Methoden werden für die Dünnschicht-Chromatographie (DC) Trennung von Pflanzenextrakten und Kontakt Bioautographie antibakterielle Metaboliten zu identifizieren beschrieben. Die Methoden sind für das Screening von Rotklee phenolischen Verbindungen Hemmung hyper Ammoniak-produzierende Bakterien (HAB) stammt aus dem Rinder-Pansen aufgebracht.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Dünnschicht-Chromatographie-(TLC) Trennungen und Bioassays der Pflanzenextrakte antimikrobielle Verbindungen zu identifizieren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ein gemeinsamer Bildschirm für Pflanzen antimikrobielle Verbindungen besteht aus der Trennung von Pflanzenextrakten Papier oder Dünnschichtchromatographie (TLC oder PC), Aussetzen der Chromatogramme mikrobiellen Suspensionen (z. B. Pilze und Bakterien in der Brühe oder Agar), so dass genügend Zeit für die Mikroben wachsen in einer feuchten Umgebung und Visualisieren Zonen ohne mikrobielle Wachstum. Die Wirksamkeit dieser Screening-Methode, wie Bioautographie bekannt, hängt sowohl von der Qualität der chromatographischen Trennung und der Sorgfalt, mit mikrobiellen Kulturbedingungen behandelt. Dieses Papier beschreibt Standardprotokolle für TLC und Kontakt Bioautographie mit einer neuen Anwendung zu Säure-Fermentation von Bakterien Aminosäuren. Der Extrakt wird über flexible (Aluminium-backed) Kieselgel-DC-Platten getrennt, und die Banden werden unter UV-(UV-) Licht sichtbar gemacht. Zonen werden auf Agar mit dem Testmikroorganismus beimpft geschnitten und inkubiert Gesicht nach unten. Hemmende Banden werden durch Anfärben der Agar-Platte sichtbars mit Tetrazolium rot. Das Verfahren wird auf die Trennung von Rotklee (Trifolium pratense cv. Kenland) phenolischen Verbindungen und ihre Screening-Aktivität gegen Clostridium sticklandii, einem hyper Ammoniak-produzierenden Bakterium (HAB), die ursprünglich aus der Rinder-Pansen aufgebracht. Die TLC-Verfahren anzuwenden, um viele Arten von Pflanzenextrakten und anderen Bakterienspezies (aerob oder anaerob), sowie Pilze, können als Testorganismen verwendet werden, wenn Kulturbedingungen verändert werden, um die Wachstumsanforderungen der Art passen.
Einleitung
Untersuchung auf antimikrobielle Verbindungen in Pflanzen erfordert die Trennung der Komponenten eines Pflanzenextrakts, Belichten eines Testmikroorganismus zu diesen Komponenten und Bestimmen, ob das Wachstum des Mikroorganismus wird von irgendeiner der Verbindungen gehemmt. Trennungen von Papier-oder Dünnschichtchromatographie (TLC oder PC) sind praktisch, weil viele Verbindungen können auf einer ebenen Oberfläche getrennt werden. Trennung auf Polarität basiert, wobei einige Verbindungen feste Bindung an das Adsorbens (Zellulose im Fall von PC, und eine Vielzahl von Adsorptionsmitteln bei der TLC) und die Migration unter anderem 1. Fig. 1
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Herstellung von Pflanzenextrakt
- Siehe Kagan und Flythe 10 für die Extraktion von phenolischen Verbindungen aus Trifolium pratense cv. Kenland.
- Zum anderen Verbindungen in andere Pflanzen zu extrahieren, überprüfen Sie die phytochemical Analyse Literatur für Pflanzen oder Metaboliten-spezifischen Extraktionsmethoden (viele sind beschrieben), oder schauen Sie für Protokolle wie die von Khurram et al. 7,8, die viele Verbindungen mit einem breiten isolieren Bereich von Polaritäten.
2. Herstellung von Dünnschicht-Platten
- Saubere DC-Platten durch die Entwicklung in....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Repräsentative Kieselgel-DC-Trennungen von Rotklee (Trifolium pratense cv. Kenland) Extrakte, mit phenolischen Verbindungen, sind in Abbildung 2 dargestellt. Trennung von Rotklee-Extrakt in Ethylacetat-Hexan (9:1, v / v), mehr als 8,5 cm, ergab fünf Bänder, eines unvollständig vom Ursprung gelöst (Fig. 2A). Allerdings zeigt, 2B, dass etwa doppelt so viele Bands offenbart wurden, wenn eine andere Probe von Rotklee-Extrakt (aus der gleichen Sorte, aber in einem s.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Dieses Protokoll beschreibt ein einfaches Verfahren zum Trennen eines Extrakts in Untergruppen von Verbindungen und Testen dieser Untermengen von Kontakt Bioautographie. Die Methode ist ganz ähnlich wie ein von Chomnawang et al. Verwendet werden, um für 15 Pflanzenstoffe hemmend auf Gonorrhoe-Bakterien zu untersuchen. Die Art der Bioautographie zu Bildschirm für die antimikrobielle Pflanzenstoffe verwendet, hängt von vielen Faktoren, einschließlich der Testmikroorganismus, der Laboraufbau und den Vor.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerzielle Produkte in dem Artikel ist ausschließlich für den Zweck der Bereitstellung von spezifischen Informationen und impliziert nicht, Empfehlung oder Billigung durch den USDA. Die Autoren erklären, keine konkurrierenden Finanz Interesse.
Danksagungen
Wir danken dem späten Dr. Norm Taylor, Abteilung Pflanzen-und Bodenwissenschaften an der Universität von Kentucky, für die Erlaubnis, seine Proben aus Rotklee Grundstücke für diese Studie zu verwenden. Dieses Projekt wurde von der United States Department of Agriculture finanziert.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Silica F254 DC-Platten, Aluminiumkaschiert, 0,2 mm Dicke, 20 cm x 20 cm | EMD Chemicals | 5554/7 | Diese Platten sind mit Silica beschichtet, das einen bei 254 nm fluoreszierenden Indikator enthält. Verbindungen, die bei dieser Wellenlänge absorbieren, erscheinen dunkel auf einem fluoreszierenden grünen Hintergrund. Alternative Quellen sind Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Andere Adsorbentien als Kieselsäure können erforderlich sein. Je nach den zu verwendenden Lösungsmitteln können Platten mit Kunststoffrücken geeignet sein. |
| Scharfe, robuste Schere | beliebiges Nähzubehör | ähnlich Fiskars 175800-1002 | Zum Schneiden von DC-Platten. Ein Papierschneider mit einer scharfen Klinge kann ebenfalls verwendet werden. Quarzstaub nicht einatmen. |
| Trockenschrank bei 100 °; C (mechanische Konvektion) | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
| TLC-Kammer | Kimble Chase | 416180-0000 | Alternative Quellen: Aldrich. Für kleine Teller (z.B. 5 cm x 10 cm) können Pyrex-Becher oder Einmachgläser verwendet werden. Mit Alufolie abdecken (Glasdeckel können Material enthalten, das durch Lösungsmitteldämpfe extrahiert werden kann). |
| 50 & Mikro; l Spritze mit flacher Nadelspitze | Hamilton | 80965 | Zum Laden von Standard- oder Probenmengen von mehr als 5-10 μl. Alternative Quellen sind gleichwertig. |
| Mikropipetten | Drummond | 2-000-001 | Zum Laden kleiner Mengen von Standards oder Proben. Alternative Quellen: VWR. Außerdem können Pasteur-Pipetten mit einem Butanbrenner auf einen dünneren Durchmesser gedehnt werden. |
| Filterpapier (Klasse #1) | Whatman | 1001 917 | Dient als Kammerdocht. Andere Filterpapiersorten sind in Ordnung. Diese Größe kann für die Kammern mit den Tellern 20 cm x 20 cm zugeschnitten werden. |
| Becherzange | Fisher Scientific | 15-186 | Zum Ein- und Ausschieben von Platten in eine große DC-Kammer. Alternative Quellen: VWR |
| Flachpinzette | Fisher Scientific | 10-275 | Zum Ein- und Ausschieben von Platten in eine kleine Kammer. Alternative Quellen: VWR |
| Kleine tragbare UV-Lampe mit 4-W- oder 6-W-Lampen für kurz- und langwellige UV-Lichtbeleuchtung (254 bzw. 365 nm) | Ultraviolet Products | 95-0271-01 | Alternative Quellen: Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
| Sichtschrank zur Verwendung mit einer tragbaren UV-Lampe | Ultraviolet Products | Chromato-Vue C-10E | UV-aktive Bänder lassen sich leichter einkreisen, wenn hier Platten eingesetzt werden können. Alternative Quellen: Spectronics Corporation. |
| Fotodokumentationssystem mit UV-Lampe und sichtbarer Lampe | Kodak | Gel Logic 200 | nbsp; Alternative Quellen: Ultraviolet Products (www.uvp.com). Siehe Protokoll für hausgemachte Alternativen. |
| Anaerobe Kammer, Typ A, Vinyl | Coy | 7150000 | Diese Kammer ist für anaerobe Bakterien, wie Clostridium sticklandii, wie beschrieben, geeignet. Die Wachstumsbedingungen müssen jedoch auf den im Assay verwendeten Organismus zugeschnitten sein. Eine Biosicherheitswerkbank und andere Vorsichtsmaßnahmen sollten getroffen werden, wenn pathogene Organismen verwendet werden. Alternative Quellen: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, andere |
| Tetrazolium red | Sigma-Aldrich | T8877 | Alternative Quellen: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar |
| Ingredients for HAB media | |||
| Pyridoxamine · 2HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | Für dieses und für alle anderen Reagenzien in dieser Tabelle sind alternative Quellen gleichwertig. |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R4500 | |
| Thiamin HCl | Sigma-Aldrich | T3902 | |
| Nicotinamid | Sigma-Aldrich | N3376 | |
| Calcium-D-Pantothenat | Sigma-Aldrich | C8731 | |
| Liponsäure | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| p-Aminobenzoesäure | Sigma-Aldrich | A9878 | |
| Folsäure | Sigma-Aldrich | F8798 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Cobalamin | Sigma-Aldrich | C3607 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P9130 | |
| Pyridoxin | Sigma-Aldrich | P5669 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Eisensulfat & Middot; 7H2O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
| Zinksulfat & Middot; 7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| Manganchlorid & Middot; 4H2O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| Borsäure | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Kobaltchlorid & Middot; 6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Kupferchlorid & Middot; 2H2O | Sigma-Aldrich | ||
| Nickelchlorid & Middot; 6H2 | O Sigma-Aldrich | 203866 | |
| Natriummolybdat & Middot; 2H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Trypticase (Pankreasaufschluss von Kasein) | Thermo Fisher | B11921 | |
| Kaliumphosphat monobasisch wasserfrei | Thermo Fisher | P284 | |
| Natriumcarbonat & Middot; H2O | Thermo Fisher | S636 | |
| Agar | Thermo Fisher | 50841063 | |
| Magnesiumsulfat & Middot; 6H2O | Thermo Fisher | 7791-18-6 | |
| Calciumchlorid & Middot; 2H2O | Thermo Fisher | BP510 | |
| Cystein HCl | Thermo Fisher | 19464780 | |
| Kalium Phosphat zweibasisch wasserfrei | Thermo Fisher | P290 | |
| Natriumchlorid | Thermo Fisher | BP358 |
Referenzen
- Stahl, E., Ashworth, M. R. F. Thin-layer chromatography. , Springer. (1969).
- Marston, A. Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry. J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 Forthcoming.
- Homans, A. L., Fuchs, A.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
