Summary
O grau de disfunção vascular e contribuindo mecanismos fisiológicos podem ser avaliados em pacientes com doença renal crônica através da medição do fluxo-mediada dilatação da artéria braquial, a velocidade da onda de pulso da aorta, e expressão da proteína de célula endotelial vascular.
Abstract
Pacientes com doença renal crônica (DRC) tem aumentado significativamente o risco de doença cardiovascular (DCV) em comparação com a população em geral, e isso é apenas parcialmente explicada por fatores de risco para DCV tradicionais. A disfunção vascular é um importante fator de risco não-tradicional, caracterizada por disfunção endotelial vascular (mais comumente avaliadas como deficientes endotélio-dependente dilatação [EDD]) e enrijecimento das grandes artérias elásticas. Embora existam várias técnicas para avaliar EDD e rigidez artéria elástica grande, o são mais comumente usado dilatação fluxo-mediada da artéria braquial (FMD BA) e velocidade da onda de pulso da aorta (aPWV), respectivamente. Ambas as medidas não invasivas de disfunção vascular são preditores independentes de eventos cardiovasculares futuros em pacientes com e sem doença renal. Os pacientes com DRC demonstrar tanto prejudicada FMD BA, e aumentou aPWV. Embora os mecanismos exatos pelos quais a disfunção vascular desenLops na DRC são completamente compreendidos, aumento do estresse oxidativo e conseqüente redução de óxido nítrico (NO) biodisponibilidade são importantes contribuintes. Alterações celulares no stress oxidativo pode ser avaliada através da recolha de células endoteliais vasculares a partir da veia antecubital e medição da expressão de marcadores de proteína de stress oxidativo por imunofluorescência. Nós fornecemos aqui uma discussão destes métodos para medir a febre aftosa BA, aPWV e expressão da proteína de célula endotelial vascular.
Introduction
A doença renal crônica (DRC) é um importante problema de saúde pública que atinge proporções epidêmicas, afetando ~ 11,5% da população nos Estados Unidos sozinho 1. O risco de morte cardiovascular ou um evento cardiovascular em pacientes com doença renal crônica é significativamente maior em comparação com a população em geral 2-4. Embora os pacientes com DRC apresentam uma alta prevalência de fatores de risco cardiovascular tradicionais, isso só explica parte do seu aumento da incidência de doenças cardiovasculares (DCV) 5. A disfunção vascular é um importante fator de risco cardiovascular não tradicional ganhando crescente reconhecimento no campo da nefrologia 6-9.
Enquanto muitas mudanças provavelmente contribuem para o desenvolvimento de disfunção arterial, entre aqueles de maior preocupação é o desenvolvimento de disfunção endotelial vascular, mais comumente avaliado como auditivos dilatação dependente do endotélio (EDD), e endurecimento da large artérias elásticas 10. Existem várias técnicas para avaliar EDD e rigidez artéria elástica grande, mas o mais comumente utilizados são a dilatação da artéria braquial mediada pelo fluxo FMD BA e velocidade da onda de pulso da aorta (aPWV), respectivamente. Outra técnica comumente usada para avaliar EDD está medindo antebraço resposta do fluxo sanguíneo para agentes farmacológicos tais como a acetilcolina, utilizando oclusão venosa pletismografia 11,12. No entanto, esta metodologia requer cateterização da artéria braquial, que é mais invasivo do que a febre aftosa BA e pode ser contra-indicado em pacientes com DRC. Uma técnica alternativa para avaliar a rigidez arterial é medir a complacência arterial local (o inverso da rigidez) da artéria carótida, embora isso não seja tão amplamente utilizado ou validado com desfechos clínicos como aPWV 13.
Os pacientes com DRC demonstrar tanto prejudicada FMD BA 14-16 e aumento da velocidade da onda de pulso da aorta-aPWV 13,17,18, mesmo antes de precisar de diálise. É importante do ponto de vista clínico, essas duas medidas não invasivas de disfunção vascular são preditores independentes de eventos cardiovasculares e mortalidade, tanto em pacientes com DRC 19-21, bem como em outras populações 22-26. Estas técnicas podem ser aplicadas ao estudo de várias populações de risco de DCV, incluindo pacientes com DRC.
Os mecanismos exatos pelos quais a disfunção arterial desenvolve na DRC são completamente compreendida; No entanto, o óxido nítrico reduzida (NO) a biodisponibilidade é um contribuinte crítico 27-30 e um mecanismo comum de ambos auditivos EDD e aumento da rigidez arterial 10,31. Em DRC, estresse oxidativo é aumentada e contribui para a redução da biodisponibilidade 32-34. O estresse oxidativo é definido como biodisponibilidade excessiva de espécies reativas de oxigênio (ROS) em relação às defesas antioxidantes. Estímulos fisiológicos, including sinalização inflamatória, promover sistemas de enzimas oxidantes para produzir ROS, incluindo ânion superóxido (O 2 ● -) (por exemplo, a enzima oxidante NADPH oxidase.) 35. A produção de superóxido leva a um reduz a biodisponibilidade de óxido nítrico (NO).
Prejudicada biodisponibilidade por sua vez pode contribuir para o desenvolvimento da DRC, como a disfunção endotelial é um preditor independente de CKD incidente 36. Isto é consistente com os dados de animal, indicando que a inibição da eNOS induz hipertensão (sistêmica e glomerular), isquemia glomerular, glomeruloesclerose, e túbulo-intersticial lesão 37. De fato, redução da biodisponibilidade parece ser necessário para o desenvolvimento e progressão da doença renal experimental que imita a doença humana, sugerindo um papel fundamental para a disfunção endotelial em CKD humano 38,39.
Os marcadores de estresse oxidativo vascular pode ser avaliada em vascular células endoteliais coletadas de sujeitos da pesquisa, usando uma técnica originalmente desenvolvida por Colombo et al. 40 e modificado Seals et al 41-43. Usando 2 estéreis J-fios, as células são recolhidas a partir da veia antecubital, recuperadas, fixadas e depois positivamente identificado como as células endoteliais e analisados para a expressão de proteínas de interesse utilizando a imunofluorescência.
Nós fornecemos aqui uma discussão sobre essa metodologia que pode ser utilizada para a) medida FMD BA; b) medir aPWV; c) medir a expressão de proteínas da célula endotelial vascular de marcadores de estresse oxidativo. O foco está em pacientes com DRC, não necessitando de diálise crônica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Este protocolo segue as diretrizes do Conselho de Revisão Institucional Múltipla Colorado (COMIRB).
1. Preparação para a sessão de testes
- Os participantes devem seguir estas restrições para medições mais precisas: 12 hr rápido de alimentos e cafeína, 12 hr contenção de exercício, 12 hr restrição de fumar, se,> 4 contenção meia-vida aplicável a partir de medicamentos, se possível (pode não ser viável em um população, tais como pacientes com DRC), e as mulheres na pré-menopausa deve ser testada em dias 1-7 do ciclo menstrual para minimizar influências hormonais.
- Preparar 500 ml do tampão de dissociação por adição de 2 ml de 0,5 M ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 0,05 g de heparina (180 unidades USP / mg), e 2,5 g de albumina de soro bovino a 476,8 ml de tampão fosfato salino (PBS) a pH de 7,4. Este pode ser armazenado a 4 ° C durante vários meses.
- Ligue ultra-som, computador, ea hemodinâmica não-invasivaWorkstation (NIHem, equipamentos de rigidez arterial). Conecte os cabos a saída de ultra-som para a caixa de gatilho a onda R computador.
2. Coleta e Processamento de células do endotélio vascular
- Uma enfermeira ou médico treinado realiza a coleta (passos 2,2-2,5, 2,7) e pesquisador coleta e processa os fios (passos 2.6, 2,8-2,19)
- Prepare o site antecubital com um anti-séptico tópico, aplicar um torniquete, localizar veia e canular com um 18 G cateter. Coloque um adaptador heplock no final da IV.
- Calçar luvas estéreis e colocar cortinas fenestrados estéreis sobre o site.
- Coloque 2 J-fios nas cortinas. Puxar o arco do "J" para desenrolar o "J" forma de dois fios.
- Destampar o heplock e alimentar J-fio na veia com aproximadamente 8 cm. Empurre para trás e para a frente várias vezes antes de retirar o fio. Evite sangue bruto no fio.
- Use o alicate para cortar os fios para que eles se encaixam em umTubo de 50 ml contendo ~ 30 mL de tampão de dissociação
- Repita o passo 2.5 para segundo fio.
- Repita o passo 2.6 para segundo fio. Retornar tubo para laboratório molhado.
- Apertar os fios com um par de pinças e segurar os fios no interior do tubo, mas por cima da solução. Por 10 minutos, use uma pipeta motorizada para coletar várias vezes o buffer de dissociação do tubo de 50 ml e liberá-lo para que ele corre para baixo do comprimento dos fios para enxaguar e vibrar os fios, em seguida, sacudi o excesso de fluido dos fios para dentro do tubo.
- Centrifugar durante 7 minutos a 400 xg e 4 ° C.
- Prepare a solução de formaldeído em papel alumínio coberto tubo através da combinação de 100 ml de solução de formaldeído + 900 ml de PBS.
- Lentamente remova o tubo de centrífuga, ligar a bomba de vácuo, coloque uma ponteira na extremidade do tubo de sucção e deixar ~ 400 ml no tubo, limpando fora o resto, sem perturbar o sedimento.
- Cubra com papel alumínio e pipeta solução de formaldeído 1 ml emo tubo para fixar a amostra. Não ressuspender. Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Prepare 8 lâminas por meio de rotulagem com o assunto e informações visita de estudo e elaboração de um oval em cada slide com uma caneta pap.
- Adicionar 15 ml de PBS, ressuspender, e centrifuga-se durante 5 min a 400 xg e 4 ° C.
- Repita o passo 2.15, adicione 12 ml de PBS, ressuspender, e centrifugar por 6 min a 400 xg e 4 ° C.
- Lentamente remova o tubo de centrífuga, ligar a bomba de vácuo, coloque uma ponteira na extremidade do tubo de sucção e deixar ~ 2 ml no tubo, limpando fora o resto, sem perturbar o sedimento.
- Ressuspender e pipeta uniformemente entre as 8 lâminas nas áreas ovais.
- Coloque em estufa a 37 ° C durante 5 horas e, em seguida, armazenar a -80 ° C até que esteja pronto para análise (amostras estará bem por muitos anos).
3. Avaliação da febre aftosa BA e aPWV
- Tenha investigação mudança assunto em calções descartáveis e têm him / sua supina mentira em um, não ofuscante, clima controlado sala silenciosa.
- Coloque o número apropriado de ECG para o ultra-som específico e dispositivo de rigidez arterial (este procedimento usa o não-invasiva hemodinâmica Workstation [NIHem] para medir a rigidez arterial, que requer 4 eletrodos) e manguito de pressão arterial no assunto.
- Após 20 min, começam as leituras de pressão sanguínea. Realizar pelo menos 3, e repetir até que as medições estão dentro de 5 mmHg, descansando 2 minutos entre cada leitura.
- Comece tonometria pela palpação do pulso da artéria braquial e colocar o tonômetro de gravar formas de onda braquial usando o programa de software.
- Repita o procedimento para as artérias radiais, femorais e carótidas.
- Meça a distância de cada um desses sites de entalhe supersternal usando uma fita métrica (braquial, radial e carótida) e governante custom / paquímetro (femoral).
- Calcule carótida-braquial, carótida-radial e carotídeo-femoral (aPWV), utilizando o programa de software.
- Lugarantebraço manguito de pressão sanguínea apenas distal ao olécrano e registro de pelo menos 10 ciclos cardíacos de imagens de ultrassom da artéria braquial de base e medições da velocidade do fluxo sanguíneo, com um software vascular definir o modo para disparar. Um braço mecânico pode ser utilizado para segurar a sonda de ultra-sons, se desejado.
- Inflar antebraço manguito de pressão arterial a 250 mmHg e começar timer. Instrua participante a permanecer muito quieto.
- Comece a velocidades de gravação com um conjunto de software vascular modo para acionar quando o cronômetro lê 4:45. Desencadear a liberação do manguito às 5:00 e mudar o ultra-som para gravar imagens em modo B (diâmetro) quando o relógio lê 05:10.
- Continuar a gravar até que o relógio lê 07:00.
- Grave pelo menos 10 ciclos cardíacos de imagens de ultrassom da artéria braquial de base com um software vascular definir o modo de desencadear.
- Tire a pressão arterial do sujeito. Se a pressão arterial sistólica> 100 mmHg, coloque 0,4 mg de nitroglicerina sublingual sob o assunto e# 39; s língua e começar timer, a menos que o paciente tem outra contraindicação.
- Começar a gravar B-mode (imagens de diâmetro), quando o relógio lê 03:00 com o software vascular definir o modo de desencadear.
- Parar a gravação quando o relógio lê 08:00.
- Monitor de pressão arterial até que ele retorne à linha de base
4. Preparando Human Umbilical Vein células endoteliais (HUVEC) Controle de Slides
- Crescer HUVECs a passagem 5-6 e ~ 80% de confluência.
- Tripsinizar com 3 ml de tripsina ou o que for necessário para o prato / balão.
- Neutraliza-se a tripsina utilizando um volume igual de solução de tripsina de neutralização.
- Centrifugar a 200 xg durante ~ 5 min e remover a tripsina e solução neutralizante por vácuo.
- Ressuspender em ~ 10 ml de PBS para lavagem.
- Centrifugar a 200 xg ~ 5 min. Remover PBS.
- Remover PBS e corrigir em 1800 mL PBS + 200 mL de formaldeído.
- Ressuspender em PBS (~ 10 ml).
- Centrifugar a 200 xg ~5 min. Remover PBS, ressuspender em um volume adequado para adicionar ~ 200 mL por slide.
- Armazenar slides em -80 ° C até que esteja pronto para análise (amostras estará bem por muitos anos).
5. Coloração das células endoteliais vasculares
- Tome lâminas de -80 ° C freezer e espere 5 minutos à temperatura ambiente (este procedimento é para um lote de 10 slides, incluindo um controle HUVEC slide).
- Limpe o excesso de água com uma tarefa delicada limpar (não toque centro de slide).
- Re-hidratar os slides adicionando alterado PBS a cada slide e deixá-los por 10 min.
- Enquanto os slides estão de pé, preparar 5% de soro de burro e outras soluções.
- Prepare 5% de soro de burro pela adição de 300 ml de soro burro para 5.700 l de alteração PBS (a um pH de 7,4) para até 10 lâminas (aumentar essa quantidade para mais).
- Dilui-se o anticorpo primário de interesse em 1000 ul de 5% de soro. Por exemplo, nitrotirosina e NADPHoxidase (1:300 e 1:1.500) poderiam ser utilizados como marcadores de estresse oxidativo.
- Prepare AF568 secundário diluindo 5 ul de AF568 a 1.500 μll de 5% de soro.
- Prepare caderina VE diluindo 2 ul de caderina VE de 1000 ul de 5% de soro.
- Prepare AF488 diluindo 5 ul de caderina VE de 1000 ul de 5% de soro.
- Mantenha AF568, VE caderina e AF488 em folha através de todo o processo e, em seguida, colocar no balancim em 4 ° C geladeira enquanto prepara slides.
- Após 10 min de reidratação, lâminas secas com uma tarefa delicada wipe.
- Adicionam-se 5% de soro de burro, durante 60 minutos e colocar uma peça de película de plástico de parafina sobre a zona circular para assegurar a cobertura completa do produto químico.
- Descarte o filme plástico e parafina lâminas secas com uma tarefa delicada wipe. Não lavar. Adicionar anticorpo primário durante 60 minutos e colocar uma peça de película de plástico de parafina sobre a zona circular para assegurara cobertura completa do produto químico.
- Descarte o filme parafina plástico, lavar com PBS alterado a partir de garrafa de esguicho e mergulhar em colunas de slides para 5 min. Enquanto as lâminas são de imersão, movê-los em uma sala escura. Trabalhar no escuro para todas as etapas restantes.
- Lâminas secas com Kimwipes, adicionar AF568 (anticorpo secundário), durante 45 minutos e colocar uma peça de película de plástico de parafina sobre a zona circular para assegurar a cobertura completa do produto químico. Cubra da luz.
- Descarte o filme parafina plástico no recipiente de resíduos de risco biológico. Lavar com PBS alterado a partir de garrafa de esguicho, e em seguida, mergulhe em colunas por 5 min.
- Lâminas secas com Kimwipes, em seguida, adicioná-caderina VE durante 60 minutos e colocar uma peça de película de plástico de parafina sobre a zona circular para assegurar a cobertura completa do produto químico. Cubra da luz.
- Descarte o filme parafina plástico no recipiente de resíduos de risco biológico. Lavar com PBS alterado a partir de garrafa de esguicho, e em seguida, mergulhe em colunas por 5 min.
- Lâminas secos comuma tarefa delicada limpar, adicionar AF488 durante 30 minutos e colocar uma peça de película de plástico de parafina sobre a zona circular para assegurar a cobertura completa do produto químico. Cubra da luz.
- Descarte o filme parafina plástico no recipiente de resíduos de risco biológico. Lavar com PBS alterado a partir de garrafa de esguicho, e em seguida, mergulhe em colunas por 5 min.
- Lâminas secos com uma tarefa delicada limpar e deixar as lâminas para secar por 20 min. Cubra da luz.
- Adicione uma gota só de fluoroshield meio de montagem com 4 ', cloridrato de 6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) para cada slide e cubra cada um com uma lamela.
- Colocar as lâminas em 4 ° C geladeira coberto com papel alumínio. Imagem deve ser concluído no prazo de 48 horas.
6. Imaging and Analysis of Vascular células endoteliais
- Prepare microscópio para a imagem células endoteliais coradas de acordo com especificações do microscópio específico. Um único técnico cego deve analisar qualquer proteína particular para um morcegoch de células.
- Digitalizar slides de forma sistemática. Identificar as células endoteliais por coloração positiva para o VE caderina e confirmar a integridade nuclear por coloração positiva para DAPI.
- Imagem 30 células por lâmina para análise posterior. Repita o procedimento para cada slide no lote manchado, incluindo a HUVEC.
- Analisar a intensidade da coloração do anticorpo primário de interesse usando um software de qualidade.
- Para minimizar o possível efeito de confusão de diferenças de intensidade de coloração entre diferentes sessões de coloração, os valores do relatório como razão da expressão da proteína nas células endoteliais recolhidos para o mesmo a expressão da proteína em HUVEC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FMD BA é quantificada como a variação de pico no diâmetro da artéria braquial seguinte hiperemia reactiva. Assim, o diâmetro em repouso é comparado com o diâmetro após o final de um período de 5 min manga de pressão arterial de oclusão (Figura 1). O painel A mostra uma imagem representativa de ultra-som da artéria braquial e Painel B mostra um gráfico da onda R mudança fechado em diâmetro de liberação do manguito de 2 min seguinte, obtida através de software disponível comercialmente. Como a mudança muitas vezes é bastante mínima (Na figura 1 a variação é de 4,8%), pequenas diferenças na medição podem ter grandes impactos nos resultados. Uso de software disponível no mercado de detecção de bordas automática é altamente recomendado para minimizar o viés e erro potencial na medida 44,45. À medida que o estímulo para a dilatação durante hiperemia reativa pode diferir entre grupos ou condições sendo comparados, taxa de cisalhamento devem ser calculados com base no fluxo de sangue Dopplervelocidades e FMD BA deve ser ajustada para diferenças quando aplicáveis 46,47.
aPWV é calculado com entrada mínima do operador pela maioria dos sistemas disponíveis no mercado, incluindo o NIHem utilizado em nossa pesquisa. A onda R do ECG é comparado ao "pé" da forma de onda num determinado local e a diferença de tempo é calculado (Figura 2) para a artéria carótida (painel A) e da artéria femoral (Painel B). As medições de distância são usados em conjunção com as diferenças de tempo para calcular uma velocidade. aPWV refere-se a velocidade de escoamento entre a artéria carótida para a artéria femoral (isto é. ao longo da aorta).
A análise de imunofluorescência das células endoteliais vasculares podem fornecer evidência celular do nível do stress oxidativo. Para ter em conta as diferenças na intensidade de coloração entre sessões de coloração, o nível de fluorescência de uma dada proteína para cada sujeito individual (IMA representante ges mostrados na Figura 3 Painel A) é comparada com a fluorescência da lâmina de controlo de HUVEC (imagens representativas mostrado na Figura 3 Painel B). Assim, as diferenças na expressão da proteína pode ser comparada entre os grupos ou em condições (por exemplo, durante um estudo de intervenção).
Figura 1. Representante diâmetro da artéria braquial basal obtidas durante a avaliação da artéria braquial mediada pelo fluxo dilatação (FMD BA). A) Em um paciente com doença renal crônica (DRC). B) onda R mudança fechado em diâmetro de liberação do manguito de 2 min a seguir é representado graficamente, obtidas através de software disponível comercialmente.target = "_blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Resultados representativos cópia impressa a partir da avaliação de aPWV em um paciente com DRC. D) Tempo de atraso a partir da onda R do ECG para o pé da artéria carótida, B) a partir do tempo de atraso da onda R do ECG para o pé da artéria femoral (tfoot), sobreposto com a forma de onda da carótida. Ambos os painéis mostram também as distâncias inseridos de fúrcula aos respectivos locais (representados pela letra D, em cm). O valor calculado aPWV é mostrado no painel B (representadas pelas letras PWV, em cm / s). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. </ P>
Figura 3. Imagens representativas da expressão da proteína. A) DAPI (integridade nuclear; azul), VE caderina (identificação de células endoteliais positivo; verde) a enzima oxidante NADPH oxidase (proteína de interesse, vermelho) a partir de células coletadas de um paciente com doença renal crônica B) e de uma célula endotelial da veia umbilical humana (HUVEC) lâmina de controlo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Obtenção de resultados precisos para a febre aftosa BA e aPWV requer a aquisição de imagens de ultra-som de alta qualidade e formas de onda de pressão, respectivamente. Central para isso é formação adequada e contínua ea utilização de cada técnica pelo operador 44. Além disso, é fundamental para controlar o maior número de variáveis externas que possam influenciar os resultados como possível padronizar a sessão de testes (por exemplo, antes de 12 horas rápido, clima controlado quarto, etc) 44,45. Como mencionado acima, o uso de R-ondas comercialmente fechado e software de aquisição de software de detecção de borda é altamente recomendada para minimizar o viés e possível erro na medição de 44,45. Quando a febre aftosa BA é prejudicada, isso poderia ser prejudicada devido a liberação do endotélio ou devido a deficiência de resposta dos músculos lisos vasculares para o NO liberado. Nitroglicerina sublingual é administrada para controlar a capacidade de resposta do bomcamada de células de músculo de um doador de óxido nítrico exógeno, a fim de concluir que qualquer diminuição na DMF BA é específico para a capacidade do endotélio vascular para produzir óxido nítrico 44,45.
Como a medição é uma velocidade, medidas precisas de distância e tempo são críticos. O protocolo já descrito baseia-se na metodologia utilizada no estudo de Framingham Heart 24. O uso de pinças levantadas, em vez de uma fita métrica melhora a precisão da medição de distância da fúrcula à artéria femoral, tomando um caminho direto ao invés de medição potencial sobre a obesidade abdominal. A "pé" clara de uma forma de onda limpa é absolutamente necessário para o cálculo da diferença de tempo entre a onda R do ECG para o impulso no local de medição (veja a Figura 2).
Embora as técnicas alternativas estão disponíveis para avaliar tanto a função endotelial e arterial rigidez, febre aftosa BA e aPWV são ambos comumente utilizados em pesquisa clínica, porque eles são não-invasivo e bem estabelecida como resultados intermediários. Além disso, eles são bem validado em várias populações e são independentemente de previsão de eventos cardiovasculares e mortalidade 19-26. Assim, eles podem ser usados como parâmetros de substituição em estudos clínicos para avaliar a eficácia de uma intervenção para reduzir o risco cardiovascular em uma dada população, tais como pacientes com DRC. A alteração destas técnicas não são necessárias para estudar especificamente pacientes com DRC, em comparação com outras populações de risco de DCV.
No entanto, existem limitações importantes tanto para a febre aftosa BA e aPWV que merecem discussão. FMD BA avalia a função endotelial vascular de uma grande artéria conduta (artéria braquial), que, portanto, não fornecem um índice de função microvascular endotelial. Uma técnica separado usando venoso plethysm oclusãografia é mais adequado para avaliar o último. No entanto, esta metodologia requer cateterização da artéria braquial, que é mais invasivo do que a febre aftosa BA e pode ser contra-indicado em pacientes com DRC. Além disso, a medição de febre aftosa BA requer treinamento longo e específico, a fim de ser bem executada. aPWV fornece um índice de rigidez arterial elástica grande, que pode ser diferente da rigidez arterial local (tal como a artéria carótida). Uma técnica alternativa para avaliar a rigidez arterial é medir a complacência arterial local (o inverso da rigidez) da artéria carótida, embora isso não seja tão amplamente utilizado ou validado com desfechos clínicos como aPWV 13. Além disso, a contribuição do NO como determinante da rigidez aórtica podem variar por leito vascular 48. Por último, existem potenciais confunde com a interpretação de ambos FMD BA e aPWV que precisam ser medidos e estatisticamente ajustados para quando apropriado, incluindo linha de base diameter e taxa de cisalhamento para a febre aftosa BA 45, e da freqüência cardíaca e da pressão arterial para aPWV 49.
Uma consideração importante para a recolha de células endoteliais vasculares é minimizar sangue em j-fios e, posteriormente, sobre as lâminas, de tal modo que as células endoteliais podem ser identificadas com as células vermelhas do sangue mínimos sobrepostos em imagens. Isto pode ser conseguido com a formação de técnica adequada, bem como a lavagem adequada ao recuperar as células. Ao analisar os slides, é fundamental que a fluorescência pode ser objetivamente quantificada e as imagens são claras, sem muito fundo ou sobreposição com outras células. Optimização de diluições para a coloração e a técnica de análise de microscopia antes da análise de amostras de estudo são passos chave. De notar que o rendimento das células dessa técnica é de aproximadamente 600 células endoteliais vasculares por coleção, uma quantidade insuficiente de mRNA total é disponível para medir a expressão do gene, o que limita a nossa sonda para immunoflcoloração uorescent de proteínas de interesse.
Além das técnicas apresentadas para avaliar o stress oxidativo vascular, circulando ou marcadores de urina pode ser utilizada para avaliar o stress oxidativo 12,50. No entanto, eles podem ser menos reflectora do nível do stress oxidativo específica a nível do endotélio vascular. Utilizando estes marcadores, em conjunto com as técnicas apresentadas pode proporcionar a melhor indicação do nível global de estresse oxidativo.
Nós fornecemos uma visão geral dos métodos que podem ser usados para medir a febre aftosa BA, aPWV e expressão da proteína de célula endotelial vascular. Estas técnicas são adequados não só para os doentes com DRC, mas também em outras populações em maior risco de doença cardiovascular. Coletivamente, eles fornecem uma visão sobre a disfunção endotelial vascular, rigidez artéria elástica grande, e contribuindo mecanismos fisiológicos, incluindo o estresse oxidativo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Nina Bispham por sua assistência técnica. Este trabalho foi financiado pela American Heart Association (12POST11920023), eo NIH (K23DK088833, K23DK087859).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| J-wire | St. Jude | 404584 | 2 per collection |
| Disposable shorts (MediShorts) | Quick Medical | 4507 | |
| Non-invasive hemodynamic workstation (NIHem) | Cardiovascualr Engineering | N/A | Includes custom ruler. An alternate system is the Sphygmocor |
| Ultrasound | G.E. | Model: Vivid7 Dimension | We use a G.E., but there are many companies and models |
| Vascular software (Vascular Imager) | Medical Imaging Applications | N/A | |
| R-wave trigger box | Medical Imaging Applications | N/A | custom made |
| Rapid Cuff Inflation System | Hokanson | Model: Hokanson E20 | |
| Forearm blood pressure cuff | Hokanson | N/A | custom cuff with 6.5 x 34 cm bladder |
| HUVECs | Invitrogren | C-015-5C | |
| Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
| Pap pen | Research Products International | 195505 | |
| VE Cadherin | Abcam | ab33168 | |
| AF568 | Life Technologies | A11011 | depends on specifications of microscpe |
| AF488 | Life Technologies | A11034 | depends on specifications of microscpe |
| Nitrotyrosine antibody | Abcam | ab7048 | |
| NADPH oxidase antibody | Upstate | 07-001 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| Delicate task wipe (Kimwipe) | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Plastic paraffin film (parafilm) | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Confocal microscope | Olympus | Model: FV1000 FCS/RICS | many options exist |
References
- Levey, A. S., et al. A new equation to estimate glomerular filtration rate. Ann Intern Med. 150, 604-612 (2009).
- Foley, R. N., Parfrey, P. S., Sarnak, M. J. Epidemiology of cardiovascular disease in chronic renal disease. J Am Soc Nephrol. 9, (1998).
- Parfrey, P. S., Harnett, J. D. Cardiac disease in chronic uremia. Pathophysiology and clinical epidemiology. Asaio J. 40, 121-129 (1994).
- Schiffrin, E. L., Lipman, M. L., Mann, J. F. Chronic kidney disease: effects on the cardiovascular system. Circulation. 116, 85-97 (2007).
- Sarnak, M. J., et al. Cardiovascular disease risk factors in chronic renal insufficiency. Clin Nephrol. 57, 327-335 (2002).
- Kendrick, J., Chonchol, M. B. Nontraditional risk factors for cardiovascular disease in patients with chronic kidney disease. Nat Clin Pract Nephrol. 4, 672-681 (2008).
- Bellasi, A., Ferramosca, E., Ratti, C. Arterial stiffness in chronic kidney disease: the usefulness of a marker of vascular damage. Int J Nephrol. 2011, (2011).
- vander Zee, S., Baber, U., Elmariah, S., Winston, J., Fuster, V. Cardiovascular risk factors in patients with chronic kidney disease. Nat Rev Cardiol. 6, 580-589 (2009).
- Malyszko, J. Mechanism of endothelial dysfunction in chronic kidney disease. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 411, 1412-1420 (2010).
- Lakatta, E. G., Levy, D. Arterial and cardiac aging: major shareholders in cardiovascular disease enterprises: Part I: aging arteries: a "set up" for vascular disease. Circulation. 107, 139-146 (2003).
- Seals, D. R., Jablonski, K. L., Donato, A. J. Aging and vascular endothelial function in humans. Clin Sci (Lond). 120, 357-375 (2011).
- Jablonski, K. L., et al. Dietary sodium restriction reverses vascular endothelial dysfunction in middle-aged/older adults with moderately elevated systolic blood pressure. J Am Coll Cardiol. 61, 335-343 (2013).
- Briet, M., et al. Arterial stiffness and enlargement in mild-to-moderate chronic kidney disease. Kidney Int. 69, 350-357 (2006).
- Thambyrajah, J., et al. Abnormalities of endothelial function in patients with predialysis renal failure. Heart. 83, 205-209 (2000).
- Ghiadoni, L., et al. Effect of acute blood pressure reduction on endothelial function in the brachial artery of patients with essential hypertension. J Hypertens. 19, 547-551 (2001).
- Yilmaz, M. I., et al. The determinants of endothelial dysfunction in CKD: oxidative stress and asymmetric dimethylarginine. Am J Kidney Dis. 47, 42-50 (2006).
- Wang, M. C., Tsai, W. C., Chen, J. Y., Huang, J. J. Stepwise increase in arterial stiffness corresponding with the stages of chronic kidney disease. Am J Kidney Dis. 45, 494-501 (2005).
- Shinohara, K., et al. Arterial stiffness in predialysis patients with uremia. Kidney Int. 65, 936-943 (2004).
- Karras, A., et al. Large artery stiffening and remodeling are independently associated with all-cause mortality and cardiovascular events in chronic kidney disease. Hypertension. 60, 1451-1457 (2012).
- Pannier, B., Guerin, A. P., Marchais, S. J., Safar, M. E., London, G. M. Stiffness of capacitive and conduit arteries: prognostic significance for end-stage renal disease patients. Hypertension. 45, 592-596 (2005).
- Yilmaz, M. I., et al. Vascular health, systemic inflammation and progressive reduction in kidney function; clinical determinants and impact on cardiovascular outcomes. Neprhol Dial Transplant. 26, 3537-3543 (2011).
- Sutton-Tyrrell, K., et al. Elevated aortic pulse wave velocity, a marker of arterial stiffness, predicts cardiovascular events in well-functioning older adults. Circulation. 111, 3384-3390 (2005).
- Tanaka, H., DeSouza, C. A., Seals, D. R. Absence of age-related increase in central arterial stiffness in physically active women. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 18, 127-132 (1998).
- Mitchell, G. F., et al. Arterial stiffness and cardiovascular events: the Framingham Heart Study. Circulation. 121, 505-511 (2010).
- Yeboah, J., Crouse, J. R., Hsu, F. C., Burke, G. L., Herrington, D. M. Brachial flow-mediated dilation predicts incident cardiovascular events in older adults: the Cardiovascular Health Study. Circulation. 115, 2390-2397 (2007).
- Shechter, M., et al. Long-term association of brachial artery flow-mediated vasodilation and cardiovascular events in middle-aged subjects with no apparent heart disease. Int J Cardiol. 134, 52-58 (2009).
- Baylis, C. Nitric oxide deficiency in chronic kidney disease. Am J Physiol Renal Physiol. 294, (2008).
- Wever, R., et al. Nitric oxide production is reduced in patients with chronic renal failure. Arterioscler Thromb Vasc. 19, 1168-1172 (1999).
- Endemann, D. H., Schiffrin, E. L.
- Hasdan, G., et al. Endothelial dysfunction and hypertension in 5/6 nephrectomized rats are mediated by vascular superoxide. Kidney Int. 61, 586-590 (2002).
- Chue, C. D., Townend, J. N., Steeds, R. P., Ferro, C. J. Arterial stiffness in chronic kidney disease: causes and consequences. Heart. 96, 817-823 (2010).
- Dupont, J. J., Farquhar, W. B., Townsend, R. R., Edwards, D. G. Ascorbic acid or L-arginine improves cutaneous microvascular function in chronic kidney disease. J Appl Physiol. 111, (2011).
- Oberg, B. P., et al. Increased prevalence of oxidant stress and inflammation in patients with moderate to severe chronic kidney disease. Kidney Int. 65, 1009-1016 (2004).
- Cachofeiro, V., et al. Oxidative stress and inflammation, a link between chronic kidney disease and cardiovascular disease. Kidney Int Suppl. (111), (2008).
- Vila, E., Salaices, M. Cytokines and vascular reactivity in resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288, (2005).
- Perticone, F., et al. Endothelial dysfunction and subsequent decline in glomerular filtration rate in hypertensive patients. Circulation. 122, 379-384 (2010).
- Zatz, R., Baylis, C. Chronic nitric oxide inhibition model six years on. Hypertension. 32, 958-964 (1998).
- Nakagawa, T., Johnson, R. J.
- Muller, V., Tain, Y. L., Croker, B., Baylis, C. Chronic nitric oxide deficiency and progression of kidney disease after renal mass reduction in the C57Bl6 mouse. Am J Nephrol. 32, 575-580 (2010).
- Colombo, P. C., et al. Biopsy coupled to quantitative immunofluorescence: a new method to study the human vascular endothelium. J Appl Physiol. 92, 1331-1338 (2002).
- Donato, A. J., Black, A. D., Jablonski, K. L., Gano, L. B., Seals, D. R. Aging is associated with greater nuclear NFkappaB, reduced IkappaBalpha, and increased expression of proinflammatory cytokines in vascular endothelial cells of healthy humans. Aging Cell. 7, 805-812 (2008).
- Donato, A. J., et al. Direct evidence of endothelial oxidative stress with aging in humans: relation to impaired endothelium-dependent dilation and upregulation of nuclear factor-kappaB. Circ Res. 100, 1659-1666 (2007).
- Jablonski, K. L., Chonchol, M., Pierce, G. L., Walker, A. E., Seals, D. R. 25-Hydroxyvitamin D deficiency is associated with inflammation-linked vascular endothelial dysfunction in middle-aged and older adults. Hypertension. 57, 63-69 (2011).
- Corretti, M. C., et al. Guidelines for the ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery: a report of the International Brachial Artery Reactivity Task Force. J Am Coll Cardiol. 39, 257-265 (2002).
- Harris, R. A., Nishiyama, S. K., Wray, D. W., Richardson, R. S.
- Donald, A. E., et al. Methodological approaches to optimize reproducibility and power in clinical studies of flow-mediated dilation. J Am Coll Cardiol. 51, 1959-1964 (2008).
- Widlansky, M. E. Shear stress and flow-mediated dilation: all shear responses are not created equally. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 296, (2009).
- Stewart, A. D., Millasseau, S. C., Kearney, M. T., Ritter, J. M., Chowienczyk, P. J. Effects of inhibition of basal nitric oxide synthesis on carotid-femoral pulse wave velocity and augmentation index in humans. Hypertension. 42, 915-918 (2003).
- Lantelme, P., Mestre, C., Lievre, M., Gressard, A., Milon, H. Heart rate: an important confounder of pulse wave velocity assessment. Hypertension. 39, 1083-1087 (2002).
- Jablonski, K. L., Seals, D. R., Eskurza, I., Monahan, K. D., Donato, A. J. High-dose ascorbic acid infusion abolishes chronic vasoconstriction and restores resting leg blood flow in healthy older men. J Appl Physiol. 103, 1715-1721 (2007).
