Methodenartikel

Zwei Methoden zur Festlegung von primären humanen Endometrium Stromazellen aus Hysterektomie Proben

DOI:

10.3791/51513

⸱

23. Mai 2014

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Virginia, 2Department of Obstetrics & Gynecology, University of Virginia

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aufbau primären Endometrium-Stroma-Zellkultursysteme von Hysterektomie Proben ist eine wertvolle biologische Technik und ein entscheidender Schritt vor der Verfolgung einer Vielzahl von Forschungszielen. Hier beschreiben wir zwei Verfahren verwendet, um stromale Kulturen von chirurgisch entfernten endometrialen Geweben menschlichen Patienten zu etablieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es wurden viele Anstrengungen gewidmet, in vitro Zellkultursystemen zu schaffen. Diese Systeme sind für eine große Anzahl von in-vivo-Prozesse zu modellieren. Zellkultursystemen aus humanen endometrialen Proben sind keine Ausnahme. Die Anwendungen reichen von normalen zyklischen physiologischen Prozesse Endometrium-Krankheiten wie gynäkologischen Krebserkrankungen, Infektionskrankheiten, und der Fortpflanzung. Hier bieten wir zwei Methoden zur Festlegung primären Endometrium Stromazellen aus chirurgisch entfernten Endometrium Hysterektomie Proben. Das erste Verfahren wird als "Schaben-Verfahren" bezeichnet und beinhaltet mechanisches Abkratzen mit chirurgischen oder Rasierklingen, während das zweite Verfahren wird als "die Trypsin-Verfahren". Dieses letztere Verfahren verwendet, das die enzymatische Aktivität von Trypsin, um die Trennung von Zellen und primäre Förderung Zellauswuchs. Wir veranschaulichen die Schritt-für-Schritt-Methode durch digitale Bilder und Mikroskopie. Wir auch provide Beispiele für die Validierung von Endometrium-Stroma-Zelllinien über quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und Immunfluoreszenz (IF).

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die menschlichen Uterus Korpus besteht aus drei Schichten, die Perimetrium (bzw. Serosa), Myometrium und Endometrium besteht. Unterscheiden jeder dieser Schichten ist ein wichtiger Schritt, um endometriale Zelllinien zu etablieren. Die Perimetrium ist die äußerste Schicht des Uterus und von dünnen, serösen Zellen. Myometrium ist die dicke, mittlere Schicht des Uterus und der glatten Muskelzellen besteht. Das Endometrium wird als die innere Schicht des Uterus identifiziert und enthält Epithel-und Stroma-Zellpopulationen.

Das Endometrium wird weiter in die basalis Schicht, deren Stammzellpopulation wird die Hypothese aufgestellt, um die Schicht functionalis besiedeln etwa alle 28 Tage 1 unterteilt. Die functionalis Schicht der menschlichen Endometrium erfährt wesentliche biochemische und morphologische Veränderungen als Reaktion auf zirkulierende Hormone. Diese Hormone werden aus der Hypophyse und Eierstöcke abgeleitet.

Diekoordiniert die Produktion und Freisetzung von Hormonen zu einer Fortpflanzungszyklus. Der Fortpflanzungszyklus ist entworfen, um das Endometrium für mögliche Einnistung des Embryos Ereignisse vorzubereiten. Beim Menschen wird der Fortpflanzungszyklus als "Menstruationszyklus" bekannt und in drei Phasen unterteilt - proliferative, sekretorischen und Menstruations. Die proliferative Phase beinhaltet die Proliferation des Endometrium functionalis Schicht, während der sekretorischen Phase wird durch functionalis Reifung markiert. Insbesondere extrazelluläre Veränderungen, Sekrete und die zelluläre Differenzierung Signal ein Potential Implantation. Wenn Implantation nicht vor dem Ende des sekretorischen Phase auftreten, wird der functionalis Endometrium-Schicht während des Menstruationsphase zu vergießen. Die Bedeutung der Menstruation und die Ereignisse, die das Ablösen des functionalis Schicht auslösen, werden noch diskutiert. Beim Menschen wurde gestellt, dass die Menstruation ist das Ergebnis einer bestimmten mittleren sekretorischen Phase Differenzierung Ereignis bekanntals "spontane Dezidualisierung" 2. In diesem Manuskript, bieten wir detaillierte Methodik für beide Endometrium-Stroma-Zellisolationsverfahren, und verwenden eine Kombination von Immunfluoreszenz und digitale Bilder, um die Wirksamkeit dieser Ansätze zu demonstrieren. Darüber hinaus wenden wir eine häufig in vitro-Modell der spontanen Dezidualisierung zur Endometrium-Stroma-Zellisolierung bestätigen.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hysterektomie Proben in diesem Manuskript verwendet wurden, in Übereinstimmung mit einer von der Universität IRB-zugelassene Ethik-Protokoll nummeriert IRB-HSR # 14424 gesammelt.

1. Probennahme von Clinical Quelle

  1. Erhalten Regierung und Institutionen auf der Grundlage ethischer Richtlinien und Genehmigungsunterlagen vor Beginn.
  2. Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen.
  3. Bewahren Patienten stamm Gewebe in Medien (RPMI oder DMEM / hohe Glucose) in einem 50 ml-Röhrchen bei 4 ° C, wenn die Probe nicht in Kultur sofort verarbeitet werden. Proben können in diesem Zustand für maximal 24 Stunden gelagert werden.
  4. Dreimal waschen Gewebeprobe mit 1X steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und die Lösung verwerfen zwischen den Waschgängen.

2. Herstellung von primären Zelllinien mit Hilfe der Methode Scraping

  1. Hinzufügen 4-10 ml Wachstumsmedium (RPMI-oder DMEM / Hoch Glucose mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomyces ergänztCIN), um Gewebe und fügen Fungizone (0,25 &mgr; g / ml Endkonzentration) für 30 min.
  2. Entsorgen Sie die Wachstumsmedien.
  3. Zweimal waschen Gewebe mit 1X PBS.
  4. Legen Sie das Gewebe auf einer 6 cm Zellkulturplatte zwischen Myometrium und Endometrium Schichten (siehe Fig. 2A-2C für die weitere Beschreibung) unterscheiden. Trennen Sie die Gebärmutterschleimhaut.
  5. Mit einem Skalpell oder einer Rasierklinge, durchschneiden das Gewebe in kleine Stücke, während Kratzen auf den 6 cm Zellkulturschale. Diese Kratzer erleichtern die Befestigung der neuen primären Endometrium-Zellen. Verglichen mit dem Trypsin-Verfahren wird mehr Gewebe benötigt (siehe Abbildung 2D für eine Näherung).
  6. Sanft, 2 ml Wachstumsmedium zerkratzt Schale (Gewebefragmente sichtbar und im Idealfall aus dem Kratzen Bewegung immobilisiert sein).
  7. Übertragen Sie die Platte (n) zu einem bestimmten Zellkulturbrutschrank (37 ° C und 5% CO 2). Bestimmen Sie einen Ort für primäre Zelllinien, weg von othäh Zellkulturschalen. Primärkulturen sind empfindlicher gegenüber Infektion und Kontamination.
  8. Untersuchen Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop täglich. Kleine Populationen von Zellen sollten durch zwei oder drei Tage um von den geschnittenen Gewebe entstehen (siehe Fig. 3B).
  9. Um Kulturen zu erhalten, vorsichtig waschen mit 1X PBS und fügen Sie frisches Wachstumsmedium (2 ml) alle drei Tage. Wenn Proliferationsrate zunimmt, können zusätzliche Wachstumsmedien (3-4 ml) zu der 6 cm-Kulturplatte (n) hinzugefügt werden.
    Hinweis: Während des Wasch-und Medienwechsel, werden Gewebestücke wahrscheinlich abgesaugt werden. Dies beeinflusst nicht das Wachstum von adhärenten Zellen. Gewebestücke sollten durch den nachfolgenden Schritt (2.10) angesaugt werden als neue Kolonien sind unwahrscheinlich, nach einer Woche entstehen.
  10. Wenn die 6 cm Platte etwa 75-80% konfluent (siehe Abbildung 3B), Durchgang mit 0,05% Trypsin. Primäre Zellen nicht unbegrenzt agiert werden - einfrieren unten eine Platte von Zellen, sobald zwei oder drei Platten sind maintained. Wenn mehrere Durchgänge erforderlich sind, folgen einer Immortalisierung Protokoll (in Ref. 3 reviewed).

3. Herstellung von primären Zelllinien mit dem Trypsin-Methode

  1. Eine kleine Stück Endometrium (siehe Fig. 2D eine Annäherung) in 2 ml 0,25% Trypsin mit Kanamycin (0,03 mg / ml Endkonzentration) ergänzt.
  2. Inkubieren Gewebe bei 37 ° C auf rotierenden Plattform für 30 min.
  3. Kurz vortexen das Gewebe.
  4. Zentrifugieren Sie die Probe bei 200-400 g für 2 min und den Überstand verwerfen.
  5. Fügen Sie frisches Trypsin und Kanamycin.
  6. Inkubieren des Gewebes bei 37 ° C unter Rotation für eine Stunde.
  7. Mischen Sie das Gewebe für 5-10 sek.
  8. Hinzufügen von 2 ml Wachstumsmedium (mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin), um das Trypsin zu deaktivieren.
  9. Centrifuge Zellen bei 200-400 g für 2-3 min.
  10. Überstand verwerfen und 2 ml wachsenth Medien zu den pelletierten Zellen.
  11. Platte auf eine 6 cm Zellkulturschale. Kratzen Sie die Platte wie in Schritt 2.5 von Herstellung von primären Zelllinien mit Hilfe des Scraping-Methode ist nicht notwendig, aber erhöht die Bindung und Auswuchs der Primärkulturen.
  12. Überwachung der Zellen unter einem Lichtmikroskop täglich. Die Zellen sind in der Regel sichtbar unter einem Lichtmikroskop nach 24-48 h (siehe Abbildung 3C).
  13. Um die Kulturen zu erhalten, die Zellen zu überwachen und ändern Medien alle 2-3 Tage, wie in Schritt 2.9.
  14. Um Durchgang die Zellen, verwenden Sie 0,05% oder 0,25% Trypsin, wenn die Zellen 75-80% Konfluenz erreichen (siehe Abbildung 3C).

4. Speichern Extra-Tissue für Analyse (Snap-Freezing und Formalin-Fixierung)

  1. Zweimal waschen Probe mit 1X PBS.
  2. Saugen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich.
  3. Für Snap-Freezing, legen Endometrium-Gewebe-Probe in einem 1,7-Zentrifugenröhrchen (siehe Abbildungen 2F und 2G). Platzieren Sie die 1,7Zentrifugenröhrchen in flüssigen Stickstoff für 10 Sek. oder bis es ersichtlich, dass das Gewebe nach unten eingefroren.
    Hinweis: Achten Sie darauf, nicht direkt berühren flüssigem Stickstoff bei der Herstellung von Proben. Die Proben können bei -80 ° C bis zur weiteren Verarbeitung oder Analyse gespeichert werden.
  4. Für Formalin-Fixierung, schneiden Sie ein kleines Stück von Endometrium-Gewebe (siehe Abbildung 2H), und tauchen in 10% gepuffertem Formalin Zink. Nach 24 Stunden verwerfen Formalin und fügen Sie 70% Ethanol, um Gewebeproben bis zur Weiterverarbeitung.

5. Immunfluoreszenz (IF)

  1. Zellfixierung
    1. Vorbereitung der Zellen auf einem Objektträger oder Kulturplatte.
    2. Sanft waschen Sie die Zellen mit 1X PBS.
    3. Hinzufügen vorgekühlte (4 ° C), Methanol und Aceton (Verhältnis 1:1 gemischt) für 5 min.
    4. Air die Folie trocknen, bevor Sie fortfahren. Folie kann bei 4 ° C für 1-2 Wochen bei Bedarf gespeichert werden.
  2. Verarbeitung IF
    1. Rehydrate Zellen mit 1X PBS für 10 min. Für die following Schritte 1-6, führen alle Waschungen und Inkubation auf einer rotierenden Plattform.
    2. Block mit 1X PBS, ergänzt mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 1% Serum artspezifisch (Quelle 2. Antikörper) für 30 min bei Raumtemperatur (RT).
    3. Inkubation in primären Antikörper (siehe Empfehlungen der Hersteller für die Antikörper-Verdünnungen). Beziehen sich auf Materialien für die spezifischen Antikörper. Verdünnen Sie die primären Antikörper in Blockierungspuffer frisch wie in Schritt 5.2.2. Diese Inkubation für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C durchgeführt werden
    4. 3 x waschen mit 1X PBS für jeweils 5 min.
    5. Inkubation in Sekundärantikörper (siehe Empfehlungen der Hersteller für die Antikörper-Verdünnungen). Verdünnen Sie die sekundären Antikörper in Blockierungspuffer frisch wie in Schritt 5.2.2. Auf Foto-Bleich verhindern, ist es wichtig, diese und die nachfolgenden Schritte in der Abwesenheit von Licht durchzuführen.
    6. 3 x waschen mit 1X PBS für jeweils 5 min.
    7. Thoroughly trocknen die Dias.
    8. In Medien-und Montage DAPI Gegenfärbung Lösung.
    9. Bewerben Deckglas und die Ränder mit Dichtstoff (e). Folien können bei 4 ° C im Dunkeln für bis zu 2 Wochen gelagert werden.

6. RNA-Extraktion

  1. Tablette 1 x 10 7 Zellen durch Zentrifugation. Alle Materialien und Reagenzien in diesem Protokoll sollten frei RNase werden.
  2. Lysieren Zellen in 1 ml Trizol-Reagenz, und Inkubieren der homogenisierten Proben für 10 min bei Raumtemperatur, um die Dissoziation Nukleoproteinkomplexen abzuschließen.
  3. In 200 ul Chloroform pro 1 ml TRIZOL. Kräftiges Schütteln per Hand für 15 Sekunden und Inkubation für 2-3 min bei RT.
  4. Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit (15.000 × g) für 15 min bei 4 ° C. Drei Schichten führen wird.
  5. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. 1 ul Glykogen, um die RNA-Ausbeute zu erhöhen; allerdings ist dieser Schritt nur erforderlich, wenn eine kleineRNA-Menge, zu rechnen.
  6. 0,5 ml Isopropyl-Alkohol zu der wässrigen Schicht und invertieren die Proben 3-5 mal. Proben Inkubation bei RT für 10 min. Um die Ausbeute zu erhöhen, können die Proben in -20 ° C oder -80 ° C für 30 min gebracht werden.
  7. Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 10 min bei 4 ° C.
  8. An diesem Punkt sollte eine kleine RNA-Pellet sichtbar. Überstand verwerfen.
  9. Mit 1 ml 75% Ethanol waschen der RNA.
  10. Zentrifugieren bei maximaler Geschwindigkeit für 5 min und den Überstand verwerfen. Proben noch einmal anorganischen Verunreinigungen zu befreien gewaschen werden, aber dieser Schritt ist nicht notwendig.
  11. Kurz gesagt, trocknen die RNA-Pellet bis zur RNA-Pellet trocken ist (dauert in der Regel 7-10 min).
    Hinweis: Ein zusätzlicher Schritt kann verwendet werden, um anorganische Stoffe zu verringern und verringern die Trocknungszeit werden. Nach Verwerfen des Überstands aus der Ethanolwaschschleuder Proben bei maximaler Geschwindigkeit für eine zusätzliche Minute und Restflüssigkeit absaugen. Achten Sie darauf, Pellet abzusaugen.
  12. Auflösen RNA in RNase-freiem Wasser, je nach der Größe der RNA-Pellet. Volumes liegen typischerweise im Bereich von 10 bis 50 ul.
  13. Proben inkubieren bei 55 ° C für 10 min und Messen der Konzentration von RNA.
  14. Proben bei -20 ° C bis zur Weiterverarbeitung.

7. Reverse Transkription

  1. Bringen Sie die Proben-RNA (1-3 &mgr; g) auf ein Volumen von 9 &mgr; l mit H 2 O.
  2. Wärme RNA auf 70 ° C für 10 min.
  3. Um eine AMV Mastermix erzeugen, kombiniert die folgenden Reagenzien: 5 &mgr; l dNTP (Arbeitskonzentration von 50 &mgr; M), 5 &mgr; l N6-DNA-Oligos (Arbeitskonzentration von 80 uM), 5 ul 5X AMV-Puffer und 1 &mgr; l AMV . Dieser Master-Mix-Lösung wird eine Probe pro ausgelegt.
  4. In 16 ul des Master-Mix zum beheizten RNA. Das endgültige Reaktionsvolumen 25 ul Reaktion sein.
  5. Mit den folgenden PCR-Bedingungen für die reverse Transkription: (Stufe 1) 42 ° C für 90 min, (StaGe 2) 95 ° C für 5 min, und (3. Stufe) 4 ° C bis zur Weiterverarbeitung.

8. Real Time PCR

  1. PCR-Reaktionen durchzuführen unter Verwendung der Primer, Glühtemperaturen Zykluszahlen und Reagenzien in Tabelle 1 angegeben.
    Hinweis: Es ist ideal, um die Anweisungen des Herstellers folgen, wenn mit Hilfe der PCR-Reagenzien (siehe Firmen und Katalognummern in Materials).

9. In vitro Dezidualisierung Protocol (aus Ref. 4 und 5 Abgeleitet)

  1. Platte Endometrium-Zellen.
  2. Wachsen bis zu einer Konfluenz von 75-85%.
  3. Nachdem die Zellen konfluent werden, einmal zu waschen mit 1X PBS.
  4. Schnell, fügen hormonfreien Medien (Phenol RPMI, ergänzt mit 5% Kohlestreifen FBS und 1% Penicillin-Streptomycin).
  5. Nach 24 Stunden, fügen Sie mit Medroxyprogesteronacetat (MPA), ergänzt mit einer endgültigen Konzentration von 1 uM und 8-bromoadenosine 3 hormonfreien Medien ', 5'-Monophosphat (cAMP) in einer Endkonzentration von 0,5 mM.
  6. Nach mindestens 48 Stunden, stoppen Sie die Reaktion und speichern Sie die Platte (n) zur weiteren Verarbeitung.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wie im Abschnitt Protokoll betont, sicher sein, alle Methoden von der Regierung, institutionellen und ethischen Richtlinien bei der Handhabung und Herstellung von humanem Gewebe durchzuführen.

In diesem Manuskript enthalten ist eine Darstellung der allgemeinen Arbeitsabläufe der "Schaben-Methode" (Fig. 1A) und "der Trypsin-Methode" (1B) verwendet werden, um primäre Kulturen Endometrium herzustellen. (- 3. Siehe Teile 1.) Diese Methoden sind ...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Andere Gruppen sind für die Herstellung von Endometrium-Stromazellen Kulturen, von denen die meisten zu nutzen Kollagenase 4,12,13,15-18 beschriebenen Methodik und angepasst. In diesem Manuskript haben wir Methoden und Beweise für zwei vereinfachte primären Endometrium-Stroma-Kulturmethoden, die beide von unserem Labor aus wirtschaftlichen Gründen und der günstigen Verfügbarkeit von Trypsin und / oder einer Rasierklinge verwendet werden, vorausgesetzt.

Beim Vergleich unserer zwei ...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu Veröffentlichung.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken den gemeinsamen Bemühungen von Dr. Thao Dang und Mitglieder ihr Labor für die Nutzung ihrer Bild und Mikroskoptechnik. Wir danken auch der Biobanken und Tissue Research Facility (BTRF) Kern, Jeff Harper, und die Bewohner an der Universität von Virginia für uns mit Gebärmuttergewebe. Wir danken Karol Szlachta für die Hilfe bei Schematische Übersicht.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 Trypsin oder 0,05 % Trypsin;HycloneSH3023602 oder SH30004202
1,7 Mikro-Zentrifugenröhrchen   Genesee Scientific22-272A
1 &Mikro; L, 20 &Mikro; L, 200 ml und 1.000 & Mikro; l Pipette   Genesee Scientific24-401,24-402, 24-412, 24-430
15 ml konische Tube Hyclone339650
50 ml konisches Röhrchen Hyclone339652
6 cm Zellkulturschale Thermo scientific12-556-002
8-Well-Kammern Thermo ScientificAB-4162
Acetat Fisher scientificC4-100
AMV RT Enzym/Puffer Bio LabsM077L
Rinderserumalbumin (BSA)Fisher ScientificBP-1605-100
Gepuffertes Zink-Formalin Thermo59201ZF
Holzkohleband FBS FisherNC9019735
Chloroform Fisher ScientificBP1145-1
Deckglas Fisher Brand12-544D
Zyklischer AMP (cAMP)SigmaB7880
DMEM/Hohe Glukose HycloneSH30243FS
dNTP BiolineBIO-39025
Esel Anti Ziege -TRITC Santa CruzSC-3855
Esel-Serum Jackson' s lab017-000-002
E Cadherin Antikörper   Epitomics1702-1
Ethanol Fisher ScientificBP2818-1
Fötales Kälberserum (FBS)Fisher Scientific03-600-511
Fungizone Amphotericin B Gibco15290-018
GAPDH Sonde Life TechnologiesHS99999905
Glykogen 5Prime2301440
Ziege Anti Maus - FITC Jackson' s Labor115-096-003
Isopropanol Fisher ScientificBP2618-1
Kanamycin   Fisher ScientificBP906-5
Medroxyprogesteronacetat (MPA)SigmaM1629
MeOH (Methanol)Fisher ScientificA4-08-1
Eindeckmedien (mit DAPI) VektorlabratorienH-1500
N6 DNA-Oligos Invitrogen
Nummer 15 Schaber   BD371615
Pan Cytokeratin  Maus mAB Zellsignalisierung4545
PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)Fisher ScientificBP-399-4
Penicillin-Streptomycin-Glutamin-Lösung 100X   HycloneSV30082.01
PML Anti Ziege Anti Körper Santa CruzSC-9862
Grundierung(en) Eurofins
RPMI HycloneSH30027FS
RPMI (phenolfrei)  Gibco11835
Sybr Grün   Thermo ScientificAB-4162
Taqman ThermoAB-4138
Trizol Life Technologies15596018
Vimentin Antikörper Epitomik4211-1

Referenzen

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Schlagwörter

Prim re ZellkulturScraping MethodeTrypsin MethodeZellisolationstechnikmikroskopische BeobachtungqPCR ValidierungImmunfluoreszenz ValidierungCytokeratin Verlust

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