Überwachung Aktivierung der antiviralen Pattern Recognition Receptors RIG-I und PKR durch begrenzte Protease Verdauung und Native PAGE

Ein entscheidendes Ereignis in der antiviralen Wirtsabwehr ist die schnelle Nachweis des Erregers durch die so genannte Mustererkennungsrezeptoren (PRR) ^1,2. Intrazellulären Nachweis von RNA-Virus-Infektion ist abhängig von zwei cytoplasmatischen RNA-Helikasen, RIG-I (Retinsäure-induzierbares Gen-I) und MDA5 (Melanomdifferenzierung-assoziiertes Protein 5) ^3-5. RIG-I besteht aus zwei N-terminalen Caspase-Rekrutierungsdomänen (Karten), einer zentralen DECH-box Typ-RNA-Helikase-Domäne und einer C-terminalen Domäne (CTD) ^4,6 zusammen. Während die CTD und die Helikase-Domäne für die Anerkennung von Nicht-Selbst (viral) RNAs erforderlich, die Karten vermitteln nachgeschalteten Signal der zur Schaffung eines antiviralen Wirts Status.

Wenn RIG-I im stillen Zustand, dh in Abwesenheit von einem bestimmten RNA-Liganden interagiert der zweiten Karte mit der zentralen Helikasedomäne und hält RIG-I in einem Auto-hemmende Konformation ^11.07. RIG-I bindet an kurze doppelsträngigeStrang (ds) RNA trägt ein 5'-Triphosphat (5'PPP), lange dsRNA und PolyU / UC-reiche RNA, klassische Unterschrift Strukturen, die auf die Genome vieler RNA-Viren ^12-16 vorhanden sind. Zwei wichtige Eigenschaften von RIG-I-Aktivierung sind ein Schalter in eine geschlossene Konformation ^6,17 und der Homo-Oligomerisierung ^6,18,19. Die Konformationsänderung Schalter erhöht RNA-Bindung, macht die Karten für nachgeschalteten Signal und rekonstruiert eine aktive ATPase Website ^8,9,11,20. Die Bildung von oligomeren RIG-I-Komplexe führt zu verbesserten Einstellung nachgeschalteten Signaladaptermoleküle, um eine Plattform für antivirale Signaltransduktion ¹¹ zu bilden. Das RIG-I-regulierten Signalkette schließlich aktiviert den Transkriptionsfaktor IRF-3 für die Hochregulierung von Interferon (IFN-alpha/beta)-Gene und damit die Genexpression von Interferon-stimulierten Gene (ISG) für eine volle antivirale Antwort ^21,22 . Eines der am besten charakterisierten ISG ist die RNA-aktivierten Protein-Kinase (PKR) ^23. PKR gehört zur Familie der eukaryontischen Translationsinitiationsfaktors 2 Alpha (eIF2a)-Kinasen und ist aus einem N-terminalen Doppelstrang-RNA-Bindungsdomäne und einer C-terminalen Kinase-Domäne zusammengesetzt. Die Kinasedomäne bildet die Dimerisierung wichtig für PKR-Aktivierung und führt die katalytische Funktion des Proteins. Die Bindung von PKR, um virale dsRNA führt zu dessen Konformationsänderung ermöglicht die Dimerisierung und Auto-Phosphorylierung an Thr 446 unter anderem Rückstände. PKR vermittelt dann die Phosphorylierung von eIF2a, wodurch die Translation viraler mRNAs ^23-27 blockieren.

Sowohl RIG-I und PKR unterziehen großen strukturellen Umlagerungen, bilden oligomere Komplexe und posttranslational durch Phosphorylierung / Dephosphorylierung und Ubiquitinierung ^{10,11,19,23,24,26-29} modifiziert. Für ein besseres Verständnis von der viralen RNA-Strukturen Aktivierung RIG-I und PKR (und in welchem ​​Stadium viralen Antagonisten könnte be stören), ist es wichtig, den Aktivierungszustand genau zu bestimmen. Für beide KFVs wurde zuvor beschrieben, dass die Aktivierung führt zur Entstehung von Trypsin-resistenten Proteinfragmente ^6,17,30 und Oligomeren höherer Ordnung ^6,18,19. Doch angesichts der Fülle von Literatur über diese Schlüsselfaktoren der Reaktion der antiviralen Wirts ^1,2,24, Anwendung der direkten Methoden scheint vergleichsweise selten. In der Hoffnung auf anregende breitere Nutzung, bieten wir bequeme und sensible Protokolle robust analysieren die Aktivierungszustände von RIG-I und PKR. Die IFN zuständigen menschlichen Zelllinie A549 ist mit einem etablierten Aktivator von RIG-I und PKR, der gedämpft Rift-Valley-Fieber-Virus-Mutante Klon 13 (Cl 13) ^31,32 infiziert. Nach einer einfachen Lyseverfahren sind die Extrakte aus infizierten Zellen durch Trypsin-Verdauung begrenzt / Western-Blot-Analyse getestet, um Konformationsänderungen Schalt bewerten und durch blaue nativen Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) / Western Blot analysist, um die Bildung von Oligomeren zu messen.

1. Seeding von A549 Zellen für Infektions

1. Eine T75-Flasche von A549-Zellen zu kultivieren, auf 37 ° C und 5% CO ₂ in Zellkulturmedium (DMEM, ergänzt mit 10% FCS, 526,6 mg / l L-Glutamin, 50.000 U / l Penicillin und 50 mg / l Streptomycin).
2. Vor dem Start, um die Zellen zu ernten, Aufwärmen Zellkulturmedium, PBS und 0,05% Trypsin-EDTA in einem Wasserbad auf 37 ° C erhitzt,
3. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS. Entfernen Sie das PBS wieder.
4. 3 ml Trypsin-EDTA und ebenso in dem Kolben zu verteilen. Übertragen Sie die Flasche in einem Inkubator mit 37 ° C und 5% CO _2.
5. Wenn alle Zellen abgelöst werden, 7 ml Zellkulturmedium resuspendieren, und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen.
6. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 g für 5 min bei RT, entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 10 ml frischem Zellkulturmedium.
7. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer.
8. Add 2,5 x 10 ⁶ Zellen in 5 ml Zellkulturmedium in zwei T25-Kolben mit jeweils. Inkubation für 16 Stunden bei 37 ° C und 5% CO _2. Ein Kolben dient der Scheinkontrolle und eine für Cl 13-Infektion.

2. Infektion mit Rift-Valley-Fieber-Virus Clone 13 (Cl 13)

1. HINWEIS: Cl 13 ist eine abgeschwächte Virus-Mutante, die in Deutschland unter BSL-2-Bedingungen behandelt werden. Bitte auf die jeweiligen nationalen Richtlinien. Weitere typische IFN-Induktoren würde Sendai Virus (Stamm Cantell) oder Newcastle-Krankheit Virus sein.
2. Vorwärmen PBS, Serum-freien Medium und Zellkulturmedium mit 5% FCS.
3. Planen 1,25 x 10 ⁷ PFU / ml Cl 13 in serumfreiem Medium auf 2,5 x 10 ⁶ A549-Zellen mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 5 infiziert. Vorbereiten einer leicht (etwa 10%) größeren Menge als nötig, um Rechenschaft Pipettenfehler.
4. Waschen der Zellen mit PBS, wie unter 1.3 beschrieben.
5. 1 ml der Verdünnung oder Cl 13Serum-freies Medium (infizierte Kontroll, mock) zu den Zellen und Inkubation für 1 h bei 37 ° C und 5% CO _2. 15 min bewegen den Kolben sorgfältig zu Gleichverteilung der Cl 13 Verdünnung und serumfreien Medium zu gewährleisten sind.
6. Nach 1 Stunde der Infektion, entfernen Sie die Inokula, 5 ml vorgewärmten Zellkulturmedium mit 5% FCS und Inkubation für 5 Stunden bei 37 ° C und 5% CO _2.

3. Herstellung von Zelllysaten

1. Vorbereitung PBS / 0,5% Triton X-100 bei 4 ° C Fügen Sie nicht Serin-Protease-Inhibitoren.
2. Waschen Sie die Zellen mit kaltem PBS und 10 ml frischem PBS.
3. Kratzen Sie die Zellen aus, übertragen Sie die Zellsuspension in einem Falcon-Röhrchen und-Zentrifuge bei 800 g für 5 min bei RT.
4. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in 30 &mgr; l PBS / 0,5% Triton X-100. Übertragen Sie das Lysat in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen und Inkubation für mindestens 10 min bei 4 ° C
5. Zentrifugieren Sie das Lysat um 10.00 Uhr0 g für 10 min bei 4 ° C und übertragen die geklärte Zelllysat (Überstand) in ein frisches Röhrchen.
6. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration nach Bradford, wie an anderer Stelle ³³ beschrieben.
7. Lagerung bei -20 ° C oder fahren Sie mit Trypsin-Verdauung (4.1) oder native PAGE (5.1).

4. Bestimmung von Konformationsänderungen von Pattern Recognition Receptors

1. TPCK-Trypsin-Behandlung von Zelllysaten
   1. Verdünnen L-1-tosylamido-2-phenylethyl-chlormethylketon behandelt (TPCK)-Trypsin in PBS bis zu einer endgültigen Arbeitskonzentration von 2 ug / ul.
   2. Einstellen in zwei neue Schläuche eine Protein-Endkonzentration von 25 &mgr; g jedes Proteins Lysat (mock oder Cl 13) in einem Endvolumen von 9 ul mit PBS. Daher sollte es vier Röhrchen mit je 25 ug Lysat zweimal Mock und zweimal Cl 13-Infektion. Ein als Eingangskontrolle (unbehandelt) und ein Satz für die Behandlung mit TPCK-Trypsin gesetzt.
   3. 1 &mgr; l PBS (unbehandelt)oder 1 &mgr; l 2 &mgr; g / &mgr; l Trypsin-TPCK (Endkonzentration: 0,2 ug / ul) zu den Zelllysaten und mischen die Reaktionen durch Pipettieren. Einfrieren und auftauen TPCK-Trypsin-Aliquots, denn es wird die Effizienz der Verdauung beeinträchtigen.
   4. Die Lysate bei 37 ° C für 25 min. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 5x denaturierenden Probenpuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% Glycerin, 25% β-Mercaptoethanol, 0,5% Bromphenolblau) und durch Kochen für 5 min bei 95 ° C. Es ist wichtig, nicht das Trypsin Inkubationszeit verlängern. Falls keine Protease-resistenten Fragmente nachweisbar sind, muß die Zeit der Trypsin-Verdau verkürzt werden.
   5. Nach dem Kochen können die Proben bei -20 ° C gelagert werden
2. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und Western Blotting
   1. Laden der Proben auf einem Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gel mit einem 5% igen Sammelgel in einem 12% Trenngel. Trennen Sie die Proteine ​​bei 25 mA pro Gel, bisdie Bromphenolblau abläuft.
   2. Aktivieren einer Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran für 30 Sekunden mit Methanol und steckte es in Transferpuffer (48 mM Tris, 39 mM Glycin, 1,3 mM SDS, 20% Methanol).
   3. Vorbereitung der Blot mit einem halbtrockenen Blotting-Systems und erlauben den Transfer der Proteine ​​bei 10 V für 1 Stunde. Nehmen Sie die Membran aus, spülen Sie es kurz mit Wasser und trocknen lassen.
   4. Reaktivieren Sie die Membran kurz in Methanol übertragen. Für 5 min mit TBS waschen. Block mit 10% Magermilch in TBS für 1 h bei RT oder bei 4 ° CO / N Für jeden mit TBS 5 min Waschen Sie die Membran 3x.
   5. Antikörperverdünnung herzustellen, wie in Tabelle 1 empfohlen und Inkubation der Membran für 1 h bei RT oder bei 4 ° CO / N
   6. Für jeden mit TBS-T 10 min Waschen Sie die Membran 3x. Fügen Sie den entsprechenden sekundären Antikörper bei einer 1:20.000 Verdünnung in 1% Magermilch in TBS, gekoppelt mit Meerrettich-Peroxidase. Inkubieren 45 min bei RT.
   7. Für jeden mit TBS-T 10 min Waschen Sie die Membran 3x, und one zusätzliche Zeit mit TBS.
   8. Für Signalerkennung verwenden Kommerzielle Chemilumineszenz-Kit und eine digitale Gel Imaging System.
3. Coomassie Brilliant Blue G-250 Färbung
   1. Führen SDS-PAGE, wie in 4.2.1 beschrieben. Laden Sie die Proben auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel und führen Sie das Gel bei 25 mA pro Gel, bis Bromphenolblau abläuft.
   2. Führen Coomassie Brilliant Blue G-250-Färbung bei RT. Haben alle Inkubationen unter ständigem Schütteln.
   3. Übertragen des Gels an der Fixierungslösung, die 40% Methanol und 10% Essigsäure für 30 min.
   4. Tauschen Sie den Puffer in Entfärbelösung (25% Ethanol und 8% Essigsäure) und Inkubation für 5 min.
   5. Flecken des Gels mit 0,2% Coomassie Brillant-Blue G-250 in 40% Methanol und 10% Essigsäure für 1 Stunde.
   6. Entfärben des Gels mit der Entfärbelösung und Austausch des Puffers nach 10 min, 30 min und 60 min.
   7. Speichert das Gel in 25% Ethanol, 8% Essigsäure und 4% Glycerin bei 4 ° C. Führen Abbildung und Analyse wie unter 4.2.8 beschrieben.

5. Analyse der Oligomere Staaten von Pattern Recognition Receptors

1. Native PAGE
   1. Vorbereitung 50 &mgr; g Zelllysat in einem Endvolumen von 10 ul mit PBS und mit 5 × nativen Probenpuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 1% Natriumdeoxycholat, 50% Glycerin, 0,5% Bromphenolblau) auf eine Endkonzentration von 1x.
   2. Laden Sie die Proben sofort auf einem nativen Polyacrylamid-Gel mit 5%, wie das Stapeln und 8% Trenngel. Jede Verzögerung wird zu einem Verlust der nativen Komplexe ³⁴ führen.
   3. Die Elektrophorese bei 20 mA pro Gel bei 4 ° C mit 50 mM Tris-NaOH pH 9,0, 384 mM Glycin als Anode und als 50 mM Tris pH 8,3, 384 mM Glycin, 1% Natriumdesoxycholat als Kathodenpuffer. Nach 1,5-2 h (Bromphenolblau Band hat das Gel ca. 45 min früher links) die Elektrophorese beendet.
2. Western-Blotting
   1. Aktivieren Sie einen polyvinylidene (PVDF)-Membran für 30 Sekunden mit Methanol und sie in Towbin-Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS, 20% Methanol).
   2. Montieren Sie einen nassen Fleck Kammer gemäß den Anweisungen des Herstellers und füllen den Tank mit Towin Puffer.
   3. Führen die Blotting mit 250 mA für 1,5 h bei 4 ° C.
   4. Beim Lösch wird, gehen Sie wie von 4.2.3 beschrieben beendet.

Die Anerkennung eines viralen Agonist von RIG-I oder PKR Konformationsänderung löst Schalt 6,17,30 und Oligomerisierung 6,18,27. Wir haben untersucht, diese beiden Aktivierungsmarker durch begrenzte Protease-Verdau und native Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) auf.

Humanen A549-Zellen wurden mit Rift-Valley-Fieber-Virus-Klon 13 (Cl 13), die durch eine Mutation des IFN-Antagonisten 35,36 NSs dadurch infiziert ist. Aufgrund der Abwesenheit von Funktions NSs, Klon 13 stark induziert RIG-I und PKR, die zur Einrichtung eines robusten antiviralen Zustand in den Zellen 12,31,32,37.

Trypsin Verdauung von mock infizierten Zelllysaten führt zu einem schnellen Abbau von RIG-I, während Cl 13 Infektion führt zu der Erzeugung eines 30 kDa beständig RIG-I-Fragment 1A. PKR zeigt auch teilweise Resistenz gegenüber Trypsin-Verdau in infizierten Proben, die zusammenfällt mit seiner Phosphorylation 1A. Um die Effizienz und Spezifität von Trypsin Verdauung zu überwachen, wurden die Gele mit Coomassie Brilliant Blue G-250 angefärbt. Unbehandelte Proben zeigen gleiche Mengen von Proteinen geladen 1B. Unterziehen Mock-und Cl-13 Zelllysaten Trypsin Verdauung führt zu einem vergleichbaren Rückgang der globalen Proteinmengen. Dies zeigt, dass Trypsin-Behandlung hat die gleiche Effizienz für Mock-und Cl-13-infizierten Proben.

Die Bildung von oligomeren Komplexen wurde durch native PAGE untersucht. In nicht-infizierten Zellen wurden nur Monomere RIG-I und Fig. 2 PKR erkannt. Als zusätzliche Kontrolle wir waren die Transkriptionsfaktors IRF-3, der als Monomer vorliegt, sondern über z. B. bekannt, RIG-I 38 bei Aktivierung dimerisiert ist. Cl 13-Infektion führt zu einer starken Anreicherung von RIG-I oligomeren Komplexen in Form einer Wisch-und der PKR und IRF-3-Dimere / Oligomere als definierte Proteinbande.

class = "jove_content"> Diese Ergebnisse zeigen, dass begrenzte Trypsin Verdauung und native PAGE sind nützliche Werkzeuge, um Konformationsänderungen und Oligomeren Bildung von RIG-I und PKR bei der Infektion zu überwachen.

Abbildung 1. Konformationswechsel von RIG-I und PKR. A549-Zellen wurden mock infizierten oder mit Cl 13 bei einer MOI von 5 infiziert. Nach 5 h wurden die Zellen in PBS lysiert, ergänzt mit 0,5% Triton X-100 und gelöscht wurden Zelllysate entweder unbehandelt oder mit Trypsin behandelt. Proben wurden auf SDS-PAGE gefolgt von Western Blot (A) Coomassie-Färbung oder (B) unterzogen. Blots wurden gegen RIG-I, PKR PKR phosphoryliert (Thr 446) und gegen RVFV Nukleoprotein (RVFV N) und beta-Aktin als Infektion und Ladekontrolle bzw. gefärbt._blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Oligomerisierung von RIG-I, PKR und IRF-3. Zelllysate von Mock-und Cl-13-infizierten Zelllysaten wurden native PAGE gefolgt von Western-Blot-Analyse unterzogen. Färbung mit Antikörpern gegen RIG-I, PKR, IRF-3 und beta-Aktin als Ladekontrolle durchgeführt. PKR Oligomere stellen wahrscheinlich Dimere 27. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Keine Interessenskonflikte erklärt.