Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven Drosophila Gewebe In-situ

Zusammenfassung

Immunfärbung ist eine effektive Technik zur Visualisierung spezifischer Zelltypen und Proteine innerhalb von Geweben. Durch die Verwendung von Ultraschall verringert das hier beschriebene Protokoll die Notwendigkeit, Drosophila melanogaster-Gewebe von Embryonen und Larven im Spätstadium vor der Immunfärbung zu präparieren. Wir bieten eine effiziente Methodik für die Immunfärbung von Formaldehyd-fixierten Whole-Mount-Larven.

Zusammenfassung

Studien in Drosophila melanogaster Embryonen durchgeführt und Larven stellen eine wichtige Einblicke in Entwicklungsprozesse wie Zell Schicksal Spezifikation und Organogenese. Immunfärbung ermöglicht die Visualisierung von sich entwickelnden Geweben und Organen. Eine Schutz Kutikula, die am Ende der Embryogenese bildet Jedoch verhindert die Permeation von Antikörpern in der späten Phase Embryonen und Larven. Während Dissektion vor der Immunfärbung wird regelmäßig verwendet werden, um Drosophila Larven Gewebe zu analysieren, erweist es sich als ineffizient für einige Analysen, weil kleine Gewebe kann schwierig sein, zu lokalisieren und zu isolieren. Beschallung stellt eine Alternative zur Dissektion in Larven von Drosophila-Immunfärbung Protokolle. Es ermöglicht die schnelle, gleichzeitige Verarbeitung einer großen Anzahl von Late-Stage-Embryonen und Larven und pflegt in situ Morphologie. Nach Fixierung in Formaldehyd wird eine Probe beschallt. Probe wird dann auf die Immunfärbung mit Antigen-spezifischen primären ant unteribodies und fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper zur Zielzelltypen und bestimmte Proteine ​​über Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen. Während des Prozesses der Ultraschallbehandlung ist die richtige Plazierung einer Beschallungssonde über der Probe, sowie die Dauer und die Intensität der Beschallung, kritisch. Für hohe Qualität Flecken können Zusätzliche kleinere Änderungen zur Standard-Immunfärbung Protokolle erforderlich. Antikörper mit niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis, in der Regel längere Inkubationszeiten erforderlich. Als Beweis für dieses Konzept Beschallung-Protokoll erleichtert, zeigen wir Immunfärbungen der drei Gewebetypen (Hoden, Eierstöcke, und Nervengewebe) mit einer Reihe von Entwicklungsstufen.

Einleitung

Drosophila-Embryonen und Larven bieten ein hervorragendes Modell, um Entwicklungsprozesse in vielen Organen und Geweben zu untersuchen. Imaging von einzelnen Zellen ist notwendig, um die komplexen Umgebungen, in denen Zellen entwickeln oft festzustellen, die in diesen Studien notwendig. Visualisierung von Zellen im Gewebe durch Immunfärbung erreicht werden. Gut beschriebene Immunfärbung Protokolle für embryonale Gewebe Drosophila <17 Stunden nach der Eiablage (AEL) ^1-3 existieren. Jedoch kann eine Schutz Kutikula Formen gegen Ende der Embryogenese und verhindert wirksam Antikörper Permeation. Somit sind diese Immunfärbung Protokolle ineff....

Protokoll

1. Herstellung einer Sammlung Cage

1. Betäuben junge, fruchtbare Fliegen mit CO _2. Übertragen betäubten Fliegen auf einen Käfig. Um eine optimale Ausbeute zu erhalten, verwenden Sie 100-120 erwachsenen Fliegen von 2-7 Tagen des Alters bei einem 4: 1-Verhältnis von Frauen zu Männern. Fliegen ermöglichen eine angemessene Eingewöhnungszeit, ~ 24 Stunden vor der Probe für den Erhalt Fixierung. Wenn der Käfig wurde mit jungfräulichen Weibchen gesetzt gepaart, um Männer, eine Verwendung einer 36 - 48 h Akklimatisierung.
2. Am offenen Ende des Käfigs, legen Sie einen vorbereiteten Apfelsaft-Agar-Platte mit einer Dime-Größe Tropfen Hefe-Paste in der....

Ergebnisse

Um die Wirksamkeit von Ultraschall-basierten Immunfärbung in der Analyse von Spätstadium der embryonalen und Larvengewebe in situ zu zeigen, wurden Wildtyp-Embryonen und Larven für Immunfärbung von Hoden, Eierstöcke, und Nervengewebe verarbeitet. Proben wurden mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet und repräsentative Ergebnisse sind dargestellt (Abbildung 1 und Abbildung 2). Ergebnisse zeigen, dass die beschriebenen Protokoll ist während der späten embryonalen bis Anfang / M.......

Diskussion

Dieses Protokoll liefert ein Verfahren zur Immunfärbung erfolgreich in situ gezielt Drosophila embryonalen und larvalen Geweben, wodurch die Notwendigkeit für die Präparation. Nach vor-Protokolle für die Färbung frühen Embryonen ^1,2,3 ist der Chorion-Membran mit 50% Bleichmittel (NaOCl) entfernt. Proben werden in Formaldehyd und Methanol fixiert. Weil die Larvencuticula verursacht älteren Probe zu schweben, wird die gesamte Probe dann durch eine Zell-Sieb geleitet, um Larven Retention zu gew.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Tabelle 1: Reagenzien und Puffer
Phosphatpuffer Triton X-100 (PBTx)			Für 5 L: 500 ml PBS 10X, 4,45 l ddH2O, 50 ml Triton 10%. Bei RT lagern.
Phosphatpuffer Kochsalzlösung 10X (PBS 10X)			Für 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4. Fügen Sie Komponenten hinzu und füllen Sie sie auf das entsprechende Volumen. Bei 4 °C lagern.
Triton 10%			Für 50 ml: 5 ml Triton, 5 ml PBS 10X, 45 ml ddH2O. Gestein zum Mischen. Bei RT lagern.
PEMS			0,1 M Rohre (pH 6,9), 2,0 mM MgSO4, 1,0 mM EGTA. Bei RT lagern.
Röhrchen			Für 400 ml einer 0,25 M Lösung (pH 6,9): 30,24 g Röhrchen dH20 NaOH. Lösen Sie die Pipes in 300 ml dH2O auf und stellen Sie sie dann mit NaOH auf pH 6,9 ein. Bringen Sie das Gesamtvolumen mit dH2O auf 400 ml und autoklavieren Sie es. Bei RT lagern.
Formaldehyd			37 % Formaldehyd in Methanol. Bei RT lagern. Lagern Sie das Gemisch aus Formaldehyd-, Heptan- und Methanolabfällen in einem dicht verschlossenen Behälter im Abzug, bevor Sie es gemäß den institutionellen Richtlinien entsorgen.
Heptan		CAS 142-82-5	n-Heptan. Bei RT lagern. Lagern Sie das Gemisch aus Formaldehyd-, Heptan- und Methanolabfällen in einem dicht verschlossenen Behälter im Abzug, bevor Sie es gemäß den institutionellen Richtlinien entsorgen.
Methanol		CAS 67-56-1	Bei RT lagern. Formaldehyd-, Heptan- und Methanolabfallgemische vor der Entsorgung gemäß den institutionellen Richtlinien in einem dicht verschlossenen Behälter im Abzug lagern.
Phosphatpuffer Tween (PBTw)			Zur Herstellung von 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilisieren nach Zugabe aller Komponenten. Bei 4 °C lagern.
Tween 10%			Für 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml PBS 10X, 40 ml ddH2O. Gestein zum Mischen. Bei RT lagern.
Rinderserumalbumin/Phosphatpuffer Tween (BBTw)			Zur Herstellung von 1 l: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Rinderserumalbumin (BSA). Fügen Sie BSA hinzu und sterilisieren Sie es mit einem 0,2 μ M Vakuum-Filteranlage. Bei 4 °C lagern.
Normales Ziegenserum (NGS)	ackson ImmunoResearch Laboratories	005-000-121	Zur Herstellung von 10 ml: Normales Ziegenserum 10 ml ddH2O. ddH2O in das Fläschchen mit NGS geben und mit einem 0,2 μ; m syrninge Filter. Lagern Sie Aliquots bei -20 °C.
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan (DABCO)		CAS: 281-57-9	Zur Herstellung von 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7,5), 2,5 g DABCO fest, 3,5 ml 6N HCl, 250 μ l 10N NaOH, 70 ml Glycerin. In einen 250 ml Becher mit Rührstab ddH2O, Tris HCl und DABCO geben. Rühren Sie um und fügen Sie dann 6N HCl, 10 N NaOH und Glycerin hinzu. Fügen Sie dann tropfenweise 10N NaOH hinzu, bis die Lösung einen pH-Wert von 7,5 erreicht. Aliquot. Lagern Sie Aliquots bei -20 °C.
DABCO + p-Phenylendiamin (PPD) Lösung			1,765 ml NaHCO3, 0,353 Na2CO3, 0,02 g PPD (CAS: 106-50-3). PPD in NaHCO3 und NaCO3Lösung auflösen. Addieren Sie 60 μ l PPD-Lösung auf 500 μm; l von DABCO. Lagern Sie Aliquots bei -20 °C.
			~200 Platten: 45 g Agar (CAS#9002-18-0), 45 g Kristallzucker (im Laden gekauft), 500 ml Apfelsaft (im Laden gekauft), 15 ml Tegosept 10%, 1,5 ml ddH2O. Agar zu ddH2O in einem 4-Liter-Kolben geben und 30 Minuten lang autoklavieren. Apfelsaft und Zucker auf einer erhitzten Rührplatte mischen. Fügen Sie nach und nach die Apfelsaftmischung zum autoklavierten Agar hinzu. Auf einer erhitzten Rührplatte mischen, dann 10 ml Volumen in 35 mm Petrischalen aliquotieren und bei RT erstarren lassen. Bei 4 °C lagern.
Tegosept 10%			Für 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml Ethanol. Lagern Sie Aliquots bei -20 °C.
Hefepaste			~50 g aktive Trockenhefe. ddH2O nach und nach in ein hefehaltiges Becherglas geben und dabei unter Rühren so lange auffüllen, bis eine pastöse Konsistenz erreicht ist. Bei 4 °C lagern.
Tabelle 2: Färbematerialien
DAPI	Invitrogen	D3571	1:1000, vorrätig bei 5 mg/ml.
Kaninchen Anti-Vasa			1:250, ein Geschenk von Ruth Lehmann.
Maus anti-fasciclin III	Entwicklungsstudien Hybridoma Bank (DSHB)	7G10	1:10
Maus anti-1B1	Entwicklungsstudien Hybridoma Bank (DSHB)	1B1	1:4
Guniea Schwein anti-Traffic Jam			1:2500, ein Geschenk von Dorthea Godt (Li et al., 2003).
Maus anti-Prospero	Entwicklungsstudien Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A	1:10
Ratte anti-Elav	Entwicklungsstudien Hybridoma Bank (DSHB)	7EBA10	1:30
Maus anti-Repo	Entwicklungsstudien Hybridoma Bank (DSHB)	8D12	1:10
Ziege anti-kaninchen Alexa546	Invitrogen	A11010	1:500
Ziege anti-maus Alexa488	Invitrogen	A11029	1:500
Ziege Anti-Guniea Schwein Alexa633	Invitrogen	A21105	1:500
Ziege Anti-Ratte Alexa488	Invitrogen	A11006	1:500<
Fliegenkäfige	Handgemacht; Genesee Scientific Corporation	Nicht zutreffend; Flaschen: 32-130; Vorgefertigter Käfig: 59-101	Hergestellt durch Schneiden von durchsichtigen gegossenen Acrylrohren (1 3/4 Zoll Durchmesser) in 4 Zoll hohe Segmente mit einer Mehrweggehrungssäge bei 400 U/min. Ultrafeines Edelstahlsieb (wurde an einem Ende der Wanne mit Acrylkleber befestigt. Eine alternative Methode mit einer leeren Fliegenfutterflasche findet sich in Drosophila Protokolle ISBN 0-87969-584-4. Käfige können auch von der Genesee Scientific Corporation erworben werden.
Ultraschallgerät: Branson 250 Digitaler Sonifikator	Branson	Modell: Branson Digital Sonifier 250
Ultraschallsonde	Branson	Modell #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Spritzenvorsatzfilter	Nalgene	190-25-20	0,2 μ m Zellulose, Acetat-Membranfilter
Bildgebungssystem: Konfokales Spinning-Disc-Mikroskop mit multichromatischer Lichtquelle, digitaler CCD-Kamera und Bildgebungssoftware	Mikroskop: Olympus, Lichtquelle: Lumen Dynamics, Kamera: Q-Imaging, Bildgebungssoftware: Intelligent Imaging Inc.		Mikroskop: BX51 ausgestattet mit DSU-Spinnscheibe, Lichtquelle: X-Cite 120Q, Kamera: RETIGA-SRV, Imaging-Software: Diabook 5.0
Vakuumfiltereinheit	Nalgene	450-0020	0,2 μ M Zellulosenitrat-Membranfilter