Zwei-Photonen- In vivo Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

Summary

Zeitraffer-Bildgebung am lebenden Tier liefert wertvolle Informationen über die strukturelle Reorganisation im intakten Gehirn. Hier stellen wir ein verdünntes Schädelpräparat vor, das die transkranielle Bildgebung von fluoreszenzmarkierten synaptischen Strukturen in der lebenden Mausrinde mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht.

Abstract

In der Säugetier Cortex, Neuronen äußerst kompliziert Netzwerken und den Austausch von Informationen an den Synapsen. Veränderungen in der synaptischen Stärke, sowie Hinzufügen / Entfernen von Synapsen, treten in einer Erfahrung abhängig und bietet die strukturelle Grundlage der neuronalen Plastizität. Wie postsynaptischen Komponenten der Synapsen in der Großhirnrinde werden dendritische Dornen als eine gute Proxy von Synapsen sein. Unter Vorteile der Mausgenetik und fluoreszierende Markierungstechniken, einzelne Neuronen und ihre synaptischen Strukturen im intakten Gehirn gekennzeichnet werden. Hier haben wir eine transkranielle Bildgebungsprotokoll einzuführen mit Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie zur fluoreszenzmarkierten postsynaptischen dendritischen Dornen im Laufe der Zeit in vivo zu folgen. Dieses Protokoll verwendet einen ausgedünnten Schädel Zubereitung, die den Schädel intakt hält und vermeidet inflammatorische Effekte durch die Exposition der Hirnhäute und die Rinde verursacht. Daher können Bilder sofort nach su erworben werdenrgery durchgeführt wird. Das experimentelle Verfahren kann wiederholt über verschiedene Zeitintervalle im Bereich von Stunden bis zu Jahren durchgeführt werden. Die Anwendung dieser Zubereitung kann auch erweitert werden, um verschiedenen kortikalen Regionen und Schichten sowie andere Zelltypen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen, werden.

Introduction

Die Säugetier Kortex beteiligt sich an zahlreichen Hirnfunktionen, von der Sinneswahrnehmung und Bewegungssteuerung, um abstrakte Informationsverarbeitung und Kognition. Verschiedene kortikaler Funktionen bauen auf verschiedenen neuronalen Schaltkreisen, die aus verschiedenen Arten von Neuronen, die Kommunikation und den Austausch von Informationen an einzelnen Synapsen gemacht. Die Struktur und Funktion der Synapsen werden kontinuierlich in Abhängigkeit von Erfahrungen und Pathologien modifiziert. In reifen Gehirn nimmt die Form der synaptischen Plastizität beider Stärke Veränderungen und Hinzufügen / Entfernen von Synapsen, spielen eine wichtige Rolle in Bildung un....

Protocol

Genehmigung braucht, um von zu Hause aus Institutionen vor Beginn der Operation und bildgebenden Studie gewonnen werden. In dieser Handschrift beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften von der University of California, Santa Cruz Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss durchgeführt.

1. Chirurgie

1. Autoklav alle chirurgischen Instrumenten und sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Alkohol gründlich vor der Operation.
2. Anesthetize die Maus durch intraperitoneale (IP) Injektion von KX Anästhesielösung (200 mg / kg Ketamin und 20 mg / kg Xylazin) nach der Mauskör....

Results

In YFP-H Linie Mäusen ²⁵ drückt gelb fluoreszierenden Proteins in einer Teilmenge der Schicht V pyramidalen Neuronen, die ihren apikalen Dendriten auf den oberflächlichen Schichten des Cortex projizieren. Durch den ausgedünnten Schädel Herstellung die fluoreszierend markierten dendritischen Segmente wiederholt unter Zwei-Photonen-Mikroskop über verschiedene Abbildungsintervalle abgebildet werden, im Bereich von Stunden bis Monaten. Hier zeigen wir ein Beispiel eines Vier-Zeitabbildung der gleichen Dendriten ü.......

Discussion

Um eine erfolgreiche dünnten Schädel Präparat zu erhalten, sind mehrere Schritte in diesem Protokoll entscheidend. 1) Die Dicke des Schädels. Die Schädelknochen hat eine Sandwich-Struktur mit zwei Schichten aus kompaktem Knochen mit hoher Dichte und einer Mittelschicht aus Low-Density-spongiösen Knochen. Während der Hochgeschwindigkeits-Mikrobohrer ist geeignet zum Entfernen der äußeren Schichten der kompakte Knochen und spongiösen Knochen, ist die mikrochirurgische Klinge ideal zum Verdünnen des inneren Schicht aus kom.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamin	Bioniche Pharma	67457-034-10	Gemischt mit Xylazin für die Anästhesie
Xylazine	Lloyd Laboratories	139-236	Gemischt mit Ketamin für die Anästhesie
Kochsalzlösung	Hospira	0409-7983-09	0,9 % NaCl für Injektionen und Bildgebung
Rasierklingen	Elektronenmikroskopie	Wissenschaften 72000	Zweischneidige Rasierklingen aus Edelstahl
Alkohol-Pads	Fisher Scientific	06-669-62	Sterile Alkohol-Vorbereitungspads
Augensalbe	Henry Schein	102-9470	Vaseline Augensalbe steriles Augenschmiermittel
Hochgeschwindigkeits-Mikrobohrer	Fine Science Tools	18000-17	Der Hochgeschwindigkeits-Mikrobohrer eignet sich zum Ausdünnen der äußeren Schicht von kompaktem Knochen und zum Anvisieren eines kleinen Bereichs
Mikrobohrer-Stahlgrate	Fine Science Tools	19007-14 1,4	mm Durchmesser
Mikrochirurgische Klinge	Surgistar	6961	Die mikrochirurgische Klinge eignet sich zum Ausdünnen der inneren Schicht aus kompaktem Knochen und der mittleren Schicht aus schwammigem Knochen
Cyanacrylat-Kleber	Fisher Scientific	NC9062131	Befestigen Sie die Kopfplatte auf dem
Schädel Naht	Havard Apparatus	510461	Nicht absorbierende, sterile Seidennaht, 6-0
Monofilament-Präpariermikroskop	Olympus		SZ61
CCD-Kamera	Infinity
Zwei-Photonen-Mikroskop	Prairie Technologies		Ultima IV
10X Objektiv	Olympus		NA 0,30, Luft
60X Objektiv	Olympus		NA 1.1, IR-durchlässig, Wasserimmersion
Ti-Saphir-Laser	Spectra-Physics		Mai Tai HP