Quantitative Proteomics Mit reduktive Dimethylierung Stabile Isotope Labeling

Summary

Stabile Isotopenmarkierung von Peptiden durch reduktive Dimethylierung (Redi-Markierung) ist eine schnelle, kostengünstige Strategie für genaue Massenspektrometrie-basierte quantitative Proteomik. Hier zeigen wir ein robustes Verfahren für die Aufbereitung und Analyse von Proteingemischen mit Hilfe der redi Ansatz, der auf fast jedem Probentyp angewandt werden kann.

Abstract

Stabile Isotopenmarkierung von Peptiden durch reduktive Dimethylierung (Redi Kennzeichnung) ist eine Methode, um genau zu quantifizieren Proteinexpressionsunterschiede zwischen den Proben mit Hilfe der Massenspektrometrie. Redi Kennzeichnung erfolgt mit entweder regelmäßig (Licht) oder deuteriertes (Schwer-) Formen von Formaldehyd und Natriumcyanoborhydrid zu zwei Methylgruppen an jedem freien Amin hinzufügen. Hier zeigen wir, einen robusten Protokoll für REDi Kennzeichnung und quantitativen Vergleich von komplexen Proteingemischen. Proteinproben für den Vergleich sind in Peptide, beschriftet, entweder leicht oder schwer Methyl-Tags, gemischt und mittels LC-MS/MS analysiert Co-tragen verdaut. Relative Protein Häufigkeiten werden durch den Vergleich der Ionenchromatogramm Peakflächen von schweren und leichten markierten Versionen der Peptidbestandteil von der vollen MS-Spektren extrahiert quantifiziert. Das hier beschriebene Verfahren umfasst die Probenvorbereitung durch Umkehrphasen-Festphasenextraktion, On-Column-Redi Markierung von Peptiden, Peptid-Fraktionierung durch basischen pH-reversed-Phase (BPRP) Chromatographie und StageTip Peptidreinigung. Wir diskutieren Vorteile und Grenzen der redi Kennzeichnung gegenüber anderen Methoden zur stabilen Isotopen Gründung. Wir zeigen neue Anwendungen mit Redi Kennzeichnung als eine schnelle, kostengünstige und genaue Methode, um die Proteinhäufigkeiten in fast jeder Art von Probe zu vergleichen.

Introduction

Messkonzentrationsunterschiede vieler Proteine ​​zwischen komplexen Proben ist eine zentrale Herausforderung in der Proteomik. Zunehmend wird dies durch Markierung von Proteinen in jeder Probe mit unterschiedlichen Isotopen-Tags, die Kombination der Proben und mit Hilfe der Massenspektrometrie, um Konzentrationsunterschiede zu quantifizieren getan. Es gibt verschiedene Verfahren für stabile Isotopenmarkierung von Proteinen und Peptiden. Kennzeichnung ¹⁵ N ¹ und ² SILAC vorstellen Isotopenmarkierungen metabolisch in vivo, während iCAT ^3, iTRAQ ^{4, 5} und Reduktion Dimethylierung nach der Proteinextraktion u....

Protocol

HINWEIS: Diese Methode wurde bereits beschrieben ^12.

1. Proteinisolierung

Herstellung von 1 mg Zellprotein durch Lysieren von Zellen, vorzugsweise durch physikalische Methoden wie Französisch Presse Wulst Schlagen oder Ultraschallbehandlung. Vermeiden Lysozym-vermittelte Zell-Lyse, weil das Enzym Massenspektrometrie Messungen zu verwechseln.

2. TCA-Fällung von Proteinen

1 Volumen Trichloressigsäure (TCA) bis 4 Volumen Protein-und Chill auf Eis für 10 min, um Proteine ​​zu fällen. Zentrifuge bei 12.000 × g für 5 min bei 4 ° C und Entfernen des Übe....

Results

Wir untersuchten die Genauigkeit, Präzision und Reproduzierbarkeit der redi Kennzeichnung mit Saccharomyces cerevisiae und Clostridium phytofermentans Ganzzelllysaten. Wir haben zuerst quantifiziert die redi Markierungseffizienz aus einer Mischung von C phytofermentans Proteinlysate aus Cellulose (schwere beschriftet, H) und Glucose (Licht-Label, L) Kulturen. Wenn ein Peptid False Discovery Rate 1% gefiltert, enthielt diese Probe 11.194 einzigartige Peptidsequenzen mit einer Redi Markierungsef.......

Discussion

Einige Punkte machen stabilen Isotopenmarkierung von Peptiden mittels reduktiven Dimethylierung (Redi Kennzeichnung) eine attraktive Methode für die quantitative Proteomik: kostengünstige Markierungsreagenzien (Reagenzien kostet weniger als $ 1 pro Probe), schnelle Reaktionsgeschwindigkeit (~ 10 min), das Fehlen von Nebenprodukten, hohe Reproduzierbarkeit (Fig. 3, 4), stabiler Reaktionsprodukte, die Fähigkeit, eine beliebige Protease verwendet, und hohe Ionisierungseffizienz von markierten Peptiden. Che.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trichloressigsäure	Sigma-Aldrich	T9159	Proteinfällung
Aceton	Sigma-Aldrich	650501	Proteinfällung
Natriumdodecylsulfat	Sigma-Aldrich	71736	Denaturierung, Proteinreduktion
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich	S8045	Denaturierung, Proteinreduktion
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43816	Denaturierung, Reduktion, Alkylatprotein
Proteasehemmer Complete Mini Cocktail	Roche	4693124001	Denaturierung, Reduzierung des Proteins
Iodacetamid	Sigma-Aldrich	I6125	Alkylatprotein
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523	Resuspendierung, Extrakt, Markierung Protein
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	C5670	Protein resuspendieren
Lysyl-Endoprotease	Wako Chemicals	129-02541	Proteinaufschluss
Trypsin in Sequenzierungsqualität	Promega	V5111	Proteinaufschluss
Essigsäure	Sigma-Aldrich	320099	Proteinaufschluss
Trifluoressigsäure	Sigma-Aldrich	299537	Umkehrphasen-Peptidextraktion
tC18 Sep-Pak C18 Kartuschen	Wasser	WAT054960	Umkehrphasen-Peptidextraktion
Extraktionsverteiler	Wasser	WAT200609	Umkehrphasen-Peptidextraktion
Acetonitril	Sigma-Aldrich	14261	verschiedene
Formaldehyd	Sigma-Aldrich	252549	" Licht" Peptidmarkierung
Cyanoborohydrid	Sigma-Aldrich	71435	" Licht" Peptidmarkierung
Deuteriertes Formaldehyd	Sigma-Aldrich	492620	" schwer" Peptidmarkierung
Natriumcyanoborodeuterid	CDN-Isotope	D-1797	" schwer" Peptidmarkierung
MES	Sigma-Aldrich	M3671	Peptidmarkierung
C18-HPLC-Säule (4,6 x 250 mm, 5 & Mikro; m Partikelgröße)	Agilent	770450-902	basische pH-Umkehrphasenchromatographie
Ameisensäure	Sigma-Aldrich	399388	diverse
C18 Empore Scheiben	3M	14-386-3	STAGE-Tipps
Methanol	Sigma-Aldrich	494437	STAGE Spitzen