Summary
레티노 산으로 기본 마우스 조골 세포의 치료는 골 세포의 형태 학적 및 분자 기능 베어링 분지 세포의 균일 한 인구를 생산하고 있습니다. 방법은 획득 및 배양 주 골 세포를 유지의 어려움을 극복하고, 형질 전환 모델 유래 세포를 연구하는 것이 유리할 수있다.
Abstract
골 세포 배양의 필요성은 잘 뼈 연구원의 지역 사회에 알려져있다; 기본 골 세포의 분리가 어렵고, 낮은 세포 수를 생산하고 있습니다. 따라서, 가장 광범위하게 사용되는 셀룰러 시스템은 골 세포 조의 MLO-Y4 세포주이다.
여기에서 설명하는 방법은 형태 학적 및 분자 골 세포의 기능과 분지 세포의 균일 한 인구를 생성하는 레티노 산의 사용을 말합니다.
쥐의 두개골로부터 골아 세포의 분리 후, 모든 - 트랜스 레티노 산 (ATRA)이 세포 배지에 첨가하고, 셀 모니터링 도립 현미경으로 매일 수행된다. 첫 번째 형태 학적 치료와 차별화 2 일 후에 탐지 가능하면 수상 돌기 세포 외 기질을 생산하는 능력의 손실, 조골 세포 마커의 다운 규제의 점진적 발전과 함께 5 일에서 일반적으로 완료까지 규제 골 세포 특정 분자의.
콘텐츠는 "> 일일 셀 모니터링 때문에 일차 세포의 고유 변동의 필요, 및 프로토콜은 상이한 마우스 균주로부터 얻어진 형질 전환 모델에 적용된 셀에 최소 변화에 적응 될 수있다.방법은 수행하기 쉽고, 특수 장비를 필요로하지 않으며, 이는 높은 재현성으로, 급속 무제한 생물학적 응용을위한 이들 세포의 사용을 허용하는, 세포 외 기질의 완전한 부재 하에서 성숙한 골 세포 집단을 생성한다.
Introduction
골 세포, 가장 풍부한 뼈 세포 유형은 깊게 골격 내에있는 고도로 분지의 말단 분화 세포이다. 성숙한 골 세포의 세포체는 뼈 lacunae에 포함되는 다양한 형태를 가지고있다; 둥근 골 세포가 뼈 소주 1에서 더 자주 반면 신장 세포 기관과 골 세포는 대뇌 피질의 뼈에서 발견된다. 분지 수상 돌기는 다른 골 세포와, 또한 다른 뼈 세포 유형, 골수, 혈관과 관련된 혈관 주위 세포와뿐만 아니라 여러 연락처를 만드는 복잡한 웹을 형성, 눈물 소관이라는 작은 채널에서 세포체에서 연장 상주합니다. lacunae 및 소관에 함유 간질 유체를 통해, 골 세포는 그러므로 지역뿐만 아니라 전신적인 이벤트 및 그 반대의 동작은 로컬 및 전신의 변화 (2)에 의해 조절 될 수뿐만 아니라 영향을 미칠 수있다, 또한 궁극적으로 순환 시스템에 연결된다.
골 세포의 연구는 최근, 이러한 조직과 세포 고유의 형질 전환 동물의 발생, 강력한 현미경 기술과 높은 처리량 분자 스크리닝 3,4의 사용과 같은 몇 가지 기술적 진보, 덕분에 힘을 얻고있다. 그러나, 이들 세포의 기술은 주로 시험 관내 모델에서의 적절한 상대적 부족에 여전히 불완전하다. 사실, 골 세포로 인해 깊은 위치의 획득과 문화에 유지하는 것이 곤란하고, 이러한 분화 된 세포 유형을 특징 짓는 확산의 낮은 수준했습니다.
그들은 일반적으로 낮은 세포 수율을 생산하고 심지어 몇 오염 아세포 급속 골 세포 8 자라다 할 위험을 가지고 있지만 년 함께, 다수의 방법은, 일차 5-7 골 세포를 분리하기 위해 개발되었다. 이러한 이유로, 체외 작업에 대부분의 실험은 잘 확립 된 골 세포의 세포 L에 지금까지 실시 된오프라인 MLO-Y4 9.
추가 시험 관내 방법이 세포 연구의 가능성을 향상시킬 수와 골 세포 생물학 및 병태 생리의 분석을 향상시킬 수 있습니다. 주로 채택 될 것으로, 이러한 방법은 쉽게 재현해야하며, 세포 성숙에 도달하기 위해 특수 장비 또는 매우 긴 시간이 필요하지 않을 것입니다. 일차 전지에 적용 할 경우 중요한 것은, 그들은 그것이 가능한 형질 전환 동물을 활용하도록 만들 것입니다. 우리는 최근 조골 세포주 MC3T3-E1 지점 레티노 산과 차 조골 세포의 치료는 골 세포 (10)의 형태 및 분자의 특징을 담 분지 셀 균질 집단의 발전을 선도 급속한 표현형의 변화를 유도하는 것을 설명했다.
모든 - 트랜스 레티노 산 (ATRA)는 핵 레티노 산 수용체 (RAR들)을 결합하여 유전자 전사를 조절하는 비타민 A의 활성 대사 제품입니다. RAR의궁극적으로 레티노 산 (RA) 응답 표적 유전자 (11)의 변조로 이어지는, 레티노이드 X 수용체 (RXRS)와 이종로 DNA에 결합. ATRA는 신경 세포 (12)와 족 세포 (13)와 같은 다른 분지의 세포가 그 (것)들의 사이에서, 여러 종류의 세포 분화와 성숙을 조절하는 것으로 알려져있다.
여기서 설명한 방법은 일차 골아 세포에 ATRA의 첨가에 기초한다. 효과적이기 위하여, ATRA는 정의 된 밀도에서 도금 셀에 정확한 성숙 단계에서 첨가 할 수있다; 우리의 경험에서 이러한 조건은 조골 세포의 골 세포로 표현형의 스위치를 얻을 중요합니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 국립 과학적인 목적을 위해 사용하고 검토와 밀라노 대학의 윤리위원회에 의해 승인 된 동물의 보호에 관한 유럽의 현재의 규정에 따라 수행되었다.
차 조골 세포의 1. 격리
상기 방법은, 사소한 수정으로, Dodig 등 (14)에 의해 기술 된 절차를 따른다.
- 0.1 % 콜라게나 제 P와 0.05 %를 추가하여, 매체를 소화 준비 HBSS 매체 (행크스 균형 소금 솔루션, 아니 칼슘, 마그네슘, 또는 페놀 레드)에 (2.5 % 트립신 10 배, 아니 페놀 레드에서 시작) 트립신.
- 3~4일 이전 마우스를 사용하여 (절차 1 마우스 적은에 적용될 수있다.)
- 잘린 희생. 70 % 에탄올로 머리를 살포하고 얼음에 보관. 핀셋과 해부 / 외과 가위로 피부와 근육 층을 제거합니다.
- 부드럽게 정수리 뼈를 제거하고두 반쪽의 시상 봉합에 따라 구분합니다. 반드시 뼈를 봉합하고 자기편 조직 무료입니다 확인하고 절차가 완료 될 때까지 HBSS 매체를 포함하는 잘 접시에 개별 뼈 조각을 배치합니다.
- HBSS를 취소하고 각 웰에 추가 37 ℃에서 15 분 동안 소화 매체
- 상층 액을 버린다.
- 다시 37 ℃에서 15 분 동안 소화 매체를 추가
- 이 시간은 상등액을 저장하고 10 % FBS (태아 혈청)과 1 % 스트렙토 마이신 / 페니실린과 보충 α-MEM (최소 필수 중간)에 배치합니다.
- 반복은 1.7 및 1.8 배 단계를 반복합니다.
- 5 분 425g에 원심 분리하여 세 수집 분수, 스핀 세포 해변, 상층 액을 버린다 세포 펠렛을 재현 탁하는 보충 알파-MEM 3 ㎖를 추가하고, 전송 25cm 2 플라스크.
- 파편과 죽은 세포를 제거하는 24 시간 후에 매체를 변경합니다.
- 50 ㎍ / ㎖의 아스 코르 빈산 (AA)과 글리 3 밀리미터 추가cerol 2 - 인산이 나트륨 염 α-MEM 배지로 하이드레이트 (GP).
- 그 후, 매일 (α-MEM 플러스 AA / GP) 매체를 변경합니다.
2. ATRA 프로토콜
- 불 활성화를 방지하기 위해 어두운 방에 ATRA (모든 - 트랜스 레티노 산) 모든 실험을 실시한다.
- HBSS 매체 1X 트립신 용액을 제조하고 사용할 때까지 37 ° C로 유지한다.
- subconfluent 세포에서 매체를 제거하고 조심스럽게 HBSS로 세척.
- 1 ML 트립신을 추가, 부드럽게 모든 세포는 트립신에 의해 보호 될 수 있도록 플라스크를 회전하고, 37 ℃에서 3 분 동안 품어
- 거꾸로 현미경으로 세포의 실제 분리를 확인합니다.
- 트립신을 불 활성화하는 α-MEM 배지 3 ㎖를 추가합니다.
- 세포를 복구하고 425g에서 15 분 동안 원심 분리.
- 신선한 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁.
- 혈구 계산 챔버의 하락을 놓고, 몇 분 동안 정착 할 수 있도록하고 CE를 계산LL 번호.
- 10,000 세포 / α-MEM 플러스 AA / GP와 cm 2의 밀도로 25cm 2 플라스크에 넣고 세포. 세포 밀도 세포 프로세스와 세포 간 접촉의 최적의 개발에 관련된주의하십시오. 초기 밀도 이상 10,000 세포 / cm 2가 세포 프로세스의 적절한 발달을 저해하지만, 낮은 세포 수로 인해 세포 간 접촉의 부재로, 조기 세포 사멸의 원인.
- 매 24 시간 매체에 5 μm의 ATRA를 추가합니다.
- 형태 학적 변화는 일반적으로 48 시간 후에 관찰 : 형태를 평가하기 위해 매일 세포를 모니터링합니다. 제 24-48 시간 후에, 세포 증식이 정지되어있는 경우, 상기 밀도 replate. 성숙한 골 세포의 균일 한 인구 4 ~ 5 일 후에 존재합니다. 필요에 따라 12 ~ 15 일까지의 임의의 시점에서 전지를 사용한다.
- 세포 (예 : 커버 슬립이나 잘 플레이트와 같은) 다른 지원에 도금하는 경우, 위의 밀도가 유지되어 있는지 확인하고사용할 때까지 ATRA마다 24 시간을 추가로 진행합니다. 실험하기 전에 적어도 24 시간에 대한 새로운 지원을 준수 세포를 둡니다.
3. 면역 염색
- 면역 염색의 경우, 커버 슬립에 세포를 플레이트 (버리 (15) 예를 들어 참조) 설치 방법을 따르십시오.
- 예를 들어, 간접 면역 형광에 대해, 30 분 동안 RT에서 어두운 이차 형광 표지 된 항체와 그 후, 가습 챔버 내에서 1 시간 동안 RT에서 일차 항체로 순차 부화, 4 % 파라 포름 알데히드 또는 차가운 아세톤으로 고정 가습 실에서.
- 핵 counterstaining에 DAPI 또는 유사체를 사용하고 중간 안티 페이딩에 탑재합니다.
4. 알리자린 레드 염색 및 추출
- 커버 슬립에 세포를 접시.
- 10 분 동안 70 % 에탄올에 coverslip에 침지하여 세포를 고정합니다.
- 알리자린 레드 염색 액의 일부 방울 (1 ㎎ / ㎖, pH를 5.5)와 함께 세포를 커버30 분.
- 수돗물로 커버 슬립을 씻으십시오. 유리 슬라이드에 글리세롤의 드롭으로 장착하고 수직 배의 현미경 20X 배율을 사용하여 이미지를 가지고.
- 위의 과정 후, 수돗물에 슬라이드를 담가 커버 슬립을 복구 할 수 있습니다.
- 웰 플레이트의 각 coverslip에 넣습니다.
- 60 % 과염소산 (양 완전히 세포를 커버 할 수있을 정도로 충분히 커야합니다)를 추가하고 교반과 함께 4 ° C에서 O / N 두십시오.
- 450 nm 파장에서 분광 광도법에 의해 상층의 광학 밀도를 참조하십시오.
- 세포 수에 대한 값을 정규화하기 위해, 10 분 동안 세포 제제 다루 야누스 그린 (PBS에 0.2 % 용액)를 추가한다.
- 초순수로 조심스럽게 세척 할 것.
- 0.5 N 염산을 (양 모든 세포를 커버 할 수있을 정도로 충분히 커야합니다)를 추가하고 몇 초 동안 손으로 가볍게 흔들어.
- 분광 광도계로 615 nm에서 흡광도를 참조하십시오.
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Representative Results
결과는 5 개의 독립적 인 실험 10을 얻었다.
세포 형태
AA / GP는 일차 전지는 대부분 조약돌 같은 기능, 성숙한 조골 세포의 특성을 가지고 처리. 산재 분지 세포 (그림 1A에서 빨간색 화살표로 표시된)을 가능성이 골 세포를 대표하는 찾을 수 있습니다.
ATRA 치료로, 세포는 빠르게 일반적으로 이일 후 관찰되는 파급 효과를 표시하기 시작합니다. 도 1b에 도시 된 바와 같이, 분지 세포들은 수상 돌기를 확장하는 공간을 필요로한다. ATRA의 진행과 치료로, 파급 효과가 점진적으로 수와 복잡성의 증가, 1C 및 1D 피규어. 로다 민 - 라벨 phalloidin도에 의해 사상 굴지의 염색은 phalloidin도, 그림 2에 표시되어 세포 프로세스를 강조한다.
매트릭스 생산
<P 클래스 = "jove_content"> 차 조골 세포가 이상 세포 사이에 축적과 빨간색 염색, 그림 3A를 알리자린으로 시각화 할 수 석회화 매트릭스, 많은 양을 생산하고 있습니다. 골 세포는 석회화 된 세포 외 기질을 생산하고, ATRA - 배양 세포, 그림 (b)에 완전히 부정적인 알리자린 레드 염색 결과가 없습니다. 따라서, 알리자린 레드의 아무도 또는 최소한의 양이 추출 조작,도 3c 후에 측정 될 수 없다.골 세포 마커 및 제품
Sclerostin는 ATRA 처리 된 세포에 의해 표현된다, 그림 4. 면역 염색은 강렬한 세포질 발현 및 세포 프로세스에 따라 긍정적 인 점의 존재를 알 수있다. 면역 형광에 의해, 강한 FGF23 양성은 세포체에서 또는 세포 과정을 따라 하나, ATRA-처리 된 세포,도 5의 검출이다.
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그림 1. 광학 현미경. 차 조골 세포가 AA / GP (A) (스케일 바 100 μm의)와 오일 배양 후 주된 입방 모양을 보여줍니다. 부족한 분지 셀 (A) (화살표) 식별 될 수있다. ATRA 치료 (B) (스케일 바 100 μm의)의 2 일 후, 세포가 더 긴 형태를 표시하고 수상 돌기가 명확하게 감지 나타납니다. 만 arborized 세포는 ATRA 배양 (C) (스케일 바 100 μm의)의 5 일 후에 관찰하고, 높은 배율 (D) (스케일 바 50 ㎛)로 더 잘 감지 할 수있다 할 수있다.
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그림 2. 액틴 필라멘트 염색. 액틴 필라멘트는 로다 민 - falloidin 염색에 의해 식별됩니다. 그림은 3 일 동안 ATRA로 처리 된 세포에서 얻은 대표적인 결과를 보여줍니다. 이미이 시점에서, 사상균 액틴 세포 프로세스 개발의 주요 성분으로서 나타난다. 스케일 바 : 50 μm의.
그림 3. 석회화 예금. ATRA - 배양 세포 (B) (스케일 바 50 ㎛)에 부정적인 반면, 알리자린 레드 염색이 확산, AA / GP (A) (스케일 바 100 μm의)와 오일 배양 후 조골 세포에서 관찰된다. 심오한 차이 SPECT에 의해 측정 될 수있다roscopy 알리자린 추출 (C) 후.
그림 4. Sclerostin. Sclerostin 양성은 세포질과 ATRA (스케일 바 50 μm의)와 함께 배양 세포의 세포 과정을 따라 검출된다.
그림 5. FGF23. FGF23의 면역 염색은 ATRA 처리 된 세포 (스케일 바 50 ㎛)에 강렬한이다.
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Discussion
지난 몇 년 동안 골 세포가 뼈에서 가장 중앙 세포로 떠오르고있다. 연구의 발전은 점진적으로 뼈 질환의 다양한 소설과 더 나은 치료를 디자인하는 엄청난 가치가 이전에 의심받지 검증되지 않은 골 세포의 속성의 수를 공개하고 있습니다. 그러나, 골 세포 생물학의 연구는 골 세포와 같은 세포 라인 MLO-Y4가 제공되기 전에 조골 세포가 오랜 기간 동안 대리 세포로 사용되어왔다있을 정도로 체외 모델의 제한된 가용성을 앓고있다. 최근 조건부 불후의 세포 라인은 sclerostin 및 FGF23 표현 후반 골 세포를 분지하는 차별화 할 수있는 같은 그룹에 16 일 소개했다. 이들 세포주의 극한값이 질문하에 있지인데, 그것은 매우 잘 일차 전지보다 생체 내 상황을 닮고 차 골 세포의 FR을 얻을 가능성을 제공하는 것으로 알려져있다톰 형질 전환 동물의 특정 분자 경로에 대한 연구 기능을 수행 할 수 있습니다.
격리 먼저 5,6이어서 쥐, 마우스 뼈 17,7에서 병아리 뼈에서 얻은 차 골 세포의 문화는 매우 유용하지만, 자신의 격리 절차 당 세포의 작은 수를 생성하고, 세포의 순도는 큰 범위에 의존 개인의 전문 지식. 따라서,이 방법은 현재는 실험실의 한정에 의해 사용된다.
다른 연구 그룹은보다 생리적 환경을 구성하지만, 후속 연구의 응용 프로그램에 장애물 세 가지 차원 광물 매트릭스 18, 19, 진행성 매립을 통해 조골 세포의 터미널 분화를 유도하여 성숙한 골 세포를 획득했습니다. 그것은 매트릭스 광물 (20)뿐만 아니라, 낮은 산소 분압 (21), 골 세포의 성숙의 생리 트리거 있다는 사실이다. 그러나 충족hodology 이들 두 조건을 회피하는 가능성을 증가시키고 세포의 사용을 확장 할 수 있었다. 골아 세포 성숙 레티노 산을 첨가 이루어져 제안한 방법 (10)는, 간단한 높은 재현성으로, 세포 형질 감염 (22) 또는 고가의 성장의 사용이 (23)를 인자를 피할 수있다.
일련의 예비 실험으로, 우리는 시작 셀 번호가 여러 가지 돌기 및 세포 간 접촉의 중요한 단계, 컨디셔닝 적절한 형성 것으로 판정. 너무 낮은 숫자가 세포 간 유착의 손실이 발생할 수있는 반면, 너무 높은 도금 세포 밀도는 세포의 고통과 죽음에 이르는, 복잡성 및 세포 프로세스의 확장에 영향을 미칩니다.
중요한 것은, ATRA 투여하고 세포 형태의 일일 모니터링의 조정은 매우 때문에 ATRA에 대한 민감도에 영향을 미칠 수있는 일차 전지의 고유 변동성을 추천합니다. 이러한 측면은 특히 관련 갔지 될 수 있습니다N 방법은 형질 전환 모델에 적용됩니다.
덴 드라이트가 사상균 액틴 풍부하기 때문에 세포 프로세스의 개발은 액틴 염색에 의해 감시 될 수있다.
이곳은 골 세포가 석회화 행렬을 생성하지 않는 것이 알려져 있으며, 알리자린 레드 염색의 완전한 부정까지 점진적 감소에 의해 같이 ATRA 배양 빠르게,이를 폐지한다. 한편, ATRA는 특히 24 sclerostin 잘 알려진 골 세포 마커의 발현을 유도하고, FGF23, 뼈 및 25를 처리 전신성 포스페이트 개인 근본적인 성장 인자의 생산을 보장한다. 따라서, 골 세포에 FGF23과 sclerostin의 기능적 역할을 조사하기위한 추가 연구는 이러한 분자의 내인성 생산에 의해 촉진됩니다.
요약하면, 우리는 레티노 산으로 치료 차의 두개골 세포로부터 성숙한 골 세포의 균일 한 인구를 생성한다는 것을 보여야생형과 형질 전환 동물 모두에서 골 세포의 간단하고 빠른 준비를 허용 refore. 다른 방법에 비해, 우리의 프로토콜은 몇 가지 장점, 주로 간단한 응용 프로그램과 높은 재현성을 제시하는 것 같다. 골 세포의 성숙 과정은 5 일간의 프레임에서 발생하는 여러 단계를 통해 프로세스의 확산 초기부터 세포의 적절한 숫자에서 연구 될 수있다. 또 다른 장점으로, 성숙한 골 세포는 무제한 분자와 기능적 분석법의 응용을 허용 광물 매트릭스를 둘러싼 완전한 부재 하에서 얻어진다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
기금은 "PROGETTO concorso 폰다 치오 IRCCS 오스 페달 마조 레 Policlinico 2009년부터 2010년까지"MD, 그리고 Associazione 밤비노 Nefropatico ABN Onlus, 밀라노에 의해 제공되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Pre-warm at 37 °C before use |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Streptomycin/Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Protect ATRA from light |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in PBS and filter before use. Always work under a chemical hood. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Can be added to the secondary antibody |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 176745 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Fluorsave | Calbiochem - Merck | 345789 | |
| Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5 mm tips | World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45 mm tips | World Precision Instruments | 501978 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm curved | World Precision Instruments | 14394 | |
| Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Culture flasks | Corning | 430168 | |
| Well-plates | Corning | 3335 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| Microscope | Zeiss Apotome | ||
| Spectrometer | Safas Xenius |
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