Überwachung Aktivierung der antiviralen Pattern Recognition Receptors RIG-I und PKR durch begrenzte Protease Verdauung und Native PAGE

Die angeborene Abwehr von Virusinfektionen wird durch Mustererkennungsrezeptoren oder Prrs ausgelöst. Kommt in Zellen des angeborenen Immunsystems während einer Infektion vor. Zytoplasmatisches PRRS, Rig-Auge und PKR binden an virale Signatur-RNAs, bestätigen alle Liga-Augen und aktivieren die antivirale Signalgebung, um Veränderungen des Rig-Auges und der PKR-Bestätigung zu überwachen, und alle Ligamentisierungen in vitro humane A 5 49-Zellen sind mit dem Rift-Valley-Fieber-Virus infiziert.

Klon 13 zur Stimulierung der PRR-Aktivierung. Zelllysate der Kontrollzellen und infizierte Zellen werden dann vorbereitet, um sie auf Veränderungen des Rig-Auges und der PKR zu analysieren. Es wird ein begrenzter Tryinaufschluss durchgeführt.

Wenn bestätigende Veränderungen in der Proteinstruktur aufgetreten sind, ist das Protein resistenter gegen die Verdauung und es werden Banden mit Western Blot Analysis zur Analyse der Bildung von Allgas Native Page durchgeführt, gefolgt von einer Western Blotting Analyse. Wenn alle Ligamentisierungen höher stattgefunden haben, sind alle Liga-Rig-Auge und PKR-Komplexe zu sehen. Der Hauptvorteil des begrenzten Proteaseverdaus und der nativen Seite besteht darin, dass diese Techniken die direkte Messung der Rega- und PKR-Aktivierung ermöglichen.

Diese Methoden können helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der angeborenen Immunität zu beantworten, z. B. was die genaue Art und Herkunft der RNA-Spezies ist, die für die Aktivierung von Rig Eye und PKR relevant sind. Diese Methoden können Einblicke in Rig-Eye- und PKR-Agonisten geben. Sie können auch auf andere zytoplasmatische Sensorproteine wie MDA fünf angewendet werden, was Mila Viva, eine Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert.

Bitte beachten Sie, dass der Rifttalfieber-Virusklon 13, der im Folgenden als CL 13 bezeichnet wird, eine abgeschwächte Virusmutante ist, die in Deutschland unter BSL-Bedingungen gehandhabt werden muss, um das serumfreie PBS-Medium und das Zellkulturmedium mit 5%FCS vorzuwärmen. Legen Sie sie in ein Wasserbad in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Bereiten Sie 1,25 mal 10 bis zur siebten PFU pro Milliliter CL 13 im serumfreien Medium vor, um 2,5 mal 10 bis zur sechsten zu infizieren.

5 49 Zellen mit einer Vielzahl von Infektionen oder MOI von fünf bereiten etwa 10 % mehr vor, als zur Berücksichtigung von Pipettierfehlern erforderlich ist. Nehmen Sie die A 5 49-Zellen aus dem Inkubator, aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 10 Milliliter PBS-Swirl hinzu oder kippen Sie den Kulturkolben, um die Zellen zu waschen, und entfernen Sie dann das PBS. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter des verdünnten CL 13 hinzu oder für die nicht infizierte Kontrolle oder Scheininfektion.

Fügen Sie einen Milliliter freies Serummedium hinzu und inkubieren Sie alle 15 Minuten eine Stunde lang. Kippen Sie den Kolben vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung des Mediums zu gewährleisten. Entfernen Sie nach einer Stunde nach der Infektion das Inokular.

Fügen Sie fünf Milliliter vorgewärmtes Zellkulturmedium mit 5 % FCS hinzu und inkubieren Sie fünf Stunden lang. Bereiten Sie PBS mit 0,5% Tritton X 100 zu und stellen Sie es auf vier Grad Celsius. Fügen Sie keine syrischen Proteasehemmer hinzu.

Als nächstes waschen Sie die Zellen mit kaltem PBS und fügen Sie 10 Milliliter frisches PBS hinzu. Lösen Sie dann mit einem Zellschaber die Zellen von der Schale. Die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführen und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 800-fachem G zentrifugieren.

Entfernen Sie nach dem Schleudern den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 30 Mikrolitern PBS mit 0,5 % Triton X 100. Das Lysat in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen umfüllen und mindestens 10 Minuten auf Eis inkubieren. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 10.000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Nach der Zentrifugation wird das geklärte Zelllysat in ein frisches Röhrchen überführt. Führen Sie einen Bradford-Assay durch, um die Proteinkonzentration im geklärten Zelllysat zu bestimmen. Lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius oder fahren Sie sofort mit dem Versuch fort, eine Verdauung durchzuführen, oder fahren Sie sofort mit dem Assay fort, um zu verdauen, oder auf bestätigende Veränderungen der Mustererkennungsrezeptoren zu testen. Verdünnen Sie zuerst L, ein Tosto-Chlor, ein mit Methylketon behandeltes oder TPCK-Trypsin in PBS auf eine endgültige Arbeitskonzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter in zwei neuen Röhrchen für jede Bedingung. Passen Sie die endgültige Proteinkonzentration des CL 13 und der nicht infizierten Kontrollproteinlysate auf 25 Mikrogramm in einem Endvolumen von neun Mikrolitern mit PBS an, wobei ein Satz Lysate als Eingangskontrolle verwendet wird und der andere mit TPCK-Trypsin auf die unbehandelten Kontrollröhrchen behandelt wird. Geben Sie einen Mikroliter PBS in die verbleibenden zwei Röhrchen.

Fügen Sie einen Mikroliter von zwei Mikrogramm TPCK-Trypsin pro Mikroliter hinzu, um die Endkonzentration auf 0,2 Mikrogramm pro Mikroliter zu erhöhen. Mischen Sie die Reaktionen durch Pipettieren. Inkubieren Sie die Lysate 25 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie fünf x denaturierenden Probenpuffer hinzufügen und dann fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius sieden. Es ist wichtig, die Inkubationszeit von Trypsin nicht zu verlängern. Es ist zu beachten, dass ein präziser Zeitpunkt des Trypsinverdaus entscheidend für den Nachweis resistenter Fragmente ohne Hintergrund ist, wenn keine resistenten Proteine nachgewiesen werden oder wenn zu viele nachgewiesen werden, angepasste Dauer des Verdaus. Entsprechend.

Lagern Sie die Proben nach dem Kochen bei minus 20 Grad Celsius oder laden Sie die Proben auf zwei Natriumsulfate. Polyacrylamid-Gele, bestehend aus einem 5%-Stapelgel über einem 12%-Auflösungsgel. Trennen Sie die Proteine bei 25 Milliampere pro Gel, bis das Bromphenolblau ausgeht.

Nach dem Ausführen der Gele übertragen Sie die Proteine von einem Gel auf eine Poly-Vinenfluorid-Membran und analysieren Sie sie durch Western Blotting mit Antikörpern, die gegen das Rig-Auge gerichtet sind, und färben Sie das andere Gel mit Kumasi Brilliant Blue G two 50. Lagern Sie das Gel dann in 25 % Ethanol, 8 % Essigsäure und 4 % Glycerin bei vier Grad Celsius oder fahren Sie mit der Bildgebung und Analyse fort. Um oligomere Zustände von Mustererkennungsrezeptoren zu analysieren, bereiten Sie 50 Mikrogramm Zelllysat in einem Endvolumen von 10 Mikrolitern mit PBS vor und fügen Sie fünf x Probenpuffer bis zu einer Endkonzentration von einem x hinzu.

Laden Sie die Proben sofort auf ein natives Polyacrylamid-Gel mit einem 5%-Stapel- und einem 8%-Auflösungsgel. Jede Verzögerung führt zu einem Verlust von nativen Komplexen. Lassen Sie das Gel mit 20 Milliampere pro Gel bei vier Grad Celsius laufen.

Stoppen Sie die Elektrophorese 45 Minuten, nachdem die Brom-Phenolblau-Bande das Gel verlassen hat, nach insgesamt etwa 1,5 bis zwei Stunden pro Durchführung. Western Blot mit Antikörpern, die gegen Rig Eye und PKR gerichtet sind, wie im Begleitdokument beschrieben, zum Assay auf bestätigendes Switching und Oligo, das durch die Erkennung eines viralen Agonisten durch Rig Eye oder PKR induziert wurde; der Proteaseverdau und die native Seite wurden wie in diesem Video beschrieben durchgeführt. Der Trypsinverdau von Schein-infizierten Zelllysaten führte zu einem schnellen Abbau des Rig-Auges, während die Klon-13-Infektion zur Bildung eines 30 Kilodalton resistenten Rig-Augenfragments führte. PKR zeigt auch eine partielle Resistenz gegen Tripsin-Verdau in infizierten Proben, die mit seiner Phosphorylierung zusammenfällt, um die Effizienz und Spezifität von Tripsin-Verdauungsgelen zu überwachen, die mit Kumasi Brilliant Blue G two 50 gefärbt wurden. Unbehandelte Proben zeigen gleiche Mengen an beladenen Proteinen, wobei Mock- und C13-Zelllysate beim Verdau zu einer vergleichbaren Abnahme der globalen Proteinmengen führen.

Dies zeigt, dass die Tripsin-Behandlung die gleiche Wirksamkeit für Schein- und CL 13-infizierte Proben in nicht infizierten Zellen aufweist. Als zusätzliche Kontrolle wurden nur Monomere von R, EYE und PKR nachgewiesen. Eingeschlossen wurde der Transkriptionsfaktor IRF drei, der als Monomer vorliegt, aber bekanntermaßen bei Aktivierung über das R-Auge dimerisiert.

Die Infektion mit Klon 13 führt zu einer starken Akkumulation von oligomeren Rig-Eye-Komplexen in Form eines Abstrichs und von PKR und IRF, drei Dimeren oder Oligomeren als definierte Proteinbande. Diese Ergebnisse zeigen, dass begrenzte Trips in der Verdauung und auf der nativen Seite nützliche Werkzeuge sind, um bestätigende Veränderungen und die Oligobildung von Rig Eye und PKR nach der Infektion zu überwachen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Umschalten und die Aktivierung von WIC-Augen und PKR-Bestätigung überwachen können, sobald Sie es beherrschen.

Diese Technik kann innerhalb von zwei Tagen nach diesem Verfahren durchgeführt werden. Als Methode können Methoden wie Pro-Assays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob es nach seiner Entwicklung eine stabile Wechselwirkung mit dem stimulierenden Liganden gibt. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der angeborenen Immunität den Weg, um den Aktivierungsstatus von Mustererkennungsrezeptoren in viral stimulierten Zellen zu untersuchen.