Überwachung Aktivierung der antiviralen Pattern Recognition Receptors RIG-I und PKR durch begrenzte Protease Verdauung und Native PAGE

Angeborene Abwehrmechanismen gegen Virusinfektionen werden durch Erkennungsrezeptoren für pathogentypische Muster oder PRRs ausgelöst. Diese sind in Zellen des angeborenen Immunsystems während einer Infektion vorhanden. Zytoplasmatische PRRs wie RIG-I und PKR binden an virale Signatur-RNAs, verändern ihre Konformation bei Ligandenbindung und aktivieren antivirale Signalwege. Um konformationelle Veränderungen von RIG-I und PKR sowie die Ligandenbindung in vitro zu untersuchen, werden humane A549-Zellen mit dem Rift-Valley-Fieber-Virus infiziert.

Klon 13, um die PRR-Aktivierung zu stimulieren. Anschließend werden Zelllysate von Kontroll- und infizierten Zellen hergestellt, um Veränderungen in der Struktur von Rig-Eye und PKR zu analysieren. Eine begrenzte Trypsinverdauung wird durchgeführt.

Wenn bestätigende Veränderungen in der Proteinstruktur aufgetreten sind, ist das Protein resistenter gegenüber dem Verdau, und Banden werden mittels Western-Blot-Analyse sichtbar. Zur Untersuchung der Bildung von allgas wird native PAGE durchgeführt, gefolgt von der Western-Blot-Analyse. Wenn eine vollständige Ligandierung stattgefunden hat, werden höhere all Liga rig eye- und PKR-Komplexe sichtbar. Der Hauptvorteil der begrenzten Proteaseverdauung und der nativen PAGE besteht darin, dass diese Techniken die direkte Messung der Rega- und PKR-Aktivierung ermöglichen.

Mithilfe dieser Methoden lassen sich zentrale Fragen auf dem Gebiet der angeborenen Immunität beantworten, beispielsweise nach der genauen Beschaffenheit und Herkunft der RNA-Spezies, die für die Aktivierung von RIG-I und PKR relevant sind. Diese Methoden können Aufschluss über RIG-I- und PKR-Agonisten geben. Außerdem können sie auf andere zytoplasmatische Sensorproteine wie MDA5 angewendet werden, was das Verfahren veranschaulicht. Mila Viva, eine Doktorandin aus meinem Labor, wird den Vorgang vor Beginn dieses Protokolls demonstrieren.

Beachten Sie, dass das Rift-Valley-Fieber-Virus-Klon 13, im Folgenden als CL 13 bezeichnet, ein abgeschwächter Virusmutant ist, der in Deutschland unter BSL-2-Bedingungen gehandhabt werden muss, um PBS und Zellkulturmedium ohne Serum, das 5 % FCS enthält, vorzuwärmen. Geben Sie diese in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie es in ein Wasserbad. Bereiten Sie 1,25 × 10⁷ PFU pro Milliliter CL 13 in Medium ohne Serum vor, um 2,5 × 10⁶ Zellen zu infizieren.

Bereiten Sie 5 49 Zellen mit einer Multiplizität der Infektion oder MOI von fünf vor, wobei etwa 10 % mehr vorbereitet werden, um Pipettierfehler auszugleichen. Entfernen Sie die 5 49 Zellen aus dem Inkubator, aspirieren Sie das Medium und geben Sie 10 Milliliter PBS hinzu; schwenken oder kippen Sie den Kulturkolben, um die Zellen zu waschen, und entfernen Sie anschließend den PBS. Fügen Sie danach ein Milliliter des verdünnten CL 13 hinzu oder für die nicht infizierte Kontrolle eine Mock-Infektion.

Geben Sie ein Milliliter serumfreies Medium hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang alle 15 Minuten. Kippen Sie das Kolben vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung des Mediums sicherzustellen. Nach einer Stunde Infektion entfernen Sie das Inokulum.

Geben Sie fünf Milliliter vorgewärmtes Zellkulturmedium mit 5 % FCS hinzu und inkubieren Sie fünf Stunden lang. Bereiten Sie PBS mit 0,5 % Tritton X-100 vor und stellen Sie es bei vier Grad Celsius ab. Fügen Sie keine syrischen Proteaseinhibitoren hinzu.

Als Nächstes waschen Sie die Zellen mit kaltem PBS und geben 10 Milliliter frisches PBS hinzu. Lösen Sie dann mithilfe eines Zellabstreifers die Zellen vom Kulturgefäß ab. Überführen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Konischglas und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 800 × g.

Nach dem Zentrifugieren entfernen Sie den Überstand und resuspendieren das Zellpellet in 30 Mikrolitern PBS mit 0,5 % Triton X-100. Überführen Sie das Lysat in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie es mindestens 10 Minuten auf Eis. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 10.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Nach der Zentrifugation das geklärte Zelllysat in ein frisches Gefäß überführen. Eine Bradford-Analyse durchführen, um die Proteinkonzentration im geklärten Zelllysat zu bestimmen. Bei minus 20 Grad Celsius lagern oder unmittelbar mit Trypsin-Digestion oder natives PAGE fortfahren, um konformationelle Veränderungen von Erkennungsrezeptoren für Muster nachzuweisen. Zunächst L 1 zu Stos Chloro, Methylketon behandeltes oder TPCK-Trypsin in PBS auf eine endgültige Arbeitskonzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter in zwei neuen Röhrchen für jede Bedingung verdünnen. Die endgültige Proteinkonzentration der CL 13- und der nicht-infizierten Kontroll-Proteinglysate in einem Endvolumen von neun Mikrolitern mit PBS auf 25 Mikrogramm einstellen. Ein Satz der Lysate dient als Input-Kontrolle, der andere wird mit TPCK-Trypsin behandelt. Zum unbehandelten Kontrollröhrchen ein Mikroliter PBS hinzufügen.

Fügen Sie ein Mikroliter einer zweifachen Mikrogramm pro Mikroliter TPCK-Trypsin hinzu, um eine Endkonzentration von 0,2 Mikrogramm pro Mikroliter zu erreichen. Mischen Sie die Ansätze durch Pipettieren. Inkubieren Sie die Lysate bei 37 Grad Celsius für 25 Minuten.

Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von fünf x Denaturierungspuffer und anschließendem Sieden für fünf Minuten bei 95 Grad Celsius. Es ist wichtig, die Trypsin-Inkubationszeit nicht zu verlängern. Beachten Sie, dass eine exakte Einhaltung der Trypsin-Digestionszeit entscheidend ist, um resistente Fragmente ohne Hintergrundsignal nachzuweisen; falls resistente Proteine nicht oder zu viele detektiert werden, entsprechend die Dauer der Verdauung anpassen.

Nach dem Kochen die Proben bei minus 20 Grad Celsius lagern oder die Proben auf zwei Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelen auftrennen, die aus einem 5 % Stapelgel über einem 12 % Trenngel bestehen. Die Proteine bei 25 Milliampere pro Gel so lange trennen, bis das Bromphenolblau herausrinnt.

Nach dem Laufen der Gele übertragen Sie die Proteine von einem Gel auf eine Polyvinylidenfluorid-Membran und analysieren sie mittels Western Blotting mit Antikörpern gegen Rig-Eye und PKR; färben Sie das andere Gel mit Coomassie Brilliant Blue G-250. Bewahren Sie das Gel anschließend bei vier Grad Celsius in 25 % Ethanol, 8 % Essigsäure und 4 % Glycerin auf oder führen Sie direkt die Bildgebung und Analyse durch. Zur Analyse der oligomeren Zustände von Mustereffektor-Rezeptoren bereiten Sie 50 Mikrogramm Zelllysat in einem Endvolumen von 10 Mikrolitern mit PBS vor und geben 5× Probe-Puffer hinzu, um eine Endkonzentration von 1× zu erreichen.

Die Proben unverzüglich auf ein natives Polyacrylamidgel mit einer 5 %­Stapel- und einer 8 %­Trenngel-Schicht auflaufen lassen. Jede Verzögerung führt zum Verlust nativer Komplexe. Das Gel bei 20 Milliampere pro Gel und vier Grad Celsius laufen lassen.

Beenden Sie die Elektrophorese 45 Minuten, nachdem die Bromphenolblau-Front das Gel verlassen hat, nach insgesamt etwa 1,5 bis zwei Stunden, um eine Westernblot-Analyse mit Antikörpern gegen RIG-I und PKR durchzuführen, wie in dem begleitenden Dokument beschrieben, um konformationelle Umschaltung und durch Erkennung eines viralen Agonisten durch RIG-I oder PKR induzierte Oligomerisierung nachzuweisen. Eingeschränkte Proteaseverdauung und Native-PAGE wurden wie in diesem Video beschrieben durchgeführt. Trypsinverdauung von Lysaten aus mock-infizierten Zellen führte zu einem raschen Abbau von RIG-I, während die Infektion mit Clone 13 zur Bildung eines 30 Kilodalton großen, resistenten RIG-I-Fragments führte. PKR zeigt ebenfalls eine partielle Resistenz gegenüber Trypsinverdauung in infizierten Proben, was mit dessen Phosphorylierung einhergeht. Um Effizienz und Spezifität des Trypsinverdaus zu überwachen, wurden die Gele mit Coomassie Brilliant Blue G-250 gefärbt. Unbehandelte Proben zeigen gleiche Mengen an beladenen Proteinen; die Behandlung von mock- und C13-Zelllysaten mit Trypsin führt zu einem vergleichbaren Rückgang der globalen Proteinmengen.

Dies zeigt, dass die Trypsinbehandlung bei Mock- und CL 13-infizierten Proben in nicht infizierten Zellen die gleiche Effizienz aufweist. Als zusätzliche Kontrolle wurden nur Monomere von R EYE und PKR nachgewiesen. Der Transkriptionsfaktor IRF drei wurde mit einbezogen, der als Monomer vorliegt, aber bekanntermaßen bei Aktivierung über R Eye dimerisiert.

Die Infektion mit Clone 13 führt zu einer starken Anreicherung oligomerer Komplexe von RIG-I in Form eines Smeares sowie zu Dimeren oder Oligomeren von PKR und IRF3 als definierte Proteinbande. Diese Ergebnisse zeigen, dass begrenzte Trypsinverdau und native PAGE nützliche Werkzeuge sind, um konformationelle Veränderungen und die Oligomerisierung von RIG-I und PKR während einer Infektion zu überwachen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Konformationsänderungen und Oligomerisierung von RIG-I und PKR überwacht werden können, sobald Sie die Methoden beherrschen.

Diese Technik kann innerhalb von zwei Tagen gemäß diesem Verfahren durchgeführt werden. Als Methoden können beispielsweise Pro-Assays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob nach ihrer Entwicklung eine stabile Wechselwirkung mit dem stimulierenden Liganden vorliegt. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der angeborenen Immunität den Weg, um den Aktivierungsstatus von Erkennungsrezeptoren für Mustermoleküle in virusstimulierten Zellen zu untersuchen.