Name: Überwachung Aktivierung der antiviralen Pattern Recognition Receptors RIG-I und PKR durch begrenzte Protease Verdauung und Native PAGE (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Lernen Sie die Aktivierung der antiviralen Rezeptoren RIG-I und PKR durch begrenzte Protease-Verdauung und Native PAGE zu überwachen. Diese Methode ermöglicht die Analyse konformationeller Änderungen bei viralen Infektionen.

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Wir danken Alejandro Brun von KAG-INIA für die Bereitstellung von Anti-Virus Rift Valley Fieber Seren. Die Arbeit in unseren Labors wird durch Forschungsförderung gem unterstützt. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Gießen und Marburg, die Leibniz Graduate School für Schwellen-Viruserkrankungen (EIDIS), dem DFG-Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, und die DFG-Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

1. Seeding von A549 Zellen für Infektions <ol><li> Eine T75-Flasche von A549-Zellen zu kultivieren, auf 37 ° C und 5% CO 2 in Zellkulturmedium (DMEM, ergänzt mit 10% FCS, 526,6 mg / l L-Glutamin, 50.000 U / l Penicillin und 50 mg / l Streptomycin). </li><li> Vor dem Start, um die Zellen zu ernten, Aufwärmen Zellkulturmedium, PBS und 0,05% Trypsin-EDTA in einem Wasserbad auf 37 ° C erhitzt, </li><li> Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS. Entfernen Sie das PBS wieder. </li><li> 3 ml Trypsin-EDTA und ebenso in dem Kolben zu verteilen. Übertragen Sie die Flasche in einem Inkubator mit 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Wenn alle Zellen abgelöst werden, 7 ml Zellkulturmedium resuspendieren, und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 g für 5 min bei RT, entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 10 ml frischem Zellkulturmedium. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. </li><li> Add 2,5 x 10 6 Zellen in 5 ml Zellkulturmedium in zwei T25-Kolben mit jeweils. Inkubation für 16 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. Ein Kolben dient der Scheinkontrolle und eine für Cl 13-Infektion. </li></ol> 2. Infektion mit Rift-Valley-Fieber-Virus Clone 13 (Cl 13) <ol><li> HINWEIS: Cl 13 ist eine abgeschwächte Virus-Mutante, die in Deutschland unter BSL-2-Bedingungen behandelt werden. Bitte auf die jeweiligen nationalen Richtlinien. Weitere typische IFN-Induktoren würde Sendai Virus (Stamm Cantell) oder Newcastle-Krankheit Virus sein. </li><li> Vorwärmen PBS, Serum-freien Medium und Zellkulturmedium mit 5% FCS. </li><li> Planen 1,25 x 10 7 PFU / ml Cl 13 in serumfreiem Medium auf 2,5 x 10 6 A549-Zellen mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 5 infiziert. Vorbereiten einer leicht (etwa 10%) größeren Menge als nötig, um Rechenschaft Pipettenfehler. </li><li> Waschen der Zellen mit PBS, wie unter 1.3 beschrieben. </li><li> 1 ml der Verdünnung oder Cl 13Serum-freies Medium (infizierte Kontroll, mock) zu den Zellen und Inkubation für 1 h bei 37 ° C und 5% CO 2. 15 min bewegen den Kolben sorgfältig zu Gleichverteilung der Cl 13 Verdünnung und serumfreien Medium zu gewährleisten sind. </li><li> Nach 1 Stunde der Infektion, entfernen Sie die Inokula, 5 ml vorgewärmten Zellkulturmedium mit 5% FCS und Inkubation für 5 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> 3. Herstellung von Zelllysaten <ol><li> Vorbereitung PBS / 0,5% Triton X-100 bei 4 ° C Fügen Sie nicht Serin-Protease-Inhibitoren. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit kaltem PBS und 10 ml frischem PBS. </li><li> Kratzen Sie die Zellen aus, übertragen Sie die Zellsuspension in einem Falcon-Röhrchen und-Zentrifuge bei 800 g für 5 min bei RT. </li><li> Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in 30 &amp;mgr; l PBS / 0,5% Triton X-100. Übertragen Sie das Lysat in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen und Inkubation für mindestens 10 min bei 4 ° C </li><li> Zentrifugieren Sie das Lysat um 10.00 Uhr0 g für 10 min bei 4 ° C und übertragen die geklärte Zelllysat (Überstand) in ein frisches Röhrchen. </li><li> Bestimmen Sie die Proteinkonzentration nach Bradford, wie an anderer Stelle 33 beschrieben. </li><li> Lagerung bei -20 ° C oder fahren Sie mit Trypsin-Verdauung (4.1) oder native PAGE (5.1). </li></ol> 4. Bestimmung von Konformationsänderungen von Pattern Recognition Receptors <ol><li> TPCK-Trypsin-Behandlung von Zelllysaten <ol><li> Verdünnen L-1-tosylamido-2-phenylethyl-chlormethylketon behandelt (TPCK)-Trypsin in PBS bis zu einer endgültigen Arbeitskonzentration von 2 ug / ul. </li><li> Einstellen in zwei neue Schläuche eine Protein-Endkonzentration von 25 &amp;mgr; g jedes Proteins Lysat (mock oder Cl 13) in einem Endvolumen von 9 ul mit PBS. Daher sollte es vier Röhrchen mit je 25 ug Lysat zweimal Mock und zweimal Cl 13-Infektion. Ein als Eingangskontrolle (unbehandelt) und ein Satz für die Behandlung mit TPCK-Trypsin gesetzt. </li><li> 1 &amp;mgr; l PBS (unbehandelt)oder 1 &amp;mgr; l 2 &amp;mgr; g / &amp;mgr; l Trypsin-TPCK (Endkonzentration: 0,2 ug / ul) zu den Zelllysaten und mischen die Reaktionen durch Pipettieren. Einfrieren und auftauen TPCK-Trypsin-Aliquots, denn es wird die Effizienz der Verdauung beeinträchtigen. </li><li> Die Lysate bei 37 ° C für 25 min. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 5x denaturierenden Probenpuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% Glycerin, 25% β-Mercaptoethanol, 0,5% Bromphenolblau) und durch Kochen für 5 min bei 95 ° C. Es ist wichtig, nicht das Trypsin Inkubationszeit verlängern. Falls keine Protease-resistenten Fragmente nachweisbar sind, muß die Zeit der Trypsin-Verdau verkürzt werden. </li><li> Nach dem Kochen können die Proben bei -20 ° C gelagert werden </li></ol></li><li> SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und Western Blotting <ol><li> Laden der Proben auf einem Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gel mit einem 5% igen Sammelgel in einem 12% Trenngel. Trennen Sie die Proteine ​​bei 25 mA pro Gel, bisdie Bromphenolblau abläuft. </li><li> Aktivieren einer Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran für 30 Sekunden mit Methanol und steckte es in Transferpuffer (48 mM Tris, 39 mM Glycin, 1,3 mM SDS, 20% Methanol). </li><li> Vorbereitung der Blot mit einem halbtrockenen Blotting-Systems und erlauben den Transfer der Proteine ​​bei 10 V für 1 Stunde. Nehmen Sie die Membran aus, spülen Sie es kurz mit Wasser und trocknen lassen. </li><li> Reaktivieren Sie die Membran kurz in Methanol übertragen. Für 5 min mit TBS waschen. Block mit 10% Magermilch in TBS für 1 h bei RT oder bei 4 ° CO / N Für jeden mit TBS 5 min Waschen Sie die Membran 3x. </li><li> Antikörperverdünnung herzustellen, wie in Tabelle 1 empfohlen und Inkubation der Membran für 1 h bei RT oder bei 4 ° CO / N </li><li> Für jeden mit TBS-T 10 min Waschen Sie die Membran 3x. Fügen Sie den entsprechenden sekundären Antikörper bei einer 1:20.000 Verdünnung in 1% Magermilch in TBS, gekoppelt mit Meerrettich-Peroxidase. Inkubieren 45 min bei RT. </li><li> Für jeden mit TBS-T 10 min Waschen Sie die Membran 3x, und one zusätzliche Zeit mit TBS. </li><li> Für Signalerkennung verwenden Kommerzielle Chemilumineszenz-Kit und eine digitale Gel Imaging System. </li></ol></li><li> Coomassie Brilliant Blue G-250 Färbung <ol><li> Führen SDS-PAGE, wie in 4.2.1 beschrieben. Laden Sie die Proben auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel und führen Sie das Gel bei 25 mA pro Gel, bis Bromphenolblau abläuft. </li><li> Führen Coomassie Brilliant Blue G-250-Färbung bei RT. Haben alle Inkubationen unter ständigem Schütteln. </li><li> Übertragen des Gels an der Fixierungslösung, die 40% Methanol und 10% Essigsäure für 30 min. </li><li> Tauschen Sie den Puffer in Entfärbelösung (25% Ethanol und 8% Essigsäure) und Inkubation für 5 min. </li><li> Flecken des Gels mit 0,2% Coomassie Brillant-Blue G-250 in 40% Methanol und 10% Essigsäure für 1 Stunde. </li><li> Entfärben des Gels mit der Entfärbelösung und Austausch des Puffers nach 10 min, 30 min und 60 min. </li><li> Speichert das Gel in 25% Ethanol, 8% Essigsäure und 4% Glycerin bei 4 ° C. </li&gt; <li> Führen Abbildung und Analyse wie unter 4.2.8 beschrieben. </li></ol></li></ol> 5. Analyse der Oligomere Staaten von Pattern Recognition Receptors <ol><li> Native PAGE <ol><li> Vorbereitung 50 &amp;mgr; g Zelllysat in einem Endvolumen von 10 ul mit PBS und mit 5 × nativen Probenpuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 1% Natriumdeoxycholat, 50% Glycerin, 0,5% Bromphenolblau) auf eine Endkonzentration von 1x. </li><li> Laden Sie die Proben sofort auf einem nativen Polyacrylamid-Gel mit 5%, wie das Stapeln und 8% Trenngel. Jede Verzögerung wird zu einem Verlust der nativen Komplexe 34 führen. </li><li> Die Elektrophorese bei 20 mA pro Gel bei 4 ° C mit 50 mM Tris-NaOH pH 9,0, 384 mM Glycin als Anode und als 50 mM Tris pH 8,3, 384 mM Glycin, 1% Natriumdesoxycholat als Kathodenpuffer. Nach 1,5-2 h (Bromphenolblau Band hat das Gel ca. 45 min früher links) die Elektrophorese beendet. </li></ol></li><li> Western-Blotting <ol><li> Aktivieren Sie einen polyvinylidene (PVDF)-Membran für 30 Sekunden mit Methanol und sie in Towbin-Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS, 20% Methanol). </li><li> Montieren Sie einen nassen Fleck Kammer gemäß den Anweisungen des Herstellers und füllen den Tank mit Towin Puffer. </li><li> Führen die Blotting mit 250 mA für 1,5 h bei 4 ° C. </li><li> Beim Lösch wird, gehen Sie wie von 4.2.3 beschrieben beendet. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gurtler, C., Bowie, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+detection+of+microbial+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Innate immune detection of microbial nucleic acids.</a> Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).</li>
<li>Jensen, S., Thomsen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+of+RNA+viruses%3A+a+review+of+innate+immune+receptors+involved+in+recognizing+RNA+virus+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion.</a> Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).</li>
<li>Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIG-I-like+receptors%3A+cytoplasmic+sensors+for+non-self+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA.</a> Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).</li>
<li>Yoneyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RIG-I+has+an+essential+function+in+double-stranded+RNA-induced+innate+antiviral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses.</a> Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).</li>
<li>Andrejeva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V+proteins+of+paramyxoviruses+bind+the+IFN-inducible+RNA+helicase%2C+mda-5%2C+and+inhibit+its+activation+of+the+IFN-beta+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).</li>
<li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+innate+antiviral+defenses+through+a+shared+repressor+domain%5BTitle%5D)+AND+%22in+RIG-I+and+LGP2+Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain.</a> in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).</li>
<li>Ferrage, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+the+second+CARD+of+human+RIG-I+provide+mechanistic+insights+into+regulation+of+RIG-I+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Structure+%28London%2C+England+%3A+1993%29%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation.</a> Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).</li>
<li>Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKolakofsky%2C+D+%22A+structure-based+model+of+RIG-I+activation%22">A structure-based model of RIG-I activation</a>. 18, RNA. New York, NY. 2118-2127 (2012).</li>
<li>Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+determinants+of+viral+RNA+recognition+by+innate+immune+sensor+RIG-I%5BTitle%5D)+AND+%22Structure+%28London%2C+England+%3A+1993%29%22%5BJournal%5D)">Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I.</a> Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).</li>
<li>Kowalinski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+activation+of+innate+immune+pattern-recognition+receptor+RIG-I+by+viral+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA.</a> Cell. 147, 423-435 (2011).</li>
<li>Luo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+RNA+recognition+by+RIG-I%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural insights into RNA recognition by RIG-I.</a> Cell. 147, 409-422 (2011).</li>
<li>Habjan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+genome+5%26%2334%3B+termini+as+a+strategy+of+negative-strand+RNA+viruses+to+avoid+RIG-I-dependent+interferon+induction%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Processing of genome 5&#34; termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction.</a> PloS One. 3, e2032(2008).</li>
<li>Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+viral+Achilles%27+recognition+of+5%27-triphosphate+RNA+in+innate+anti-viral+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Targeting the viral Achilles' recognition of 5'-triphosphate RNA in innate anti-viral defence.</a> Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).</li>
<li>Pichlmair, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPichlmair%2C+A+%22RIG-I-mediated+antiviral+responses+to+single-stranded+RNA+bearing+5%27-phosphates%22">RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates</a>. , Science. New York, NY. 314-997 (2006).</li>
<li>Hornung, V., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHornung%2C+V+%225%27-Triphosphate+RNA+is+the+ligand+for+RIG-I%22">5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I</a>. , Science. New York, N.Y. 314-994 (2006).</li>
<li>Saito, T., Gale, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recognition+of+double-stranded+RNA+by+RIG-I-like+receptors+in+antiviral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).</li>
<li>Takahasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonself+RNA-sensing+mechanism+of+RIG-I+helicase+and+activation+of+antiviral+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses.</a> Mol Cell. 29, 428-440 (2008).</li>
<li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+signal+perception+and+integration+by+the+innate+immune+sensor+retinoic+acid-inducible+gene-I+%28RIG-I%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I).</a> J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-induced+oligomerization+of+the+RNA+sensors+RIG-I+and+MDA5+activates+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response.</a> Immunity. 36, 959-973 (2012).</li>
<li>Civril, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIG-I+ATPase+domain+structure+reveals+insights+into+ATP-dependent+antiviral+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling.</a> EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).</li>
<li>Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+the+innate+antiviral+response+through+IRF-3+activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).</li>
<li>Hertzog, P. J., Williams, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+type+I+interferon+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokin.%2C+%26+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fine tuning type I interferon responses.</a> Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).</li>
<li>Pindel, A., Sadler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+protein+kinase+R+in+the+interferon+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interfero.%2C+%26+Cytokine+Research+%3A+the+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Interferon+and+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">The role of protein kinase R in the interferon response.</a> Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).</li>
<li>Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eIF2alpha+kinases%3A+their+structures+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences+CMLS%22%5BJournal%5D)">The eIF2alpha kinases: their structures and functions.</a> Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).</li>
<li>Cole, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PKR+an+open+and+shut+case%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Activation of PKR an open and shut case.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).</li>
<li>Dauber, B., Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Antiviral+Kinase+PKR+and+Viral+Countermeasures%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures.</a> Viruses. 1, 523-544 (2009).</li>
<li>Dey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+link+between+PKR+dimerization%2C+autophosphorylation%2C+and+eIF2alpha+substrate+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition.</a> Cell. 122, 901-913 (2005).</li>
<li>Gack, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM25+RING-finger+E3+ubiquitin+ligase+is+essential+for+RIG-I-mediated+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity.</a> Nature. 446, 916-920 (2007).</li>
<li>Zeng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+RIG-I+pathway+reveals+a+signaling+role+of+unanchored+polyubiquitin+chains+in+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity.</a> Cell. 141, 315-330 (2010).</li>
<li>Anderson, E., Cole, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+stabilities+in+protein+kinase+R+%28PKR%29%3A+evidence+for+weak+interdomain+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions.</a> Biochemistry. 47, 4887-4897 (2008).</li>
<li>Habjan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+rift+valley+fever+virus+induces+the+specific+degradation+of+the+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incoming+RNA+virus+nucleocapsids+containing+a+5%27-triphosphorylated+genome+activate+RIG-I+and+antiviral+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Hos.%2C+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5'-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling.</a> Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+limitations+of+clear-native%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Advantages and limitations of clear-native.</a> 5, 4338-4346 (2005).</li>
<li>Muller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clone+13%2C+a+naturally+attenuated+avirulent+isolate+of+Rift+Valley+fever+virus%2C+which+is+altered+in+the+small+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment.</a> Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).</li>
<li>Bouloy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+an+interferon-antagonistic+function+of+rift+valley+fever+virus+nonstructural+protein+NSs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs.</a> Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).</li>
<li>Ikegami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+protein+promotes+post-transcriptional+downregulation+of+protein+kinase+PKR+and+inhibits+eIF2alpha+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation.</a> PLoS Pathogens. 5, e1000287(2009).</li>
<li>Iwamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+IRF-3%2F-7+kinase+and+NF-kappaB+in+response+to+double-stranded+RNA+and+virus+infection%3A+common+and+unique+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells+%3A+Devoted+to+Molecula.%2C+%26+Cellular+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways.</a> Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).</li>
<li>Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+IRF-3+activation+by+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interfero.%2C+%26+Cytokine+Research+%3A+the+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Interferon+and+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">Control of IRF-3 activation by phosphorylation.</a> Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).</li>
<li>Bamming, D., Horvath, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+signal+transduction+by+enzymatically+inactive+antiviral+RNA+helicase+proteins+MDA5+RIG-I+and+LGP2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+dsRNA+recognition%2C+filament+formation%2C+and+antiviral+signal+activation+by+MDA5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5.</a> Cell. 152, 276-289 (2013).</li>
<li>Berke, I. C., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDA5+cooperatively+forms+dimers+and+ATP-sensitive+filaments+upon+binding+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA.</a> The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).</li>
<li>Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+evasion+of+type+I+interferon+responses+by+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses.</a> Virus Research. 162, 12-18 (2011).</li>
<li>Taylor, K. E., Mossman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+understanding+viral+evasion+of+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon.</a> Immunology. 138, 190-197 (2013).</li>
<li>Goodbourn, S., Randall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+type+I+interferon+production+by+paramyxoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interfero.%2C+%26+Cytokine+Research+%3A+the+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Interferon+and+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses.</a> Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).</li>
<li>Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+tricks+to+grid-lock+the+type+I+interferon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Viral tricks to grid-lock the type I interferon system.</a> Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Erfassen der Anwesenheit von Viren und die Aktivierung des antiviralen Typ I IFN-Systems sind entscheidend für eine erfolgreiche angeborenen Immunantworten 22. Virenerkennung wird dabei durch Erreger recognition receptors (PRR), wie RIG-I und PKR vermittelte, was eine schnelle Reaktion und Aktivierung der antiviralen Abwehrmechanismen. Hier beschreiben wir zwei Methoden, um den Aktivierungsstatus des RIG-I und PKR direkt auswerten. Begrenzte Proteaseverdau als Werkzeug, um Konform...

Ein entscheidendes Ereignis in der antiviralen Wirtsabwehr ist die schnelle Nachweis des Erregers durch die so genannte Mustererkennungsrezeptoren (PRR) 1,2. Intrazellulären Nachweis von RNA-Virus-Infektion ist abhängig von zwei cytoplasmatischen RNA-Helikasen, RIG-I (Retinsäure-induzierbares Gen-I) und MDA5 (Melanomdifferenzierung-assoziiertes Protein 5) 3-5. RIG-I besteht aus zwei N-terminalen Caspase-Rekrutierungsdomänen (Karten), einer zentralen DECH-box Typ-RNA-Helikase-Domäne und einer C-terminalen Domäne (CTD) 4,6 zusammen. Während die CTD und die Helikase-Domäne für die Anerkennung von Nicht-Selbst (viral) RNAs erforderlich, die Karten vermitteln nachgeschalteten Signal der zur Schaffung eines antiviralen Wirts Status. Wenn RIG-I im stillen Zustand, dh in Abwesenheit von einem bestimmten RNA-Liganden interagiert der zweiten Karte mit der zentralen Helikasedomäne und hält RIG-I in einem Auto-hemmende Konformation 11.07. RIG-I bindet an kurze doppelsträngigeStrang (ds) RNA trägt ein 5&#39;-Triphosphat (5&#39;PPP), lange dsRNA und PolyU / UC-reiche RNA, klassische Unterschrift Strukturen, die auf die Genome vieler RNA-Viren 12-16 vorhanden sind. Zwei wichtige Eigenschaften von RIG-I-Aktivierung sind ein Schalter in eine geschlossene Konformation 6,17 und der Homo-Oligomerisierung 6,18,19. Die Konformationsänderung Schalter erhöht RNA-Bindung, macht die Karten für nachgeschalteten Signal und rekonstruiert eine aktive ATPase Website 8,9,11,20. Die Bildung von oligomeren RIG-I-Komplexe führt zu verbesserten Einstellung nachgeschalteten Signaladaptermoleküle, um eine Plattform für antivirale Signaltransduktion 11 zu bilden. Das RIG-I-regulierten Signalkette schließlich aktiviert den Transkriptionsfaktor IRF-3 für die Hochregulierung von Interferon (IFN-alpha/beta)-Gene und damit die Genexpression von Interferon-stimulierten Gene (ISG) für eine volle antivirale Antwort 21,22 . Eines der am besten charakterisierten ISG ist die RNA-aktivierten Protein-Kinase (PKR) 23. PKR gehört zur Familie der eukaryontischen Translationsinitiationsfaktors 2 Alpha (eIF2a)-Kinasen und ist aus einem N-terminalen Doppelstrang-RNA-Bindungsdomäne und einer C-terminalen Kinase-Domäne zusammengesetzt. Die Kinasedomäne bildet die Dimerisierung wichtig für PKR-Aktivierung und führt die katalytische Funktion des Proteins. Die Bindung von PKR, um virale dsRNA führt zu dessen Konformationsänderung ermöglicht die Dimerisierung und Auto-Phosphorylierung an Thr 446 unter anderem Rückstände. PKR vermittelt dann die Phosphorylierung von eIF2a, wodurch die Translation viraler mRNAs 23-27 blockieren. Sowohl RIG-I und PKR unterziehen großen strukturellen Umlagerungen, bilden oligomere Komplexe und posttranslational durch Phosphorylierung / Dephosphorylierung und Ubiquitinierung 10,11,19,23,24,26-29 modifiziert. Für ein besseres Verständnis von der viralen RNA-Strukturen Aktivierung RIG-I und PKR (und in welchem ​​Stadium viralen Antagonisten könnte be stören), ist es wichtig, den Aktivierungszustand genau zu bestimmen. Für beide KFVs wurde zuvor beschrieben, dass die Aktivierung führt zur Entstehung von Trypsin-resistenten Proteinfragmente 6,17,30 und Oligomeren höherer Ordnung 6,18,19. Doch angesichts der Fülle von Literatur über diese Schlüsselfaktoren der Reaktion der antiviralen Wirts 1,2,24, Anwendung der direkten Methoden scheint vergleichsweise selten. In der Hoffnung auf anregende breitere Nutzung, bieten wir bequeme und sensible Protokolle robust analysieren die Aktivierungszustände von RIG-I und PKR. Die IFN zuständigen menschlichen Zelllinie A549 ist mit einem etablierten Aktivator von RIG-I und PKR, der gedämpft Rift-Valley-Fieber-Virus-Mutante Klon 13 (Cl 13) 31,32 infiziert. Nach einer einfachen Lyseverfahren sind die Extrakte aus infizierten Zellen durch Trypsin-Verdauung begrenzt / Western-Blot-Analyse getestet, um Konformationsänderungen Schalt bewerten und durch blaue nativen Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) / Western Blot analysist, um die Bildung von Oligomeren zu messen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Zellkultur</td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco</td><td>31985-47</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>PAA</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>PAA</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FCS)</td><td>PAA</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Chemikalien</td></tr><tr><td>L-1-tosylamido-2-phenylethylchlormethylketon-behandelt (TPCK) Trypsin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Antikörper</td></tr>Maus <tr><td>monoklonaler Anti-RIG-I-Antikörper (ALME-1)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-804-849-C100</td><td>WB: 1:500 in 1% Magermilch in TBS</td></tr><tr><td>Maus monoklonale Anti-PKR (B10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6282</td><td>WB: 1:500 in 1 % Magermilch in TBS</td></tr><tr><td>Kaninchen monoklonale Anti-P-PKR (Thr446)</td><td>Epitomics</td><td>1120-1</td><td>WB: 1:1.000 in 5 % BSA in TBS</td></tr><tr><td>Kaninchen polyklonale Anti-IRF-3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9082</td><td>WB: 1:500 in 1 % Magermilch in TBS</td></tr><tr><td>Kaninchen monoklonale Anti-P-IRF-3 (Ser386)</td><td>IBL</td><td>og-413</td><td>WB: 1:100 in 1 % Magermilch in TBS</td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-RVFV-Hyperimmunserum "C2" (MP-12)</td><td>Mit freundlicher Verfügung von Alejandro Brun CISA-INIA</td><td></td><td>WB: 1:2.000 in 1 % Magermilch in TBS</td></tr><tr><td>Monoklonales Maus-Anti-Beta-Aktin (8H10D10)</td><td>Zellsignalisierung</td><td>3700</td><td>WB: 1:1.000 in 1 % Magermilch in TBS</td></tr><tr><td>Polyklonale Peroxidase-konjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen-Milch</td><td>Thermo Fisher</td><td>0031460 1892914</td><td>WB: 1:20.000 in 1 % Magermilch bei TBS</td></tr><tr><td>Polyklonale Peroxidase-konjugierte Ziegen-Anti-Maus</td><td>Thermo Fisher 0031430 1892913</td><td></td><td>WB: 1:20.000 in 1 % Magermilch bei TBS</td></tr></tbody></table>

Überwachung aktivierung der antiviralen pattern recognition receptors rig-i und pkr durch begrenzte protease verdauung und native page

Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

Wirtsabwehr Virus-Infektion sind abhängig von einer schnellen Erkennung von Mustererkennungsrezeptoren (PRR) des angeborenen Immunsystems. Im Zytoplasma PRRS RIG-I und PKR binden an spezifische virale RNA-Liganden. Dies vermittelt ersten Konformationsänderung Schalt-und Oligomerisierung, und dann können die Aktivierung eines antiviralen Interferon-Antwort. Während Methoden zur antiviralen Wirts Genexpression zu messen sind gut etabliert, Methoden, um die Aktivierungszustände von RIG-I und PKR direkt zu überwachen sind nur teilweise und weniger gut etabliert. Hier beschreiben wir zwei Methoden, um RIG-I und PKR Stimulation bei der Infektion mit einem etablierten Interferon-Induktor, der Rift-Valley-Fieber-Virus-Mutante Klon 13 (Cl 13) zu überwachen. Begrenzte Trypsin Verdauung ermöglicht Änderungen der Proteaseempfindlichkeit zu analysieren, was auf Konformationsänderungen des PRRS. Trypsin Verdauung von Lysaten aus mock-infizierten Zellen führt zu einem schnellen Abbau von RIG-I und PKR, whereas Cl 13 Infektion führt zu der Entstehung eines Protease-resistenten RIG-I-Fragment. PKR auch eine Virus-induzierte Teilwiderstand Trypsin Verdauung, die mit ihrem Stempel Phosphorylierung an Thr 446 zusammenfällt. Die Bildung von RIG-I und PKR Oligomere wurde durch native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) bestätigt. Bei Infektion, gibt es eine starke Anhäufung von RIG-I und PKR oligomeren Komplexen, während diese Proteine ​​blieb als Monomere in mock infizierten Proben. Begrenzte Proteaseverdau und native PAGE, sowohl für Western-Blot-Analyse gekoppelt sind, erlauben eine sensible und direkte Messung von zwei verschiedenen Schritte des RIG-I und PKR-Aktivierung. Diese Techniken sind relativ einfach und schnell durchzuführen und keine teure Ausrüstung.

Die Anerkennung eines viralen Agonist von RIG-I oder PKR Konformationsänderung löst Schalt 6,17,30 und Oligomerisierung 6,18,27. Wir haben untersucht, diese beiden Aktivierungsmarker durch begrenzte Protease-Verdau und native Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) auf. Humanen A549-Zellen wurden mit Rift-Valley-Fieber-Virus-Klon 13 (Cl 13), die durch eine Mutation des IFN-Antagonisten 35,36 NSs dadurch infiziert ist. Aufgrund der Abwesenheit von Funktions NSs,...

Angeborene Abwehr von Virus-Infektionen werden durch Mustererkennungsrezeptoren (PRR) ausgelöst. Die beiden zytoplasmatischen PRRs RIG-I und PKR binden an viralen RNAs Unterschrift, ändern Konformation oligomerisieren, und aktivieren antivirale Signalisierung. Es werden Methoden beschrieben, die um die Konformationsänderungen Schalten und die Oligomerisierung dieser zytoplasmatischen PRRs bequem überwachen.

Überwachung Aktivierung der antiviralen Pattern Recognition Receptors RIG-I und PKR durch begrenzte Protease Verdauung und Native PAGE

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

Angeborene Abwehrmechanismen gegen Virusinfektionen werden durch Erkennungsrezeptoren für pathogentypische Muster oder PRRs ausgelöst. Diese sind in Zellen des angeborenen Immunsystems während einer Infektion vorhanden. Zytoplasmatische PRRs wie RIG-I und PKR binden an virale Signatur-RNAs, verändern ihre Konformation bei Ligandenbindung und aktivieren antivirale Signalwege. Um konformationelle Veränderungen von RIG-I und PKR sowie die Ligandenbindung in vitro zu untersuchen, werden humane A549-Zellen mit dem Rift-Valley-Fieber-Virus infiziert.Klon 13, um die PRR-Aktivierung zu stimulieren. Anschließend werden Zelllysate von Kontroll- und infizierten Zellen hergestellt, um Veränderungen in der Struktur von Rig-Eye und PKR zu analysieren. Eine begrenzte Trypsinverdauung wird durchgeführt.Wenn bestätigende Veränderungen in der Proteinstruktur aufgetreten sind, ist das Protein resistenter gegenüber dem Verdau, und Banden werden mittels Western-Blot-Analyse sichtbar. Zur Untersuchung der Bildung von allgas wird native PAGE durchgeführt, gefolgt von der Western-Blot-Analyse. Wenn eine vollständige Ligandierung stattgefunden hat, werden höhere all Liga rig eye- und PKR-Komplexe sichtbar.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir beschreiben ein Protokoll zu den wichtigsten Aufgaben der Host Signalmoleküle in lytische Replikation eines Modells Herpesvirus, gamma Herpesvirus 68 (γHV68) zu identifizieren. Mit Hilfe genetisch veränderter Mauslinien und embryonale Fibroblasten zur γHV68 lytische Replikation, erlaubt das Protokoll sowohl phänotypische Charakterisierung und molekulare Vernehmung von Virus-Wirt-Interaktionen in lytischen Replikation.

Sezieren Host-Virus-Interaktion in Lytic Replikation von einem Modell Herpesvirus

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Visualization of Viral Double-Stranded RNA and Host Pattern Recognition Receptors in Infected Epithelial Cells

Wir beschreiben ein Protokoll, um die antivirale Zytokin-Produktion in Mäusen mit einem Modell-Herpesvirus, murinen Gammaherpesvirus-68 (γ HV68) infiziert, die für die menschliche Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus (KSHV) und Epstein-Barr-Virus (EBV) eng verwandt ist, zu messen. Mit Hilfe genetisch veränderter Mausstämme und embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF), untersuchten wir die antivirale Zytokin-Produktion in vivo und ex vivo. "Reconstituting" den Ausdruck der angeborenen...

Zergliedern Angeborene Immunsystem Signaling in Viral Evasion von Zytokin-Produktion

Hier beschreiben wir ein Verfahren, das eine detaillierte Analyse der phosphorylierungsabhängigen Aktivierung des IRF3-Transkriptionsfaktors ermöglicht. Dies wird durch die Kombination einer hochauflösenden SDS-PAGE und einer nativen PAGE erreicht, die mit Immunoblots unter Verwendung mehrerer phosphospezifischer Antikörper gekoppelt ist.

Eine hohe Auflösung Methode zur Phosphorylierung abhängige Aktivierung von IRF3 Überwachen

Doppelsträngige RNA produziert während der RNA-Virus-Replikation man Muster Anerkennung Rezeptoren erkennt an eine angeborene Immunantwort zu induzieren. Für negativ-Sense-RNA-Viren bleibt die Interaktion zwischen dem Low-Level-DsRNA und PRRs unklar. Wir haben eine Methode konfokalen Mikroskopie Arenavirus DsRNA und PRR in einzelnen Zellen visualisieren entwickelt.

Konfokale Abbildung von Double-Stranded RNA und Muster Anerkennung Rezeptoren im negativen Sinn-RNA-Virusinfektion

Wir präsentieren experimentelle Ansätze für Studium RNA-Interaktoren des doppelsträngige RNA-bindende Proteinkinase RNA aktiviert (PKR) während des Säugetier-Zelle Zyklus mit HeLa-Zellen. Diese Methode nutzt Formaldehyd Crosslink RNA-PKR-komplexe und Immunopräzipitation PKR-gebundenen RNAs zu bereichern. Diese RNAs können weiter durch Hochdurchsatz-Sequenzierung oder qRT-PCR analysiert werden.

Studium der RNA Interaktoren des RNA während der Säugetier-Zelle Zyklus aktiviert Proteinkinase

In diesem Manuskript wird ein Protokoll zur FACS-basierten Messung der Transkriptionsaktivität des BK-Polyomavirus unter Verwendung von HEK293T-Zellen vorgestellt, die mit einem bidirektionalen Reporter-Plasmid transfiziert werden, das tdTomato und eGFP exzessiiert. Diese Methode ermöglicht es ferner, den Einfluss neuartiger Verbindungen auf die virale Transkription quantitativ zu bestimmen.

Messung der BK-Polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Eine native Western Blot-Methode zur Analyse der endogenen Interferon-Regulierungsfaktor 5-Dimerisierung in der CAL-1-Plasmazytoid-Dendritischen Zelllinie wird beschrieben. Dieses Protokoll kann auch auf andere Zelllinien angewendet werden.

Native Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese Immunoblot-Analyse der endogenen IRF5-Dimerisierung

Wir präsentieren ein allgemeines Protokoll zur Identifizierung kurzer Strecken homologe Wirt-Pathogen-Proteinsequenzen (SSHHPS), die in das virale Polyprotein eingebettet sind. SSHHPS werden durch virale Proteasen erkannt und leiten die gezielte Zerstörung bestimmter Wirtsproteine durch mehrere Viren der Gruppe IV.

Analyse von viralen SSHHPS der Gruppe IV mit In-vitro- und Silico-Methoden

Dieses Protokoll beschreibt eine umfassende Methode zur Beurteilung der Caspase-Aktivierung (Caspase-1, Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9 und Caspase-11) als Reaktion auf In-vitro - und In-vivo-Modelle (in Mäusen) von Infektionen, sterilen Beleidigungen und Krebs, um die Initiierung von Zelltodwegen wie Pyroptose, Apoptose, Nekroptose und PANoptose zu bestimmen.

Evaluierung der Caspase-Aktivierung zur Beurteilung des angeborenen Immunzelltods

Die Tyramid-Signalverstärkung während der Immunfluoreszenzfärbung ermöglicht den sensitiven Nachweis von phosphoryliertem RIPK3 und MLKL während der ZBP1-induzierten Nekroptose nach HSV-1-Infektion.

Tyramid-Signalamplifikation zur Immunfluoreszenzfärbung der ZBP1-abhängigen Phosphorylierung von RIPK3 und MLKL nach HSV-1-Infektion in menschlichen Zellen

Lernen Sie die Aktivierung der antiviralen Rezeptoren RIG-I und PKR durch begrenzte Protease-Verdauung und Native PAGE zu überwachen. Diese Methode ermöglicht die Analyse konformationeller Änderungen bei viralen Infektionen.

Überwachung Aktivierung der antiviralen Pattern Recognition Receptors RIG-I und PKR durch begrenzte Protease Verdauung und Native PAGE (Video) | JoVE Journal

Überwachung Aktivierung der antiviralen Pattern Recognition Receptors RIG-I und PKR durch begrenzte Protease Verdauung und Native PAGE

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