Dünnschicht-Chromatographie-(TLC) Trennungen und Bioassays der Pflanzenextrakte antimikrobielle Verbindungen zu identifizieren

Zusammenfassung

Methoden werden für die Dünnschicht-Chromatographie (DC) Trennung von Pflanzenextrakten und Kontakt Bioautographie antibakterielle Metaboliten zu identifizieren beschrieben. Die Methoden sind für das Screening von Rotklee phenolischen Verbindungen Hemmung hyper Ammoniak-produzierende Bakterien (HAB) stammt aus dem Rinder-Pansen aufgebracht.

Zusammenfassung

Ein gemeinsamer Bildschirm für Pflanzen antimikrobielle Verbindungen besteht aus der Trennung von Pflanzenextrakten Papier oder Dünnschichtchromatographie (TLC oder PC), Aussetzen der Chromatogramme mikrobiellen Suspensionen (z. B. Pilze und Bakterien in der Brühe oder Agar), so dass genügend Zeit für die Mikroben wachsen in einer feuchten Umgebung und Visualisieren Zonen ohne mikrobielle Wachstum. Die Wirksamkeit dieser Screening-Methode, wie Bioautographie bekannt, hängt sowohl von der Qualität der chromatographischen Trennung und der Sorgfalt, mit mikrobiellen Kulturbedingungen behandelt. Dieses Papier beschreibt Standardprotokolle für TLC und Kontakt Bioautographie mit einer neuen Anwendung zu Säure-Fermentation von Bakterien Aminosäuren. Der Extrakt wird über flexible (Aluminium-backed) Kieselgel-DC-Platten getrennt, und die Banden werden unter UV-(UV-) Licht sichtbar gemacht. Zonen werden auf Agar mit dem Testmikroorganismus beimpft geschnitten und inkubiert Gesicht nach unten. Hemmende Banden werden durch Anfärben der Agar-Platte sichtbars mit Tetrazolium rot. Das Verfahren wird auf die Trennung von Rotklee (Trifolium pratense cv. Kenland) phenolischen Verbindungen und ihre Screening-Aktivität gegen Clostridium sticklandii, einem hyper Ammoniak-produzierenden Bakterium (HAB), die ursprünglich aus der Rinder-Pansen aufgebracht. Die TLC-Verfahren anzuwenden, um viele Arten von Pflanzenextrakten und anderen Bakterienspezies (aerob oder anaerob), sowie Pilze, können als Testorganismen verwendet werden, wenn Kulturbedingungen verändert werden, um die Wachstumsanforderungen der Art passen.

Einleitung

Untersuchung auf antimikrobielle Verbindungen in Pflanzen erfordert die Trennung der Komponenten eines Pflanzenextrakts, Belichten eines Testmikroorganismus zu diesen Komponenten und Bestimmen, ob das Wachstum des Mikroorganismus wird von irgendeiner der Verbindungen gehemmt. Trennungen von Papier-oder Dünnschichtchromatographie (TLC oder PC) sind praktisch, weil viele Verbindungen können auf einer ebenen Oberfläche getrennt werden. Trennung auf Polarität basiert, wobei einige Verbindungen feste Bindung an das Adsorbens (Zellulose im Fall von PC, und eine Vielzahl von Adsorptionsmitteln bei der TLC) und die Migration unter anderem ^1. Fig. 1

Protokoll

1. Herstellung von Pflanzenextrakt

1. Siehe Kagan und Flythe ¹⁰ für die Extraktion von phenolischen Verbindungen aus Trifolium pratense cv. Kenland.
2. Zum anderen Verbindungen in andere Pflanzen zu extrahieren, überprüfen Sie die phytochemical Analyse Literatur für Pflanzen oder Metaboliten-spezifischen Extraktionsmethoden (viele sind beschrieben), oder schauen Sie für Protokolle wie die von Khurram et al. ^7,8, die viele Verbindungen mit einem breiten isolieren Bereich von Polaritäten.

2. Herstellung von Dünnschicht-Platten

1. Saubere DC-Platten durch die Entwicklung in....

Ergebnisse

Repräsentative Kieselgel-DC-Trennungen von Rotklee (Trifolium pratense cv. Kenland) Extrakte, mit phenolischen Verbindungen, sind in Abbildung 2 dargestellt. Trennung von Rotklee-Extrakt in Ethylacetat-Hexan (9:1, v / v), mehr als 8,5 cm, ergab fünf Bänder, eines unvollständig vom Ursprung gelöst (Fig. 2A). Allerdings zeigt, 2B, dass etwa doppelt so viele Bands offenbart wurden, wenn eine andere Probe von Rotklee-Extrakt (aus der gleichen Sorte, aber in einem s.......

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt ein einfaches Verfahren zum Trennen eines Extrakts in Untergruppen von Verbindungen und Testen dieser Untermengen von Kontakt Bioautographie. Die Methode ist ganz ähnlich wie ein von Chomnawang et al. Verwendet werden, um für ¹⁵ Pflanzenstoffe hemmend auf Gonorrhoe-Bakterien zu untersuchen. Die Art der Bioautographie zu Bildschirm für die antimikrobielle Pflanzenstoffe verwendet, hängt von vielen Faktoren, einschließlich der Testmikroorganismus, der Laboraufbau und den Vor.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Silica F254 DC-Platten, Aluminiumkaschiert, 0,2 mm Dicke, 20 cm x 20 cm	EMD Chemicals	5554/7	Diese Platten sind mit Silica beschichtet, das einen bei 254 nm fluoreszierenden Indikator enthält. Verbindungen, die bei dieser Wellenlänge absorbieren, erscheinen dunkel auf einem fluoreszierenden grünen Hintergrund. Alternative Quellen sind Analtech, Selecto Scientific, Fluka.  Andere Adsorbentien als Kieselsäure können erforderlich sein. Je nach den zu verwendenden Lösungsmitteln können Platten mit Kunststoffrücken geeignet sein.
Scharfe, robuste Schere	beliebiges Nähzubehör	ähnlich Fiskars 175800-1002	Zum Schneiden von DC-Platten. Ein Papierschneider mit einer scharfen Klinge kann ebenfalls verwendet werden. Quarzstaub nicht einatmen.
Trockenschrank bei 100 °; C (mechanische Konvektion)	Thermo Scientific	PR305225M	Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com)
TLC-Kammer	Kimble Chase	416180-0000	Alternative Quellen:  Aldrich. Für kleine Teller (z.B. 5 cm x 10 cm) können Pyrex-Becher oder Einmachgläser verwendet werden. Mit Alufolie abdecken (Glasdeckel können Material enthalten, das durch Lösungsmitteldämpfe extrahiert werden kann).
50 & Mikro; l Spritze mit flacher Nadelspitze	Hamilton	80965	Zum Laden von Standard- oder Probenmengen von mehr als 5-10 μl.  Alternative Quellen sind gleichwertig.
Mikropipetten	Drummond	2-000-001	Zum Laden kleiner Mengen von Standards oder Proben. Alternative Quellen:  VWR.  Außerdem können Pasteur-Pipetten mit einem Butanbrenner auf einen dünneren Durchmesser gedehnt werden.
Filterpapier (Klasse #1)	Whatman	1001 917	Dient als Kammerdocht.  Andere Filterpapiersorten sind in Ordnung. Diese Größe kann für die Kammern mit den Tellern 20 cm x 20 cm zugeschnitten werden.
Becherzange	Fisher Scientific	15-186	Zum Ein- und Ausschieben von Platten in eine große DC-Kammer. Alternative Quellen: VWR
Flachpinzette	Fisher Scientific	10-275	Zum Ein- und Ausschieben von Platten in eine kleine Kammer. Alternative Quellen: VWR
Kleine tragbare UV-Lampe mit 4-W- oder 6-W-Lampen für kurz- und langwellige UV-Lichtbeleuchtung (254 bzw. 365 nm)	Ultraviolet Products	95-0271-01	Alternative Quellen: Spectronics Corporation (www.spectroline.net)
Sichtschrank zur Verwendung mit einer tragbaren UV-Lampe	Ultraviolet Products	Chromato-Vue C-10E	UV-aktive Bänder lassen sich leichter einkreisen, wenn hier Platten eingesetzt werden können. Alternative Quellen: Spectronics Corporation.
Fotodokumentationssystem mit UV-Lampe und sichtbarer Lampe	Kodak	Gel Logic 200	nbsp; Alternative Quellen: Ultraviolet Products (www.uvp.com).  Siehe Protokoll für hausgemachte Alternativen.
Anaerobe Kammer, Typ A, Vinyl	Coy	7150000	Diese Kammer ist für anaerobe Bakterien, wie Clostridium sticklandii, wie beschrieben, geeignet.   Die Wachstumsbedingungen müssen jedoch auf den im Assay verwendeten Organismus zugeschnitten sein. Eine Biosicherheitswerkbank und andere Vorsichtsmaßnahmen sollten getroffen werden, wenn pathogene Organismen verwendet werden. Alternative Quellen: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, andere
Tetrazolium red	Sigma-Aldrich	T8877	Alternative Quellen: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar
Ingredients for HAB media
Pyridoxamine · 2HCl	Sigma-Aldrich	P9380	Für dieses und für alle anderen Reagenzien in dieser Tabelle sind alternative Quellen gleichwertig.
Riboflavin	Sigma-Aldrich	R4500
Thiamin HCl	Sigma-Aldrich	T3902
Nicotinamid	Sigma-Aldrich	N3376
Calcium-D-Pantothenat	Sigma-Aldrich	C8731
Liponsäure	Sigma-Aldrich	T5625
p-Aminobenzoesäure	Sigma-Aldrich	A9878
Folsäure	Sigma-Aldrich	F8798
Biotin	Sigma-Aldrich	B4639
Cobalamin	Sigma-Aldrich	C3607
Pyridoxal HCl	Sigma-Aldrich	P9130
Pyridoxin	Sigma-Aldrich	P5669
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
Eisensulfat & Middot; 7H2O	Sigma-Aldrich	F8263
Zinksulfat & Middot; 7H2O	Sigma-Aldrich	Z0251
Manganchlorid & Middot; 4H2O	Sigma-Aldrich	M8054
Borsäure	Sigma-Aldrich	B6768
Kobaltchlorid & Middot; 6H2O	Sigma-Aldrich	C8661
Kupferchlorid & Middot; 2H2O	Sigma-Aldrich
Nickelchlorid & Middot; 6H2	O Sigma-Aldrich	203866
Natriummolybdat & Middot; 2H2O	Sigma-Aldrich	331058
Trypticase (Pankreasaufschluss von Kasein)	Thermo Fisher	B11921
Kaliumphosphat monobasisch wasserfrei	Thermo Fisher	P284
Natriumcarbonat & Middot; H2O	Thermo Fisher	S636
Agar	Thermo Fisher	50841063
Magnesiumsulfat & Middot; 6H2O	Thermo Fisher	7791-18-6
Calciumchlorid & Middot; 2H2O	Thermo Fisher	BP510
Cystein HCl	Thermo Fisher	19464780
Kalium Phosphat zweibasisch wasserfrei	Thermo Fisher	P290
Natriumchlorid	Thermo Fisher	BP358