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Methodenartikel

Die Nutzung der Oropharyngeale Intratracheale PAMP Verwaltung und bronchoalveoläre Lavage, um die Immunantwort in Mäusen Bewerten

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DOI:

10.3791/51391

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2. April 2014

1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland Regional College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Immunantwort des Wirts auf Pathogen-Infektion ist eine streng reguliert Prozess. Mit Hilfe eines Lipopolysaccharid Lungenexpositionsmodell in Mäusen, ist es möglich, hochauflösende Auswertungen der komplexen Mechanismen der Krankheitsentstehung verbunden durch.

Zusammenfassung

Die Immunantwort auf Pathogene ist ein komplexer biologischer Vorgang. Die Mehrheit der in-vivo-Studien eingesetzt, um klassisch zu charakterisieren Wirt-Pathogen-Interaktionen nutzen intraperitoneale Injektionen von ausgewählten Bakterien oder Erreger associated molecular patterns (PAMPs) bei Mäusen. Während diese Techniken haben enorme Daten mit Infektionskrankheiten assoziiert Pathobiologie ergab, sind intraperitoneale Injektion Modelle nicht immer für Wirt-Pathogen-Interaktionsstudien in der Lunge geeignet. Mit Hilfe einer akuten Lungenentzündungsmodell bei Mäusen, ist es möglich, eine hochauflösende Analyse der Host angeborenen Immunantwort Verwendung Lipopolysaccharide (LPS) durchzuführen. Hier beschreiben wir die Methoden, um LPS verwalten mit nicht-chirurgischen oropharyngeal intratracheale Verwaltung, Überwachung klinischer Parameter mit der Krankheitsentstehung verbunden sind, und nutzen bronchoalveolären Lavage, um die Immunantwort zu beurteilen. Die Techniken, die beschrieben werden,sind weit für das Studium der Wirt angeborenen Immunantwort auf ein breites Spektrum von PAMPs und Pathogene. Ebenso können mit kleineren Modifikationen dieser Techniken können auch in Studien, die allergische Entzündung der Atemwege und in pharmakologischen Anwendungen eingesetzt werden.

Einleitung

Pulmonale Infektionen mit pathogenen Bakterienspezies verbunden sind, sind eine häufige Ursache von Morbidität und Mortalität weltweit. Die Bestimmung der Mechanismen, die die Immunantwort auf diese Krankheitserreger treiben die Entwicklung von neuen Präventionsstrategien und Therapeutika, die die Auswirkungen dieser Infektionen dämpft fördern. Das übergeordnete Ziel des hier beschriebenen Protokolls ist es, den Anwender mit einer flexiblen Verfahren zu schaffen, zu bewerten, den Host angeborenen Immunantwort auf Krankheitserreger Infektion mit einem Erregermuster (PAMP) als Surrogat für die lebenden Bakterien. Die Mehrheit der früheren Studien, die die Host angeborenen Immunantwort auf Bakterien auf peritoneale Modelle aufgrund der relativen Leichtigkeit der Ausführung konzentriert. Während diese Modelle sind sehr nützlich und in bedeutende Fortschritte auf dem Gebiet der Wirt-Pathogen-Interaktionen und systemischen Entzündung geführt hat, sind die aus diesen Modellen generierten Daten nicht immer für die entsprechenden Studien involving der Atemwege. Dabei wird ein Modell der akuten Lungenlungenentzündung als praktische und klinisch relevante Ausdehnung der klassischen intraperitoneale (ip) Injektion Modelle vorgeschlagen. Die vorgeschlagene Technik ermöglicht die lokale Bewertung der angeborenen Immunantwort bei einem organspezifischen Modellsystem.

Die hier beschriebenen Verfahren sind für eine einfache und robuste Technik, um Benutzern, die Immunantwort des Wirts auf LPS, die eine gemeinsame PAMP ist, beurteilen zu können. Die Methoden basieren auf intratracheale (IT) Instillation von LPS, die eine robuste angeborene Immunantwort in den Lungen von Mäusen und ahmt viele der in menschlichen Patienten, die an Infektionen der Atemwege und akuter Lungenverletzung 1 beobachtet pathophysiologische Funktionen induziert basiert. Ein Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es dem Benutzer, den Host-Immunantwort ohne die Störfaktoren und Sicherheitsbedenken bei der Durchführung in vivo Studien verbunden zu bewertenmit lebenden Bakterien. Auch die Mund-Rachen es Verwaltung Weg der Exposition in diesem Protokoll beschrieben ist, hat erhebliche Vorteile gegenüber anderen häufig verwendeten Techniken, einschließlich intranasale (in) Verwaltung und chirurgische es Verwaltung. Zum Beispiel ermöglicht es oropharyngealen Verabreichung relativ genaue Dosierung und Lungenablagerung im Vergleich zu in der Verwaltung, die in der Regel leidet erhöhte Variabilität Lung durch den Verlust von Mitteln in der Nasenhöhle und Nasennebenhöhlen 2-4. Die IT-Administration Route umgeht diese Hohlräume und ermöglicht den direkten Zugriff auf die Luftröhre und der Atemwege. Ebenso ist es die chirurgische Ansatz eine deutlich krankhaften Verabreichungsmethode und erfordert umfangreiche Ausbildung zu meistern. Die hier beschriebenen Protokolle umfassen auch eine Beschreibung der gemeinsamen Techniken und Surrogat-Marker verwendet, um Entzündung Progression zu bewerten und am Ende mit einem Protokoll beschreibt die richtigen Techniken für die Vorbereitung der lungs für die Histopathologie Einschätzungen. Diese Protokolle basieren auf der Minimierung der Anzahl der Mäuse durch Maximierung der von jedem einzelnen Tier gewonnenen Daten für jede Studie erforderlich konzentriert.

Die beschriebenen Protokolle sind sehr flexibel und kann leicht geändert werden, um ein breites Spektrum und die damit verbundenen Schäden PAMPs molekulare Muster (gedämpft) zu beurteilen. Außerdem mit ein paar zusätzliche Modifikationen, diese Protokolle auch auf Studien, die allergischen Atemwegskrankheitsprogression oder Wirt-Pathogen-Interaktionen mit lebenden Bakterien, Viren oder Pilzen 5-10 angewendet werden.

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Protokoll

Alle Untersuchungen wurden im Rahmen der Genehmigung des Institutional Care und Verwenden Committee (IACUC) für Virginia Tech und in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.

1. Intratracheale (es) Inokulation von LPS Mit Oropharyngeale Verwaltung

  1. Stellen Sie sicher, dass jedes Tier ist einzigartig entweder ein Ohr Schlag, Ohrmarke oder andere institutionell anerkannte Methode identifiziert.
  2. Notieren Sie die Ausgangskörpergewicht und die Körpertemperatur für jedes Tier.
  3. Bereiten Sie die Arbeits Bestand von LPS. Jede Maus wird mit 50 ul Dosis von 1 mg / kg LPS in 1 × phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) erhalten. Mock-behandelten Tiere erhalten eine Dosis von 50 ul 1x PBS.
  4. Bereiten Sie eine entsprechende Kammer für die Verwaltung von Isofluran mit dem folgenden Drop-Methode. Institutionelle Leitlinien variieren hinsichtlich der Verwendung von Isofluran und anderen Narkosemitteln und vor der initiatten keine Studien sollten Personen, Abteilung Tierpflege / Wohlfahrt ihre Institution wenden, um sicherzustellen, die alle Richtlinien hinreichend erfüllt werden. Wenn Isofluran-Drop-Methode ist keine Option, anderen Narkosemitteln sind akzeptable Alternativen.
    1. In einem geeigneten Sicherheitsschrank, gelten etwa 3 ml Isofluran zu einem gefalteten absorbierenden Papiertuch und in den Boden eines 500 ml-Becherglas.
    2. Legen Sie ein kleines Stück Aluminiumfolie auf der Oberseite des Papiertuch abdecken und das Becherglas mit einem transparenten Deckel.
  5. Bereiten Sie die Instrumente und Reagenzien, die es während der Impfung verwendet wird. Positionieren Sie das Gummiband, das sichern die Tiere den Kopf auf das Intubation Stand wird. Dieses Verfahren wird ein Paar von geraden Zangen, ein Paar von abgewinkelten oder gebogenen Pinzette und ein p200 mit Spitzen erfordern.
  6. Last 50 ul von LPS in die Pipettenspitze und in einer leicht zugänglichen Lage neben dem Stand der Intubation.
  7. Anesthetize der Mausindem das Tier in die Kammer Isofluran und Abdecken der Kammer mit dem transparenten Deckel. Beachten Atemmuster des Tieres, der schnell und flach sein wird, wenn in der ersten Kammer angeordnet. Das Tier ausreichend betäubt werden, wenn die Atmung Raten heran 1 Atemzug / 2 sec, die in der Regel innerhalb von 30 Sekunden der Platzierung in der Kammer erreicht ist. Die Maus sollte betäubt werden, wie in der zugelassenen Tier-Protokoll mit Isofluran-Drop-Methode bilanziert.
  8. Entfernen Sie den narkotisierten Maus aus der Kammer und die Aussetzung der Tier auf der Intubation stehen mit ihrem vorderen Schneidezähne. Versichern, dass das Tier sicher zurückgehalten und der Mund-und Zungen zugänglich sind.
  9. Sichern Sie vorsichtig die Zunge mit den geraden Pinzette. Fassen Sie die Zunge mit den abgewinkelten Pinzette und ziehen Sie sie vorsichtig aus dem Mund, bis ein leichter Widerstand zu spüren ist. Diese Maßnahme reicht aus, um den Kehldeckel zu blockieren und Zugang zu der Luftröhre.
  10. Während Sie die Zunge in die haltenausgefahrenen Position, die Verwaltung der 50 ul Dosis von LPS in die Rückseite der Kehle und Nase des Tieres sofort Abdeckung mit einem behandschuhten Finger. Das LPS wird in der Rückseite der Kehle sichtbar, bis die Maus einatmet.
  11. Weiterhin die Nase bedecken und halten Sie die Zunge für 5-10 zusätzliche Atemzüge erweitert.
  12. Entfernen Sie die Maus von der Intubation Stand und legen Sie das Tier wieder in einen neuen Käfig, bis er aus der Narkose erholt.
  13. Überwachung Surrogatmarker mit Fortschreiten der Krankheit verbunden sind. Körpergewicht und die Körpertemperatur sollten alle 4-8 h für die Dauer der Studie überwacht. Ebenso beurteilen Verhaltensmerkmale und klinische Symptome, die mit einer erhöhten Morbidität verbunden.
  14. Um den Krankheitsverlauf, Zwergmäuse zu bestimmten Zeitpunkten nach der LPS-Exposition zu beurteilen. Typische Zeitpunkte für die Ernte nach der LPS-Exposition sind 0, 6, 12, 18, 24 und 48 Stunden. Um eine Wiederherstellung und Überlebens bewerten, bewerten die Mäuse für 7 days nach der Inokulation.

2. Serum-und bronchoalveolären Lavage (BAL) Sammlung

  1. Sacrifice Sie die Maus über ein institutionell anerkannte Methode.
  2. Legen Sie das Tier auf den Rücken und befestigen Sie es an eine Obduktion Karte, die optimal in 0,5 (1,27 cm) in der Höhe.
  3. Befeuchten Sie die gesamte Maus mit 70% Ethanol.
  4. Mit einer 1-ml-Spritze mit einer 27 G-Nadel, eine Herzpunktion durchzuführen, bevor irgendwelche Einschnitte. Es sollte möglich sein, 500-800 ul Vollblut von einem einzigen Mausklick zurücktreten.
  5. Entfernen Sie die Nadel aus der Spritze und übertragen das ganze Blut zu einem vormarkiert 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zur Serumgewinnung ermöglichen das Vollblut für mindestens 30 min bei Raumtemperatur koagulieren. Zusätzlich zur Serumgewinnung, kann dieses Verfahren auch durch Einarbeiten eines Antikoagulans in das Rohr und Spritze vor dem Sammeln des Vollbluts, zu studieren zirkulierenden Immunzellen verändert werden.
  6. Machen Sie einen horizontalen Schnitt einqueren die Länge der Peritonealhöhle und einen vertikalen Schnitt von der Peritonealhöhle zu dem Unterkiefer des Maus.
  7. Mit einer Pinzette, fassen die beiden Seiten des Einschnitts und ziehen Sie die Haut von den zugrunde liegenden Peritoneal-und Brusthöhle.
  8. Einen großen Einschnitt entlang der Länge der Bauchhöhle von den Genitalien auf dem Brustbein, wobei darauf zu vermeiden, schneiden die Membran. Leicht verschieben die Eingeweide in die Bauchhöhle, um den Zugang zu einer der Nieren zu ermöglichen.
  9. Schneiden Sie die Nierenvene, die zur Niere als Drainagepunkt für die Durchblutung zu dienen.
  10. Nick die Membran mit einer Schere, kümmert sich um die Lunge und Herz zu vermeiden, um die linke Seite des Herzens aus.
  11. Manuell Perfusion des Herzens unter Verwendung einer 10 ml-Spritze mit einer 27 G Nadel und 1x PBS-Lösung. Vermeiden Sie die Anwendung exzessiver Gewalt während der Durchblutung, um sicherzustellen, dass die Kochsalzlösung ist nicht in die Lungen gepresst. Das restliche Blut sollten aus der Pfortader Einschnitt abtropfen lassen.
  12. Schneiden Sie vorsichtig den Brustkorb entlang des Brustbeins mit stumpf / stumpf Schere, wobei darauf zu vermeiden, schneiden das Herz und die Lunge. Versehentlich Schneiden der Lunge während dieser Prozedur wird die Menge der gesammelten BALF deutlich zu reduzieren und wird in einer Unfähigkeit, richtig aufblasen die Lungen mit Fixiermittel führen.
  13. Sanft isolieren das Herz und die Lunge aus dem Brustkorb mit einer Pinzette. Jeden Abschnitt des Brustkorbs mit stumpf / stumpf Schere so nah an der Wirbelsäule wie möglich vorsichtig geschnitten und vollständig zu entfernen beide Abschnitte.
  14. Trennen Sie die Speicheldrüsen mit einer Pinzette oder entfernen Sie sie mit einer Schere, um die Luftröhre freizulegen.
  15. Schneiden Sie vorsichtig die Muskeln, die die Luftröhre überlagern mit einer Schere. Es ist wesentlich, dass der Luftröhre dabei nicht geschnitten werden.
  16. Mit einer Schere, trennen Sie die Schlüsselbein, die über der Luftröhre.
  17. Fassen Sie die Thymusdrüse mit einer Pinzette und heben das Gewebe vom Herzen. Entfernen Sie die Thymusdrüse mit einer Schere, während die Pflege zuvermeiden Schneiden des Herzens oder der Lunge.
  18. Machen Sie einen kleinen horizontalen Schnitt in der Luftröhre 1-2 Ringe unterhalb des Kehlkopfes mit abgewinkelten Scheren (45-90 º Winkel, scharf / scharf). Der Schnitt sollte groß genug sein, um sicher zu befestigen die Kanüle sein.
  19. Legen Sie die Kanüle, so dass das verjüngte Ende erstreckt 03.02 Trachealringe unter dem Schnitt und sichern Sie die Kanüle an Ort und Stelle mit einem Seidenfaden. Sicherzustellen, daß das Nahtmaterial läuft zwischen der Luftröhre und der Speiseröhre und wird fest an der Kanüle gezogen wird.
  20. Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit 1 ml Hanks Salzlösung (HBSS) und schieben Sie dessen Dorn in die Kanüle.
  21. Mit einem langsam, aber ständig in Bewegung, injizieren ~ 900 ul in die Luftröhre, das Aufblasen der Lunge, und sofort zurückziehen HBSS. Legen Sie die wieder BALF in einem 15 ml konischen Röhrchen.
  22. Wiederholen Sie diesen Lavage 2 weitere Male auf ca. 3 ml BALF für zukünftige Analysen zu sammeln. Bewahren Sie die BALF auf Eis oder bei 4 º C bis zur Verwendung.

3. Histopathologie Vorbereitung

  1. Legen Sie eine 10-ml-Spritze in die Lunge Inflation Stand. Montieren Sie den Schlauch an den Luer, Luer auf den Hahn, und der Hahn an der Spritze. Sicherstellen, dass der Hahn in der geschlossenen Position. Die 10-ml-Spritze wird als Schwerkraftreservoir dienen. Der Behälter sollte auf die Inflation angebracht werden stehen in 4,75 über das Tier und die Oberseite des Behälters sollte in 10,5 über das Tier zu verlängern.
  2. Füllen Sie die Spritze mit neutral gepufferten Formalin-Lösung. Sicherzustellen, dass die Spritze vollständig mit der Fixierlösung gefüllt.
  3. Platzieren Sie ein saugfähiges Tuch unter dem offenen Ende des Rohres, und öffnen Sie den Wasserhahn, damit das Fixiermittel, um den Schlauch zu füllen. Sobald das Fixiermittel beginnt aus dem Schlauch fließt, sofort den Absperrhahn schließen und füllen Sie die Spritze an die Spitze mit Fixiermittel. Es ist wichtig, dass die Spritze vollständig gefüllt werden, um die geeignete Menge für Lungeninflationsdruck bereitzustellen.
  4. Geben vorsichtig ein zweites Stück Faden unter der Luftröhre, etwa 1-2 Trachealringe unter dem Ende der Kanüle.
  5. Binden Sie einen einzigen lockeren Knoten in der Naht; jedoch nicht ziehen die Knoten fest.
  6. Stecken Sie den Schlauch von der Maus Inflation stehen in die Kanüle.
  7. Öffnen Sie den Wasserhahn und lassen die Lunge durch die Schwerkraft der Inflation zu füllen.
  8. Sobald die Lunge erreichen ihre maximale Inflationsniveau, ziehen Sie den Faden fest und binden einen zweiten Knoten.
  9. Schließen Sie den Wasserhahn und den Schlauch von der Kanüle entfernen.
  10. Entfernen Sie vorsichtig die Kanüle aus der Luftröhre durch Ergreifen der Naht mit einer Pinzette und Halten der Kanüle mit den Fingern. Ziehen Sie den Faden nach unten zum Brusthöhle und der Kanüle zurück in Richtung der Maus die Nase.
  11. Fassen Sie die Luftröhre oder die Nähte mit einer Pinzette und heben die Luftröhre vom Hals Höhle.
  12. Sever die Luftröhre kaudal der Naht verbunden mit einer stumpfen Schere.
  13. Sobald die Tracheein frei ist von den darunter liegenden Geweben, beginnen die Luftröhre von der Maus ziehen. Vorsichtig heben die Lunge aus der Brusthöhle.
  14. Schneiden Sie vorsichtig das Bindegewebe hält die Lungen in der Brusthöhle. Weiter zieht die Luftröhre vom Körper des Maus und gelten stetige Aufwärtskraft beim Schneiden die zugrunde liegenden Verbindungen. Achten Sie darauf, um zu vermeiden, schneiden die Lunge. Man beachte, dass die linke Herz sollte in die Lungen unter Verwendung dieses Verfahrens angebracht werden.
  15. Sobald die Lunge entfernt worden sind, legen Sie sie in 10 ml Formalin.
  16. Entfernen Sie einen Teil der Schwanz der Maus für die Genotypisierung.
  17. Entsorgen Sie die Maus Karkasse nach den geeigneten institutionellen Richtlinien.

4. Zytokin-Bewertung

  1. Zentrifugieren Sie die Vollblut, unter Schritt 2.5 gesammelt, bei 12.000 xg für 5 min um das Serum zu isolieren. Das Serum in einer vormarkiert 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C
  2. Bewerten Sie die serum Cytokinspiegel durch ELISA oder einem ähnlichen Test. Verdünnte Serum von 1.05 bis 1.20 in einer geeigneten Verdünnungspuffer je nach Assay nach den Anweisungen des Herstellers. Diese Verdünnungen sollten empirisch vor dem Ausführen der Großteil der Proben bestimmt werden.
  3. Aufgrund des geringen Volumens der Serum gewonnen Verringerung des Probenvolumens auf die ELISA-Platte mit Halb geladen. Zum Beispiel verwenden die meisten kommerziellen ELISAs 100 ul-Volumina von Standards und Proben. Um Proben, Last 50 ul von Standards und verdünnten Serum sparen pro Vertiefung.
  4. Zentrifuge der BALF in einem gekühlten Tischzentrifuge bei 200 g für 5 min. Übertragen Sie die zellfreie Überstand in zwei vormarkiert 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C
  5. Bewerten BALF Zytokinen durch ELISA oder einem ähnlichen Test ohne Verdünnung.
  6. Nicht verwendete Serum und BALF bei -80 ° C

5. Differentielle Färbung und BAL Zellularität Bewertung

  1. Nach BALF Zentrifugation und vollständige Entfernung HBSS, die Lyse pelletiert roten Blutkörperchen mit hypotonischen Kochsalzlösung. Resuspendieren der Zellen in 900 ul destilliertem Wasser. Sofort im 100 ul von 10x PBS.
  2. Individuell Lyse jede Probe. Wenn Proben enthalten große Mengen an roten Blutzellen können die Zellen in der Tischzentrifuge bei 400 g für 5 min, und die Lyse der roten Blutkörperchen Protokoll kann wiederholt werden pelletiert werden.
  3. Bestimmen Sie die Gesamtzellzahl in der BALF 1 ml Suspension mit einer Hämazytometer unter 10X oder 20-facher Vergrößerung mit Trypan-Blau-Färbung. Bewerten und präsentieren diese Daten als Zellen / ml.
  4. Bereiten Materialien für die Zytospin und Differenz Färbung. Beschriften Sie Standardobjektträger mit einem Bleistift oder lösungsmittelbeständig Stift. Sichern Sie sich die Folien in eine Zytospin Halterung und Trichter. Befestigen Sie die Schieberanordnung in der Zytospin Rotors.
  5. Cytospin 150 ul BALF bei 100 × g für 5 min. Wenn die Zelldichte zu groß ist, um effektivbewerten Zellmorphologie, reduzieren Sie die Lautstärke nach unten auf den Folien gesponnen. Die Objektträger über Nacht trocknen Luft.
  6. Differential färben die Folien produziert nach den Protokollen. Die Objektträger über Nacht trocknen Luft. Deckglas die Folien mit Permount und bewerten die Objektträger unter dem Mikroskop mit 20X und 40X-Objektiv ausgestattet.
  7. Ernte der verbleibenden Zellen für eine nachfolgende Analyse, wie FACS, Elektronenmikroskopie, konfokale Mikroskopie, die RNA-Extraktion zur Genexpression Auswertung und / oder Proteinextraktion für Western Blot.

6. Histopathologie Bewertung

  1. Bereiten Sie die Lunge für die Histopathologie Auswertung. Nach 24-48 h Formalin-Fixierung, ventral orientieren die ganzen aufgeblasenen Lungen und in Paraffin eingebettet. Schneiden Sie die Blöcke, um die daraus resultierenden Hauptstromatemwege freizulegen.
  2. Um die Genauigkeit zu verbessern Scoring, positionieren die Lunge in der gleichen Position und trimmen jeden Block, die maximale Längs Visualisierung von t ergebener Intrapulmonale axialen Hauptatemwege. Von diesem Punkt schneiden 5 Mikron Serienschnitte und Fleck mit Hämatoxylin und Eosin (H & E). Zusätzliche Abschnitte geschnitten und in-situ-Hybridisierung unter Verwendung von Standard-Protokollen vorbereitet werden.
  3. Auswerten Histopathologie unter Verwendung eines semi-quantitativen Bewertungssystem auf der Basis der folgenden Entzündungsparameter, der zwischen 0 (fehlt) und 3 (schwere) erzielt werden: einkernige und polymorphkernige Zellinfiltration; Atemwegsepithelzellen Zell-Hyperplasie und Verletzungen; Extravasation; perivaskuläre und peribroncheolar knuffen; und der Prozentsatz der Lunge mit Entzündung beteiligt. Lung Histopathologie sollte von einem erfahrenen Pathologen ausgewertet werden.
  4. Durchschnittlich alle Parameterwerte, um eine Gesamt Histopathologie Wert zu generieren oder verwenden Einzelwertungen für die spezifische Aspekte der Krankheitsprogression zu quantifizieren. Führen Sie alle Scoring in einer doppelblinden Mode, mit Rezensenten sowohl Genotyp und Behandlung geblendet. Das Scoring-System wurde previously beschrieben 6,7,10.

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Ergebnisse

Die Zellwände von Gram-negativen Bakterien von LPS, die sehr reichlich in der Umgebung besteht. Inhalation von LPS in sensiblen menschlichen Populationen verschlimmert Atemwegs-Reaktivität und kann zur Auslösung einer Immun response11 robust. LPS ist auch eine gemeinsame PAMP im Mausmodell verwendet, um eine robuste angeborene Immunantwort hervorzurufen. In der hier beschriebenen Protokoll erhielten die Mäuse eine Dosis von LPS es isoliert aus E. coli (Serotyp 0111: B4) mit oropharyngealen es Verwaltung. Bei de...

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Diskussion

Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Bewertung der Immunantwort in der Maus Lunge ist wie folgt: 1) wählen Sie die entsprechende Maus-Stamm und Geschlecht für das Modell evaluiert; 2) Optimierung PAMP Lieferung in die Lunge; 3) richtig sammeln und verarbeiten die BALF; und 4) richtig fix und bereiten der Lunge für eine histopathologische Einschätzungen.

Die Auswahl des Maus-Stamm ist ein wichtiger Faktor bei der Bewertung der Immunantwort. C57BL / 6 Mäuse sind in der Regel als die o...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Danksagungen

Die Autoren danken der VA-MD Regional College of Veterinary Medicine für die Bereitstellung von Kern-und technische Unterstützung für dieses Projekt. Diese Arbeit wird durch ein NIH Career Development Award (K01DK092355) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
C57Bl/6JThe Jackson LaboratoryStock 000664
Compact ScaleOhaus Scale Corporation71142845
Kleintier-RektalthermometerBraintree ScientificTH 5
Rektalsonde für NagetiereBraintree ScientificRET 3
OhrlocherBraintreeScientific EP-S 901
Lipopolysaccharid aus E. coli 0111:B4InvivoGenLPS-EB
1x phosphatgepufferte KochsalzlösungLife Technologies10010-023
IsofluranBaxter40032609
Intratrachael Verabreichungs- und LungeninflationsständerICAP Herstellungn/a
Nagetier-IntubationsständerBraintree ScientificRIS 100
Schere (stumpf/scharf)Fisher Scientific13-806-2
Pinzette (gerade)Fisher Scientific22-327-379
Pinzette (45º, gebogen)Fisher Scientific10-275
Schere (stumpf/stumpf)Fisher Scientific08-940
Pipette (200 & Mikro; l Kapazität)GilsonF123601
EthanolSigma459844
1 ml SpritzeBD Medical301025
10 ml SpritzeBD Medical301604
27 G x 0,5 Zoll NadelBD Medical305109
gekühlte MikrozentrifugeFisher Scientific13-100-676
1,2 mm Trachealkanülen mit Luer-AdapterHarvard Apparat732836
Hank's Balanced Salt SolutionLife Technologies14025-076
4-0 Geflochtenes chirurgisches SeidennahtEthiconA183
Luer-zu-Schlauch-VerbindungssätzeHarvard Apparat721406
Luer Hahn KitHarvard Apparat721664
Tygon Formel E-3603 LaborschlauchSigmaR-3603
Formalinlösung, neutral gepuffert, 10%SigmaHT501128-4L
Maus IL-1β OptEIA ELISA KitBD Biosciences559603
Maus IL-6 OptEIA ELISA KitBD Biosciences550950
Maus TNF-α OptEIA ELISA KitBD Biosciences560478
HämozytometerHausser Scientific3520
Hämozytometer-DeckgläserThermo Scientific22-021-801
Trypan BlueThermo ScientificSV3008401
Zytologie-Trichter-ClipsFisher Scientific10-357
Zytologie-TrichterFisher Scientific10-354
FilterkartenFisher Scientific22-030-410
ObjektträgerFisher Scientific12-544-1
DeckgläserFisher Scientific12-540A
Cytospin ZytozentrifugeThermo ScientificA78300003
Diff SchnellfärbesetFisher Scientific
Permount EindeckmediumFisher ScientificSP15-500
47733150

Referenzen

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  2. Egger, C., et al. Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology. PloS one. 8, (2013).
  3. Rayamajhi, M., et al. Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. , (2011).
  4. Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164(2012).
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  8. Kebaier, C., et al. Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome. J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).
  9. Roberts, R. A., et al. Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles. PloS one. 8, (2013).
  10. Willingham, S. B., et al. NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways. J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).
  11. Kline, J. N., et al. Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide. Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).
  12. Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

oropharyngeale intratracheale VerabreichungLPS VerabreichungMausmodellLungenentz ndungZytokinprofilierunghistopathologische BeurteilungLungeninflationEntz ndungsreaktion
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