund von Änderungen des Brechungsindex der Lösung über dem Sensor 2....

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Protokoll

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1. Programmierung des Instruments für BLI-Test

Schalten Sie das Gerät mindestens eine Stunde im Voraus, um die Lampe zum Aufwärmen, das ist notwendig, um das Rauschen zu minimieren und Drift in der optischen Signal während des Experiments. Stellen Sie die gewünschte Temperatur über die Registerkarte Instrument, um die Probe Plattenhalter vorwärmen. Dann das experimentelle Design in der Datenerfassung-Software. Wählen Sie "Neu Kinetics Experiment" in der Registerkarte Assistent Experiment. Dies stellt eine Tabbed-Menü mit allen Schritten, die definiert werden müssen.

1.1. Teller Definition

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Ergebnisse

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Echtzeit-Bindung und Dissoziation BLI Kinetik sind in Abbildung 3 dargestellt. Dieses Experiment wurde mit Testpuffer in Assoziation und Dissoziation getan. Dieses Experiment wurde mit einer 10 min Basis Schritt gestartet, da die Sensoren erst kurz vorbefeuchtet worden. Als nächstes wurde biotinyliertes ε auf den Sensoren geladen. Keine nachweisbare Dissoziation von ε aufgetreten ganzen restlichen Schritte von der Referenzkurve (G), die keine Bindungspartner aufgenommen hatte gesehen. Eine zweite Refere.......

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Diskussion

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Die derzeit verfügbaren Instrumente zur BLI ermöglichen signifikante Durchsatz und Flexibilität in Tests zur biomolekularen Wechselwirkungen. Verschiedene Lösungsproben werden in die Vertiefungen einer schwarzen Mikrotiterplatte abgegeben wird, und einen Satz von parallelen BLI Sensoren programmiert werden, um zwischen den Spalten der Vertiefungen auf der Platte hin und her zu bewegen. Die Proben werden durch Orbitalschütteln während des Tests gerührt. Das hier verwendete System 8 Sensoren und verwendet eine 96-well-Pro.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

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Wir bedanken uns für die Bereitstellung FortéBio Grafiken in Abbildung 1 verwendet. Diese Arbeit wurde vom NIH GM083088 TMD unterstützt

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Octet-RED96Pall/Forté Bio30-5048
RinderserumalbuminSigmaA6003-10GFettsäurefrei
Biosensor/StreptavidinPall/Forté Bio18-5019Fach mit 96 Sensoren
MikrotiterplatteGreiner Bio-one655209Schwarz, Polypropylen
DatenerfassungssoftwarePall/Forté BioVersion 6.4Neuere Versionen verfügbar
Datenanalyse-SoftwarePall/Forté BioVersion 6.4Neuere Versionen verfügbar

Referenzen

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  1. Nirschl, M., Reuter, F., Voros, J. Review of Transducer Principles for Label-Free Biomolecular Interaction Analysis. Biosensors. 1, 70-92 (2011).
  2. Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 377, 5....

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Schlagwörter

Bio layer InterferometryProtein protein InteractionsAllosteric Ligand EffectsATP SynthaseSubunit EpsilonBinding KineticsDissociation KineticsStreptavidin BiosensorsReal time BindingLigand Effects

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