Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Zusammenfassung

Nach Durchtrennung des Rücken, erwachsenen Zebrafisch haben die funktionelle Erholung von 6 Wochen nach der Verletzung. Um die Vorteile der Larven Transparenz und schnellere Erholung zu nehmen, stellen wir ein Verfahren zur Durchtrennung des Rückenmarks Larven. Nach Durchtrennung beobachten wir sensorischen Erholung ab 2 Tage nach der Verletzung, und C-Bogen-Bewegung um 3 Tage nach der Verletzung.

Zusammenfassung

Säugetiere nicht in sensorischen und motorischen Erholung nach einer Rückenmarksverletzung aufgrund des Fehlens von axonalen Nachwachsen unter dem Niveau von Verletzungen sowie die Unfähigkeit, Rückenneurogenese wieder aufzunehmen. Doch einige anamniotes einschließlich der Zebrafisch Danio rerio Ausstellung auch nach der kompletten Durchtrennung des Rückenmarks sowohl sensorische und funktionelle Wiederherstellung. Die erwachsenen Zebrafisch ist ein Modellorganismus für das Studium Regeneration nach Rückenmarksverletzungen, mit sensorischen und motorischen Erholung von 6 Wochen nach der Verletzung. Um die Vorteile der in vivo Analyse der Regenerationsprozess in der transparenten Larven Zebrafisch als auch genetische Werkzeuge nicht in der Erwachsenen zugänglich zu machen, verwenden wir die Zebrafisch-Larven, um die Regeneration nach Rückenmarksdurchtrennung zu studieren. Hier zeigen wir ein Verfahren zur reproduzierbar und nachweisbar Trennung des Larvenrückenmark. Nach Durchtrennung, zeigt unsere Daten sensorischen Erholung Anfang mit 2 Tagen nach der Verletzung (dpi), Witzh ist der C-Bogen-Bewegung um 3 dpi und die Wiederaufnahme des freien Schwimmen von 5 dpi nachweisbar. So schlagen wir die Zebrafisch-Larven als Begleiter Werkzeug an die erwachsenen Zebrafisch für das Studium der Regeneration nach Rückenmarksverletzungen.

Einleitung

Schweres Trauma an den menschlichen Rückenmarks oft zu bleibenden Lähmungen und Gefühlsverlust unterhalb der Ebene der Schädigung aufgrund der Unfähigkeit, die Axone wieder wachsen oder reinitiate Genese ^1,2. Im Gegensatz zu Säugetieren, aber anamniotes einschließlich Salamander und Zebrafisch (Danio rerio) zeigen kräftige Erholung auch nach der kompletten Rückenmarksdurchtrennung ^3,4.

Die erwachsenen Zebrafisch ist ein gut etabliertes Modell für die Untersuchung der Wiederherstellungsprozess folgende Verletzungen des Rückenmarks ^5-7. Nach der vollständigen Durchtrennung des Rückenmarks, ist Wiederherstellung der sensorischen und Lok-Funktion im erwachsenen Zebrafisch von 6 Wochen nach der Verletzung ⁸ beobachtet. Um den Regenerationsprozess in vivo zu untersuchen, wandten wir uns an der transparenten Larven ^{Zebrafisch-9.}

Hier präsentieren wir eine Methode, um das Rückenmark zu durchtrennen eines 5 Tage nach der Befruchtung (DPF) Larvenzebrafisch using eine abgeschrägte Mikroinjektionspipette wie ein Skalpell, von Bhatt geändert, et al. ^10. Diese Methode unterstützt hohen Durchsatz, geringe Mortalität und Reproduzierbarkeit. Mit etwas Übung können 300 Larven / h durchtrennt werden, und über 6 Monate von Querschnitten erhalten, darunter mehr als 3.600 Tiere, 98,75% ± 0,72% überlebten bis 7 Tage nach der Verletzung (dpi). Unsere Daten zeigen eine schnelle Wiederherstellung der sensorischen und Fortbewegung als auch: bei 1 dpi, wird jede Bewegung, die der Geschädigte Fisch nur Brustflosse Fortbewegung angetrieben. Allerdings Larven beginnen zu reagieren, um die Nadel zu berühren Schwanztrennung Wolfram von 2 dpi, wiederherzustellen C-Bogen-Bewegung um 3 dpi und zeigen räuberische Schwimm von 5 ¹¹ dpi. Mit Antikörperfärbung gegen acetyliertes Tubulin haben wir bestätigt, dass Axone fehlen in der Verletzungsstelle bei 1 dpi, haben aber die Verletzungsstelle um 5 dpi gekreuzt. Wir glauben, dass dieses Protokoll eine wertvolle Technik für die Untersuchung von axonalen Nachwachsen und Neurogenese im Rückenmark nach einer Verletzung bereitzustellen.

Protokoll

Zebrafisch wurden angehoben und nach Standardverfahren gezüchtet; Experimente wurden von der Universität von Utah Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

1. Vorbereitung für Chirurgie Platten

1. Machen Chirurgie Platten mit 60 mm Petrischalen und Sylgard 184 Silikonelastomer Kit nach Herstellerangaben. Füllen Gerichte nicht mehr als halb voll und lassen Sie polymerisieren. Shop abgedeckt bei Raumtemperatur.

2. Herstellung von Mikropipetten

1. Fertigen Mikropipetten durch Erhitzen und Ziehen Dünnwand Borosilikat Kapillarrohr in einer Mikropipette Puller mit den gleichen Einstellungen für die Herstellung von Mikroinjektionsnadeln.
2. Unter einem Dissektionsmikroskop, snap off Spitze des Mikropipette auf ca. 200 um im Durchmesser mit einer Pinzette.
3. Kegel gebrochene Kante mit einem microgrinder zunächst auf 35 °, gefolgt von einer zweiten Abschrägung bei 25 °. Stellen Sie sicher, Spitze ist scharf und smooth. Laden beendet abgeschrägten Mikro in einer Petrischale auf einer kleinen Menge von Ton.

3. Vorbereitung der Zebrafisch-Larven

1. 7 Tage vor der Operation, bis Gegen Tanks von männlichen und weiblichen Zebrafisch gesetzt.
2. Sammeln Embryonen am folgenden Morgen, 3 h nach die Lichter angehen, um maximalen Ertrag zu gewährleisten. Bei Verwendung eines transgenen Reporter Linie wie Tg (elevl3: eGFP) ^knu3, sortieren befruchteten Embryonen 100/100 mm-Platte in 25 ml E3 bei 28,5 ° C. Bei der Verwendung von Wildtyp, Art befruchteten Embryonen 25/100 mm-Platte in 25 ml E3 bei 28,5 ° C.
3. Wenn Sie einen Reporter Linie, Bildschirm Embryonen für Leuchtstofflampen Ausdruck bei 48 hpf. Ermöglichen identifiziert Embryonen bei einer Dichte von 25/100 mm Platte in 25 ml E3 bei 28,5 ° C reifen
4. Als Larven sind 5 dpf, bereiten Chirurgie Platte durch Abdecken mit Sylgard E2 + 10 mg / L Gentamycin Sulfat (GS) + Tricaine.
   1. Bereiten Erholung Gericht durch Zugabe von 25 ml E2 + GS in einen 100-mm-Petri dish.
   2. Bereiten Skalpell durch Abkleben zusammen drei Tupfer. Dadurch wird eine dreieckige Werkzeug mit drei Nuten zu bilden.
   3. Montieren Sie eine Mikropipette vorbereitet auf den Tupfer durch Abkleben es in eine der Rillen.
5. Bei Wiederverwendung Mikropipetten, spülen, bis klar mit E2 + GS mit einer 1 ml-Spritze und einer 27 G-Nadel vor der Montage auf Tupfer.

4. Chirurgie

1. Anesthetize 1 Platte von Larven in einer Zeit (25 Fische) mit Tricaine. Die Fische werden ausreichend betäubt, wenn sie Touch-Reaktion nicht mehr ausstellen. Es ist wichtig, dass die Fische vor der Operation vollständig betäubt, sonst werden sie zucken, wenn sie das Skalpell berührt. Die Operation wird unter einem Mikroskop Dissektion durchgeführt.
2. Übertragen Larven der Operation Platte.
   1. Bei maximaler Vergrößerung, drehen eine Larve in einer Zeit, so dass es auf seiner Seite liegt mit dem Rücken am nächsten an der Hand, die das Skalpell.
   2. Zange Position, so dass sie auf der Sylgard ruhen,abgewinkelt über die Breite der Larve.
   3. Verspannen des Glas Skalpell gegen einen der Arme der Zange, schneiden in den dorsalen Seitenfläche der Larve auf der Ebene der analen Poren, wird Sie sicher nicht über die ventralen Rand der Chorda geschnitten. Drehen Sie das Skalpell, um das Rückenmark zu durchtrennen.
   4. Wiederholen Sie mit den restlichen Larven.
      Hinweis: Wenn eine Larve blutet, wird es nicht von der Operation zu erholen. Die Larve sofort entfernen von der Operation Platte und einschläfern es über Tricaine Überdosis.
3. Nach der Operation an der Charge von Larven abgeschlossen ist, die Übertragung der Erholung Platte verletzte Tiere. Dies ist auf die Lichtung der Anästhesie unterstützen.
   1. Achtung: Bei der Erfassung verletzt Larven für den Transfer, sicherzustellen, dass sie Kopf oder Schwanz zunächst gesammelt: die Schadens Website nicht betonen, durch Biegen der Larven.
      Anmerkung: Alle für die Operation verwendeten Vorrichtungen wiederverwendet werden können, einschließlich der Mikropipetten.

5. Rettung

1. Transfer verletzt Larven von der Erholung Platte auf 100-mm-Platten mit 25 ml E2 + GS bei einer Dichte von 25/plate gefüllt. Lassen Sie in einem 28,5 ° C Inkubator erholen.
2. Überprüfen Sie täglich Platten, Entfernen kranker und toter Tiere. Sie verändern die Medien erst Coleps (Süßwasser Protozoen) in den Medien zu sehen sind. Beim Wechsel der Medien, nicht die Fische auf eine neue Platte übertragen; statt, entfernen Sie so viel wie möglich und Medien überfluten die gleiche Platte mit neuen Medien. Bei Bedarf wiederholen, um Coleps Bevölkerung zu reduzieren.
3. Feed-täglich mit einer kleinen Menge von pulverförmigen Lebensmitteln braten.
   Hinweis: Lebendfutter (zB Pantoffeltierchen oder Rädertierchen) nicht zu verletzten, bis Larven, nachdem sie die Fortbewegung wiederzugeführt werden. Andernfalls wird das Lebendfutter die Verletzungsstelle besiedeln und töten die Larven.

Ergebnisse

Um die Schwere der Gewebeschädigung die Verletzungsstelle umgebenden reduzieren, ist die richtige Abschrägung der Mikropipette kritisch. 1A zeigt eine korrekt abgeschrägte Spitze. Mit einem Tipp, der zu breit ist (Abbildung 1B) neigt dazu, in höheren Todesopfer führen durch die erhöhte Wahrscheinlichkeit von nicking die dorsale Aorta, während ein Tipp, der zu schmal ist (Abbildung 1C) neigt dazu, Blick von der Haut statt Schneiden von Gewebe.

Diskussion

Wenn zunächst das Erlernen dieser Technik, empfehlen wir versuchen nicht mehr als 50-100 Querschnitten erhalten in einer einzigen Sitzung. Nach Beherrschung dieser Technik sind wir in der Lage, bis 300 Embryonen pro Stunde durchschneiden sich; aber dieses Niveau der Durchsatz erfordert ein paar Monaten der wöchentlichen Praxis. Wir empfehlen auch, gemeinsam mit einem Reporter-Linie und Überprüfung komplette Durchtrennung bis das Auftreten von unvollständiger Durchtrennung des Rückenmarks auf weniger als 1% reduziert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
60 mm Petrischale	VWR	82050-544
100 mm Petrischale	VWR	89038-968
PDMS, Sylgard 184 Silikonelastomer Kit	Fisher Scientific	NC9644388
Borosilikat-Kapillarschlauch: AD 1,00 mm, ID 0,78 mm	Warner Instruments Inc.	64-0778
Pinzette	Fine Scientific Tools Inc.	11252-30
Disssektionsmikroskop	Nikon	SMZ6454
Microgrinder	Narishige	EG-44
Gentamycin Sulfate	Amresco Inc.	0304-5G	in Wasser 10 mg/ml auflösen, bei -20 μg lagern; C
Tricaine	Acros Organics	118000100
Applikator mit Wattespitze, Holz, 6-Zoll	Fisher Scientific	23-400-101
1 ml Spritze	BD	309625
27 G Nadel	BD	305109
Fry Food	Argent Labs	F-ARGE-PTL-CN	bei -20 ° C
Mikropipetten-Abzieher	Sutter Instrument Co.	Modell P-97	Box Filament FB330B<
lagern 17,5 g NaCl	Fisher	Scientific S671-500
0,75 g KCl	Fisher Scientific	P217-500
2,90 g CaCl2· 2H2O	Sigma	C7902-500G
4,90 g MgSO4· 7H2O	Merck	MX0070-1
0,41 g KH2PO4	Fisher	Scientific P285-500
0,12 g Na2HPO4	Sigma	S0876-500G
500x NaCO3 (10 ml); frisch machen, zusätzlich
0,35 g NaCO3	Sigma	S5761<
50 ml 20x E2
lagern, 2 ml frisch, 500x NaCO3