Methodenartikel

Überwachung Aktivierung der antiviralen Pattern Recognition Receptors RIG-I und PKR durch begrenzte Protease Verdauung und Native PAGE

DOI:

10.3791/51415

⸱

29. Juli 2014

 , 
1Institute for Virology, Philipps-University Marburg

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Angeborene Abwehr von Virus-Infektionen werden durch Mustererkennungsrezeptoren (PRR) ausgelöst. Die beiden zytoplasmatischen PRRs RIG-I und PKR binden an viralen RNAs Unterschrift, ändern Konformation oligomerisieren, und aktivieren antivirale Signalisierung. Es werden Methoden beschrieben, die um die Konformationsänderungen Schalten und die Oligomerisierung dieser zytoplasmatischen PRRs bequem überwachen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirtsabwehr Virus-Infektion sind abhängig von einer schnellen Erkennung von Mustererkennungsrezeptoren (PRR) des angeborenen Immunsystems. Im Zytoplasma PRRS RIG-I und PKR binden an spezifische virale RNA-Liganden. Dies vermittelt ersten Konformationsänderung Schalt-und Oligomerisierung, und dann können die Aktivierung eines antiviralen Interferon-Antwort. Während Methoden zur antiviralen Wirts Genexpression zu messen sind gut etabliert, Methoden, um die Aktivierungszustände von RIG-I und PKR direkt zu überwachen sind nur teilweise und weniger gut etabliert.

Hier beschreiben wir zwei Methoden, um RIG-I und PKR Stimulation bei der Infektion mit einem etablierten Interferon-Induktor, der Rift-Valley-Fieber-Virus-Mutante Klon 13 (Cl 13) zu überwachen. Begrenzte Trypsin Verdauung ermöglicht Änderungen der Proteaseempfindlichkeit zu analysieren, was auf Konformationsänderungen des PRRS. Trypsin Verdauung von Lysaten aus mock-infizierten Zellen führt zu einem schnellen Abbau von RIG-I und PKR, whereas Cl 13 Infektion führt zu der Entstehung eines Protease-resistenten RIG-I-Fragment. PKR auch eine Virus-induzierte Teilwiderstand Trypsin Verdauung, die mit ihrem Stempel Phosphorylierung an Thr 446 zusammenfällt. Die Bildung von RIG-I und PKR Oligomere wurde durch native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) bestätigt. Bei Infektion, gibt es eine starke Anhäufung von RIG-I und PKR oligomeren Komplexen, während diese Proteine ​​blieb als Monomere in mock infizierten Proben.

Begrenzte Proteaseverdau und native PAGE, sowohl für Western-Blot-Analyse gekoppelt sind, erlauben eine sensible und direkte Messung von zwei verschiedenen Schritte des RIG-I und PKR-Aktivierung. Diese Techniken sind relativ einfach und schnell durchzuführen und keine teure Ausrüstung.

Einleitung

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Ein entscheidendes Ereignis in der antiviralen Wirtsabwehr ist die schnelle Nachweis des Erregers durch die so genannte Mustererkennungsrezeptoren (PRR) 1,2. Intrazellulären Nachweis von RNA-Virus-Infektion ist abhängig von zwei cytoplasmatischen RNA-Helikasen, RIG-I (Retinsäure-induzierbares Gen-I) und MDA5 (Melanomdifferenzierung-assoziiertes Protein 5) 3-5. RIG-I besteht aus zwei N-terminalen Caspase-Rekrutierungsdomänen (Karten), einer zentralen DECH-box Typ-RNA-Helikase-Domäne und einer C-terminalen Domäne (CTD) 4,6 zusammen. Während die CTD und die Helikase-Domäne für die Anerkennung von Nicht-Selbst (viral) RNAs erforderlich, die Karten vermitteln nachgeschalteten Signal der zur Schaffung eines antiviralen Wirts Status.

Wenn RIG-I im stillen Zustand, dh in Abwesenheit von einem bestimmten RNA-Liganden interagiert der zweiten Karte mit der zentralen Helikasedomäne und hält RIG-I in einem Auto-hemmende Konformation 11.07. RIG-I bindet an kurze doppelsträngigeStrang (ds) RNA trägt ein 5'-Triphosphat (5'PPP), lange dsRNA und PolyU / UC-reiche RNA, klassische Unterschrift Strukturen, die auf die Genome vieler RNA-Viren 12-16 vorhanden sind. Zwei wichtige Eigenschaften von RIG-I-Aktivierung sind ein Schalter in eine geschlossene Konformation 6,17 und der Homo-Oligomerisierung 6,18,19. Die Konformationsänderung Schalter erhöht RNA-Bindung, macht die Karten für nachgeschalteten Signal und rekonstruiert eine aktive ATPase Website 8,9,11,20. Die Bildung von oligomeren RIG-I-Komplexe führt zu verbesserten Einstellung nachgeschalteten Signaladaptermoleküle, um eine Plattform für antivirale Signaltransduktion 11 zu bilden. Das RIG-I-regulierten Signalkette schließlich aktiviert den Transkriptionsfaktor IRF-3 für die Hochregulierung von Interferon (IFN-alpha/beta)-Gene und damit die Genexpression von Interferon-stimulierten Gene (ISG) für eine volle antivirale Antwort 21,22 . Eines der am besten charakterisierten ISG ist die RNA-aktivierten Protein-Kinase (PKR) 23. PKR gehört zur Familie der eukaryontischen Translationsinitiationsfaktors 2 Alpha (eIF2a)-Kinasen und ist aus einem N-terminalen Doppelstrang-RNA-Bindungsdomäne und einer C-terminalen Kinase-Domäne zusammengesetzt. Die Kinasedomäne bildet die Dimerisierung wichtig für PKR-Aktivierung und führt die katalytische Funktion des Proteins. Die Bindung von PKR, um virale dsRNA führt zu dessen Konformationsänderung ermöglicht die Dimerisierung und Auto-Phosphorylierung an Thr 446 unter anderem Rückstände. PKR vermittelt dann die Phosphorylierung von eIF2a, wodurch die Translation viraler mRNAs 23-27 blockieren.

Sowohl RIG-I und PKR unterziehen großen strukturellen Umlagerungen, bilden oligomere Komplexe und posttranslational durch Phosphorylierung / Dephosphorylierung und Ubiquitinierung 10,11,19,23,24,26-29 modifiziert. Für ein besseres Verständnis von der viralen RNA-Strukturen Aktivierung RIG-I und PKR (und in welchem ​​Stadium viralen Antagonisten könnte be stören), ist es wichtig, den Aktivierungszustand genau zu bestimmen. Für beide KFVs wurde zuvor beschrieben, dass die Aktivierung führt zur Entstehung von Trypsin-resistenten Proteinfragmente 6,17,30 und Oligomeren höherer Ordnung 6,18,19. Doch angesichts der Fülle von Literatur über diese Schlüsselfaktoren der Reaktion der antiviralen Wirts 1,2,24, Anwendung der direkten Methoden scheint vergleichsweise selten. In der Hoffnung auf anregende breitere Nutzung, bieten wir bequeme und sensible Protokolle robust analysieren die Aktivierungszustände von RIG-I und PKR. Die IFN zuständigen menschlichen Zelllinie A549 ist mit einem etablierten Aktivator von RIG-I und PKR, der gedämpft Rift-Valley-Fieber-Virus-Mutante Klon 13 (Cl 13) 31,32 infiziert. Nach einer einfachen Lyseverfahren sind die Extrakte aus infizierten Zellen durch Trypsin-Verdauung begrenzt / Western-Blot-Analyse getestet, um Konformationsänderungen Schalt bewerten und durch blaue nativen Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) / Western Blot analysist, um die Bildung von Oligomeren zu messen.

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Protokoll

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1. Seeding von A549 Zellen für Infektions

  1. Eine T75-Flasche von A549-Zellen zu kultivieren, auf 37 ° C und 5% CO 2 in Zellkulturmedium (DMEM, ergänzt mit 10% FCS, 526,6 mg / l L-Glutamin, 50.000 U / l Penicillin und 50 mg / l Streptomycin).
  2. Vor dem Start, um die Zellen zu ernten, Aufwärmen Zellkulturmedium, PBS und 0,05% Trypsin-EDTA in einem Wasserbad auf 37 ° C erhitzt,
  3. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS. Entfernen Sie das PBS wieder.
  4. 3 ml Trypsin-EDTA und ebenso in dem Kolben zu verteilen. Übertragen Sie die Flasche in einem Inkubator mit 37 ° C und 5% CO 2.
  5. Wenn alle Zellen abgelöst werden, 7 ml Zellkulturmedium resuspendieren, und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen.
  6. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 g für 5 min bei RT, entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 10 ml frischem Zellkulturmedium.
  7. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer.
  8. Add 2,5 x 10 6 Zellen in 5 ml Zellkulturmedium in zwei T25-Kolben mit jeweils. Inkubation für 16 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. Ein Kolben dient der Scheinkontrolle und eine für Cl 13-Infektion.

2. Infektion mit Rift-Valley-Fieber-Virus Clone 13 (Cl 13)

  1. HINWEIS: Cl 13 ist eine abgeschwächte Virus-Mutante, die in Deutschland unter BSL-2-Bedingungen behandelt werden. Bitte auf die jeweiligen nationalen Richtlinien. Weitere typische IFN-Induktoren würde Sendai Virus (Stamm Cantell) oder Newcastle-Krankheit Virus sein.
  2. Vorwärmen PBS, Serum-freien Medium und Zellkulturmedium mit 5% FCS.
  3. Planen 1,25 x 10 7 PFU / ml Cl 13 in serumfreiem Medium auf 2,5 x 10 6 A549-Zellen mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 5 infiziert. Vorbereiten einer leicht (etwa 10%) größeren Menge als nötig, um Rechenschaft Pipettenfehler.
  4. Waschen der Zellen mit PBS, wie unter 1.3 beschrieben.
  5. 1 ml der Verdünnung oder Cl 13Serum-freies Medium (infizierte Kontroll, mock) zu den Zellen und Inkubation für 1 h bei 37 ° C und 5% CO 2. 15 min bewegen den Kolben sorgfältig zu Gleichverteilung der Cl 13 Verdünnung und serumfreien Medium zu gewährleisten sind.
  6. Nach 1 Stunde der Infektion, entfernen Sie die Inokula, 5 ml vorgewärmten Zellkulturmedium mit 5% FCS und Inkubation für 5 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2.

3. Herstellung von Zelllysaten

  1. Vorbereitung PBS / 0,5% Triton X-100 bei 4 ° C Fügen Sie nicht Serin-Protease-Inhibitoren.
  2. Waschen Sie die Zellen mit kaltem PBS und 10 ml frischem PBS.
  3. Kratzen Sie die Zellen aus, übertragen Sie die Zellsuspension in einem Falcon-Röhrchen und-Zentrifuge bei 800 g für 5 min bei RT.
  4. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in 30 &mgr; l PBS / 0,5% Triton X-100. Übertragen Sie das Lysat in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen und Inkubation für mindestens 10 min bei 4 ° C
  5. Zentrifugieren Sie das Lysat um 10.00 Uhr0 g für 10 min bei 4 ° C und übertragen die geklärte Zelllysat (Überstand) in ein frisches Röhrchen.
  6. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration nach Bradford, wie an anderer Stelle 33 beschrieben.
  7. Lagerung bei -20 ° C oder fahren Sie mit Trypsin-Verdauung (4.1) oder native PAGE (5.1).

4. Bestimmung von Konformationsänderungen von Pattern Recognition Receptors

  1. TPCK-Trypsin-Behandlung von Zelllysaten
    1. Verdünnen L-1-tosylamido-2-phenylethyl-chlormethylketon behandelt (TPCK)-Trypsin in PBS bis zu einer endgültigen Arbeitskonzentration von 2 ug / ul.
    2. Einstellen in zwei neue Schläuche eine Protein-Endkonzentration von 25 &mgr; g jedes Proteins Lysat (mock oder Cl 13) in einem Endvolumen von 9 ul mit PBS. Daher sollte es vier Röhrchen mit je 25 ug Lysat zweimal Mock und zweimal Cl 13-Infektion. Ein als Eingangskontrolle (unbehandelt) und ein Satz für die Behandlung mit TPCK-Trypsin gesetzt.
    3. 1 &mgr; l PBS (unbehandelt)oder 1 &mgr; l 2 &mgr; g / &mgr; l Trypsin-TPCK (Endkonzentration: 0,2 ug / ul) zu den Zelllysaten und mischen die Reaktionen durch Pipettieren. Einfrieren und auftauen TPCK-Trypsin-Aliquots, denn es wird die Effizienz der Verdauung beeinträchtigen.
    4. Die Lysate bei 37 ° C für 25 min. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 5x denaturierenden Probenpuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% Glycerin, 25% β-Mercaptoethanol, 0,5% Bromphenolblau) und durch Kochen für 5 min bei 95 ° C. Es ist wichtig, nicht das Trypsin Inkubationszeit verlängern. Falls keine Protease-resistenten Fragmente nachweisbar sind, muß die Zeit der Trypsin-Verdau verkürzt werden.
    5. Nach dem Kochen können die Proben bei -20 ° C gelagert werden
  2. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und Western Blotting
    1. Laden der Proben auf einem Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gel mit einem 5% igen Sammelgel in einem 12% Trenngel. Trennen Sie die Proteine ​​bei 25 mA pro Gel, bisdie Bromphenolblau abläuft.
    2. Aktivieren einer Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran für 30 Sekunden mit Methanol und steckte es in Transferpuffer (48 mM Tris, 39 mM Glycin, 1,3 mM SDS, 20% Methanol).
    3. Vorbereitung der Blot mit einem halbtrockenen Blotting-Systems und erlauben den Transfer der Proteine ​​bei 10 V für 1 Stunde. Nehmen Sie die Membran aus, spülen Sie es kurz mit Wasser und trocknen lassen.
    4. Reaktivieren Sie die Membran kurz in Methanol übertragen. Für 5 min mit TBS waschen. Block mit 10% Magermilch in TBS für 1 h bei RT oder bei 4 ° CO / N Für jeden mit TBS 5 min Waschen Sie die Membran 3x.
    5. Antikörperverdünnung herzustellen, wie in Tabelle 1 empfohlen und Inkubation der Membran für 1 h bei RT oder bei 4 ° CO / N
    6. Für jeden mit TBS-T 10 min Waschen Sie die Membran 3x. Fügen Sie den entsprechenden sekundären Antikörper bei einer 1:20.000 Verdünnung in 1% Magermilch in TBS, gekoppelt mit Meerrettich-Peroxidase. Inkubieren 45 min bei RT.
    7. Für jeden mit TBS-T 10 min Waschen Sie die Membran 3x, und one zusätzliche Zeit mit TBS.
    8. Für Signalerkennung verwenden Kommerzielle Chemilumineszenz-Kit und eine digitale Gel Imaging System.
  3. Coomassie Brilliant Blue G-250 Färbung
    1. Führen SDS-PAGE, wie in 4.2.1 beschrieben. Laden Sie die Proben auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel und führen Sie das Gel bei 25 mA pro Gel, bis Bromphenolblau abläuft.
    2. Führen Coomassie Brilliant Blue G-250-Färbung bei RT. Haben alle Inkubationen unter ständigem Schütteln.
    3. Übertragen des Gels an der Fixierungslösung, die 40% Methanol und 10% Essigsäure für 30 min.
    4. Tauschen Sie den Puffer in Entfärbelösung (25% Ethanol und 8% Essigsäure) und Inkubation für 5 min.
    5. Flecken des Gels mit 0,2% Coomassie Brillant-Blue G-250 in 40% Methanol und 10% Essigsäure für 1 Stunde.
    6. Entfärben des Gels mit der Entfärbelösung und Austausch des Puffers nach 10 min, 30 min und 60 min.
    7. Speichert das Gel in 25% Ethanol, 8% Essigsäure und 4% Glycerin bei 4 ° C.
    8. Führen Abbildung und Analyse wie unter 4.2.8 beschrieben.

5. Analyse der Oligomere Staaten von Pattern Recognition Receptors

  1. Native PAGE
    1. Vorbereitung 50 &mgr; g Zelllysat in einem Endvolumen von 10 ul mit PBS und mit 5 × nativen Probenpuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 1% Natriumdeoxycholat, 50% Glycerin, 0,5% Bromphenolblau) auf eine Endkonzentration von 1x.
    2. Laden Sie die Proben sofort auf einem nativen Polyacrylamid-Gel mit 5%, wie das Stapeln und 8% Trenngel. Jede Verzögerung wird zu einem Verlust der nativen Komplexe 34 führen.
    3. Die Elektrophorese bei 20 mA pro Gel bei 4 ° C mit 50 mM Tris-NaOH pH 9,0, 384 mM Glycin als Anode und als 50 mM Tris pH 8,3, 384 mM Glycin, 1% Natriumdesoxycholat als Kathodenpuffer. Nach 1,5-2 h (Bromphenolblau Band hat das Gel ca. 45 min früher links) die Elektrophorese beendet.
  2. Western-Blotting
    1. Aktivieren Sie einen polyvinylidene (PVDF)-Membran für 30 Sekunden mit Methanol und sie in Towbin-Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS, 20% Methanol).
    2. Montieren Sie einen nassen Fleck Kammer gemäß den Anweisungen des Herstellers und füllen den Tank mit Towin Puffer.
    3. Führen die Blotting mit 250 mA für 1,5 h bei 4 ° C.
    4. Beim Lösch wird, gehen Sie wie von 4.2.3 beschrieben beendet.

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Ergebnisse

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Die Anerkennung eines viralen Agonist von RIG-I oder PKR Konformationsänderung löst Schalt 6,17,30 und Oligomerisierung 6,18,27. Wir haben untersucht, diese beiden Aktivierungsmarker durch begrenzte Protease-Verdau und native Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) auf.

Humanen A549-Zellen wurden mit Rift-Valley-Fieber-Virus-Klon 13 (Cl 13), die durch eine Mutation des IFN-Antagonisten 35,36 NSs dadurch infiziert ist. Aufgrund der Abwesenheit von Funktions NSs,...

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Diskussion

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Erfassen der Anwesenheit von Viren und die Aktivierung des antiviralen Typ I IFN-Systems sind entscheidend für eine erfolgreiche angeborenen Immunantworten 22. Virenerkennung wird dabei durch Erreger recognition receptors (PRR), wie RIG-I und PKR vermittelte, was eine schnelle Reaktion und Aktivierung der antiviralen Abwehrmechanismen. Hier beschreiben wir zwei Methoden, um den Aktivierungsstatus des RIG-I und PKR direkt auswerten.

Begrenzte Proteaseverdau als Werkzeug, um Konform...

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Offenlegungen

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Alejandro Brun von KAG-INIA für die Bereitstellung von Anti-Virus Rift Valley Fieber Seren. Die Arbeit in unseren Labors wird durch Forschungsförderung gem unterstützt. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Gießen und Marburg, die Leibniz Graduate School für Schwellen-Viruserkrankungen (EIDIS), dem DFG-Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, und die DFG-Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

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Materialien

ChemikalienAntikörper

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Zellkultur
Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium (DMEM)Gibco21969-035
OptiMEMGibco31985-47
L-GlutaminPAA25030-024
Penicillin-StreptomycinPAA15070-063
Fötales Kälberserum (FCS)PAA10270
0,05% Trypsin-EDTAGibco25300-054<
L-1-tosylamido-2-phenylethylchlormethylketon-behandelt (TPCK) TrypsinSigma AldrichT1426<
monoklonaler Anti-RIG-I-Antikörper (ALME-1)Enzo Life SciencesALX-804-849-C100WB: 1:500 in 1% Magermilch in TBS
Maus monoklonale Anti-PKR (B10)Santa Cruzsc-6282WB: 1:500 in 1 % Magermilch in TBS
Kaninchen monoklonale Anti-P-PKR (Thr446)Epitomics1120-1WB: 1:1.000 in 5 % BSA in TBS
Kaninchen polyklonale Anti-IRF-3Santa Cruzsc-9082WB: 1:500 in 1 % Magermilch in TBS
Kaninchen monoklonale Anti-P-IRF-3 (Ser386)IBLog-413WB: 1:100 in 1 % Magermilch in TBS
Kaninchen-Anti-RVFV-Hyperimmunserum "C2" (MP-12)Mit freundlicher Verfügung von Alejandro Brun CISA-INIAWB: 1:2.000 in 1 % Magermilch in TBS
Monoklonales Maus-Anti-Beta-Aktin (8H10D10)Zellsignalisierung3700WB: 1:1.000 in 1 % Magermilch in TBS
Polyklonale Peroxidase-konjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen-MilchThermo Fisher0031460 1892914WB: 1:20.000 in 1 % Magermilch bei TBS
Polyklonale Peroxidase-konjugierte Ziegen-Anti-MausThermo Fisher 0031430 1892913WB: 1:20.000 in 1 % Magermilch bei TBS
td colspan="4">td colspan="4">Maus

Referenzen

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