Mikrogliazellen sind die residenten Immunzellen des zentralen Nervensystems (ZNS) mit hoher Kapazität, in ihren extrazellulären Umgebung phagozytieren oder verschlingen Material. Hier ist eine breit anwendbare, zuverlässige und hoch quantitativen Assay für die Visualisierung und Messung Mikroglia-vermittelte Phagozytose von synaptischen Komponenten beschrieben.
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Methodenartikel
Ein Engulfment Assay: Ein Protokoll, um Interaktionen zwischen Fresszellen und Neuronen CNS bewerten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Phagozytose ist ein Prozess, in dem eine Zelle verschlingt Material (gesamte Zelle, Zellteile, Schutt, etc.) in der extrazellulären Umgebung umgibt und dieses Material anschließend verdaut, allgemein durch lysosomalen Abbau. Mikrogliazellen sind die residenten Immunzellen des zentralen Nervensystems (ZNS), deren phagozytierenden Funktion in einem breiten Bereich von Bedingungen, die an neurodegenerativen Erkrankungen (z. B. beta-Amyloid-Clearance bei Alzheimer-Krankheit), um die Entwicklung von gesunden Gehirn (zB synaptischen beschrieben Beschneiden) 1-6. Das folgende Protokoll ist ein Einwirkung Assay entwickelt, zu visualisieren und zu quantifizieren Mikroglia-vermittelten Phagozytose von präsynaptischen Eingänge in den Entwicklungs Maus retinogeniculate System 7. Während dieser Assay wurde verwendet, um Mikroglia-Funktion in diesem Zusammenhang zu bewerten, kann ein ähnlicher Ansatz verwendet werden, um andere Phagozyten im Gehirn (beispielsweise Astrozyten) und dem Rest des Körpers zu beurteilen(Z. B. peripheren Makrophagen) sowie andere Kontexte, in denen die synaptische Umbau auftritt (z. B. Hirnverletzung / Krankheit).
Einleitung
Synaptischen Schaltungen umzu während der gesamten Lebensdauer des Tieres. In der sich entwickelnden Gehirn, Synapsen im Überschuss und muss synaptischen Beschneidung, die die selektive Entfernung einer Teilmenge von Synapsen und die Erhaltung und Stärkung dieser Synapsen, die 8-10 bleiben beinhaltet zu unterziehen. Dieser Vorgang ist notwendig, um die genaue Verbindungscharakteristik des adulten Nervensystems zu erreichen. Beim Erwachsenen kann Synapsen auch Kunststoff sein, insbesondere im Zusammenhang mit Lernen und Gedächtnis. Die strukturellen Korrelate dieser Plastizität sind gedacht, um das Hinzufügen und / oder Beseitigung von dendritischen D....
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Protokoll
1. Anterograde Markierung von RGC Präsynaptische Eingänge
Hinweis: Alle Experimente, die die Verwendung von Tieren wurden in Übereinstimmung mit allen NIH-Richtlinien überprüft und durch die institutionelle Pflege der Tiere und die Verwendung Ausschuss (IACUC) überwacht.
- Sterilisieren Feld und Instrumente.
- Anesthetize Maus mit 4 Vol% Isofluran in einem Plexiglas-Induktionskammer (dies Vol% Isofluran arbeitet für Neugeborenen-erwachsenen Mäusen). Beachten Mäuse eng mit Über betäubende vermeiden. VORSICHT: Vermeiden Inhalation mit einer Vakuum Abgas Evakuierung.
- Nach 1-3 min, (älteren Mäusen weniger Zeit benöt....
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Ergebnisse
Kürzlich haben wir diesen Test Einwirkung zu visualisieren und zu quantifizieren Mikroglia-vermittelten Phagozytose von präsynaptischen Eingänge in den Entwicklungs retinogeniculate System (Abbildung 1) 7. RGCs von CX3CR1-EGFP heterozygote Mäuse wurden anterograd mit CTB-594 und CTB-647 zurückgeführt in die linke und rechte Auge. Nach dieser Verfolgung wurden EGFP-positiven Mikroglia im dCGL abgebildet. Diese Bilder wurden anschließend zur Volumenmessung Oberfläche gerendert.
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Diskussion
Um genau zu messen, Phagozytose, müssen verschlungen Material in einer Weise, dass der Forscher kann es einmal zu visualisieren lysosomalen Abbau aufgetreten gekennzeichnet werden. Außerdem wird eine hochauflösende Abbildung benötigt wird, gefolgt von der Verwendung von Software, die dem Forscher ermöglichen, das Volumen der gesamten Zell visualisieren und zu quantifizieren, dessen Inhalt. In diesem Protokoll beschreiben wir eine sehr zuverlässige und quantitative Verfahren zur Messung von Phagozyten-vermittelte Einwirk.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
, NRSA (F32-NS-066698; DPS); Arbeit wurde durch Zuschüsse aus der Smith Family Foundation (BS), Dana-Stiftung (BS), John Merck Scholars Program (BS), NINDS (BS RO1-NS-07100801) unterstützt wird, Nancy Lurie Marks Foundation (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Imaging Core).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Wärmekissen | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warmwasserquelle für Wärmekissen | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereomikroskop | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Operationsmikroskop | |
| Gleitmikrotom mit Gefriertisch | Leica | SM2010 R | |
| Mikrotomklinge | Leica | 14021607100 | |
| Fluoreszierendes Präpariermikroskop | Nikon | SMZ800 mit Epi-Fluoreszenz-Aufsatz | |
| Konfokales Spinning-Disk-Mikroskop | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning-Disk Konfokal | |
| 10 & Mikro; l Hamilton gasdichte Spritzen | Hamilton | 80030 | Verwenden Sie für jede Farbe eine andere Spritze Farbstoff/Tracer |
| Hamilton Nadeln | Hamilton | 7803-05, Spezifikationen: stumpf, 1,5" | |
| Alexa-konjugiertes Choleratoxin Β Untereinheit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Rekonstitution in steriler Kochsalzlösung, 80 &; Mikro; L (488), 100 &Micro; L (594), 20 &Micro; l (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung ( PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin und Polymyxin B-Sulfate und Bacitracin Zink Augensalbe USP (antibiotische Salbe) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30,5 G Nadel | Becton Dickinson | 305106 | |
| Federschere | Roboz | RS-5630 | |
| Applikator mit Wattespitze | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Elektronenmikroskopie Sciences | 15710 | Verdünnen Sie 16 % bis 4 % in PBS. Paraformaldehye ist giftig, verwenden Sie es in einem Abzug und tragen Sie persönliche Schutzausrüstung. |
| Sezierwerkzeuge – Schere, Pinzette, Spachtel | Kleine Schere: Fine Science Tools | Kleine Schere: 14370-22 | |
| Große Schere: Roboz | Große Schere: RS-6820 | ||
| #55 Pinzette: Fine Science Tools | #55 Pinzette: 11255-20 | ||
| Spatel: Ted Pella, Inc. | Spatel: 13504 | ||
| Saccharose | Sigma | S8501-5KG | Herstellung von 30% Saccharose in PBS (Gewicht/Vol.) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Waage | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-Well-Platten | BD Biosciences | 353047 | |
| Natriumphosphat monobasisch | Sigma | S6566-500G | 0,2 M Natriumphosphat monobasisch (PB-A) in ddH2O und 0,2 M Natriumphosphat zweibasisch (PB-B) in ddH2O herstellen. Um 0,1 M PB herzustellen, mischen Sie 19 ml PB-A und 81 ml PB-B, füllen Sie auf 200 ml mit ddH2O |
| Natriumphosphat zweibasisch | Sigma | S5136-500G | |
| Deckgläser, 22 x 50 mm, Nr. 1,5 | VWR | 48393 194 | |
| geladener Objektträger | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
Referenzen
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Aguzzi, A., et al. Microglia: scapegoat, saboteur, or something else. Science. 339 (6116), 156-161 (2013).
- Tremblay, M. ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
