Zwei Methoden zur Festlegung von primären humanen Endometrium Stromazellen aus Hysterektomie Proben

Summary

Aufbau primären Endometrium-Stroma-Zellkultursysteme von Hysterektomie Proben ist eine wertvolle biologische Technik und ein entscheidender Schritt vor der Verfolgung einer Vielzahl von Forschungszielen. Hier beschreiben wir zwei Verfahren verwendet, um stromale Kulturen von chirurgisch entfernten endometrialen Geweben menschlichen Patienten zu etablieren.

Abstract

Es wurden viele Anstrengungen gewidmet, in vitro Zellkultursystemen zu schaffen. Diese Systeme sind für eine große Anzahl von in-vivo-Prozesse zu modellieren. Zellkultursystemen aus humanen endometrialen Proben sind keine Ausnahme. Die Anwendungen reichen von normalen zyklischen physiologischen Prozesse Endometrium-Krankheiten wie gynäkologischen Krebserkrankungen, Infektionskrankheiten, und der Fortpflanzung. Hier bieten wir zwei Methoden zur Festlegung primären Endometrium Stromazellen aus chirurgisch entfernten Endometrium Hysterektomie Proben. Das erste Verfahren wird als "Schaben-Verfahren" bezeichnet und beinhaltet mechanisches Abkratzen mit chirurgischen oder Rasierklingen, während das zweite Verfahren wird als "die Trypsin-Verfahren". Dieses letztere Verfahren verwendet, das die enzymatische Aktivität von Trypsin, um die Trennung von Zellen und primäre Förderung Zellauswuchs. Wir veranschaulichen die Schritt-für-Schritt-Methode durch digitale Bilder und Mikroskopie. Wir auch provide Beispiele für die Validierung von Endometrium-Stroma-Zelllinien über quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und Immunfluoreszenz (IF).

Introduction

Die menschlichen Uterus Korpus besteht aus drei Schichten, die Perimetrium (bzw. Serosa), Myometrium und Endometrium besteht. Unterscheiden jeder dieser Schichten ist ein wichtiger Schritt, um endometriale Zelllinien zu etablieren. Die Perimetrium ist die äußerste Schicht des Uterus und von dünnen, serösen Zellen. Myometrium ist die dicke, mittlere Schicht des Uterus und der glatten Muskelzellen besteht. Das Endometrium wird als die innere Schicht des Uterus identifiziert und enthält Epithel-und Stroma-Zellpopulationen.

Das Endometrium wird weiter in die basalis Schicht, deren Stammzellpopulation wird die Hypothese aufgestellt, um die Sch....

Protocol

Hysterektomie Proben in diesem Manuskript verwendet wurden, in Übereinstimmung mit einer von der Universität IRB-zugelassene Ethik-Protokoll nummeriert IRB-HSR # 14424 gesammelt.

1. Probennahme von Clinical Quelle

1. Erhalten Regierung und Institutionen auf der Grundlage ethischer Richtlinien und Genehmigungsunterlagen vor Beginn.
2. Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen.
3. Bewahren Patienten stamm Gewebe in Medien (RPMI oder DMEM / hohe Glucose) in einem 50 ml-Röhrchen bei 4 ° C, wenn die Probe nicht in Kultur sofort verarbeitet werden. Proben können in diesem Zustand für maximal 24 Stunden gelagert w....

Results

Wie im Abschnitt Protokoll betont, sicher sein, alle Methoden von der Regierung, institutionellen und ethischen Richtlinien bei der Handhabung und Herstellung von humanem Gewebe durchzuführen.

In diesem Manuskript enthalten ist eine Darstellung der allgemeinen Arbeitsabläufe der "Schaben-Methode" (Fig. 1A) und "der Trypsin-Methode" (1B) verwendet werden, um primäre Kulturen Endometrium herzustellen. (- 3. Siehe Teile 1.) Diese Methoden sind .......

Discussion

Andere Gruppen sind für die Herstellung von Endometrium-Stromazellen Kulturen, von denen die meisten zu nutzen Kollagenase ^{4,12,13,15-18} beschriebenen Methodik und angepasst. In diesem Manuskript haben wir Methoden und Beweise für zwei vereinfachte primären Endometrium-Stroma-Kulturmethoden, die beide von unserem Labor aus wirtschaftlichen Gründen und der günstigen Verfügbarkeit von Trypsin und / oder einer Rasierklinge verwendet werden, vorausgesetzt.

Beim Vergleich unserer zwei .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 Trypsin oder 0,05 % Trypsin;	Hyclone	SH3023602 oder SH30004202
1,7 Mikro-Zentrifugenröhrchen	Genesee Scientific	22-272A
1 &Mikro; L, 20 &Mikro; L, 200 ml und 1.000 & Mikro; l Pipette	Genesee Scientific	24-401,24-402, 24-412, 24-430
15 ml konische Tube	Hyclone	339650
50 ml konisches Röhrchen	Hyclone	339652
6 cm Zellkulturschale	Thermo scientific	12-556-002
8-Well-Kammern	Thermo Scientific	AB-4162
Acetat	Fisher scientific	C4-100
AMV RT Enzym/Puffer	Bio Labs	M077L
Rinderserumalbumin (BSA)	Fisher Scientific	BP-1605-100
Gepuffertes Zink-Formalin	Thermo	59201ZF
Holzkohleband FBS	Fisher	NC9019735
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1
Deckglas	Fisher Brand	12-544D
Zyklischer AMP (cAMP)	Sigma	B7880
DMEM/Hohe Glukose	Hyclone	SH30243FS
dNTP	Bioline	BIO-39025
Esel Anti Ziege -TRITC	Santa Cruz	SC-3855
Esel-Serum	Jackson' s lab	017-000-002
E Cadherin Antikörper	Epitomics	1702-1
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818-1
Fötales Kälberserum (FBS)	Fisher Scientific	03-600-511
Fungizone Amphotericin B	Gibco	15290-018
GAPDH Sonde	Life Technologies	HS99999905
Glykogen	5Prime	2301440
Ziege Anti Maus - FITC	Jackson' s Labor	115-096-003
Isopropanol	Fisher Scientific	BP2618-1
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5
Medroxyprogesteronacetat (MPA)	Sigma	M1629
MeOH (Methanol)	Fisher Scientific	A4-08-1
Eindeckmedien (mit DAPI)	Vektorlabratorien	H-1500
N6 DNA-Oligos	Invitrogen
Nummer 15 Schaber	BD	371615
Pan Cytokeratin  Maus mAB	Zellsignalisierung	4545
PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)	Fisher Scientific	BP-399-4
Penicillin-Streptomycin-Glutamin-Lösung 100X	Hyclone	SV30082.01
PML Anti Ziege Anti Körper	Santa Cruz	SC-9862
Grundierung(en)	Eurofins
RPMI	Hyclone	SH30027FS
RPMI (phenolfrei)	Gibco	11835
Sybr Grün	Thermo Scientific	AB-4162
Taqman	Thermo	AB-4138
Trizol	Life Technologies	15596018
Vimentin Antikörper	Epitomik	4211-1