Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in Arabidopsis

Summary

Wir bieten hier eine effiziente und zuverlässige Protokoll für die Immunfärbung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, DNA-Färbung, gefolgt von quantitativen und hochauflösende Bildgebung in der whole-mount Arabidopsis thaliana Samenanlagen. Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um Chromatin-Modifikationen und Zellkernarchitektur zu analysieren.

Abstract

In blühenden Pflanzen ist der somatisch-to-Keimzelle Schicksal Übergang von der Spezifikation der Sporenmutterzellen (SMCs) in Blütenorgane der erwachsenen Pflanze markiert. Die weibliche SMC (Megaspore Mutterzelle, MMC) unterscheidet in der Samenanlage Primordium und Meiose. Das ausgewählte haploiden Megaspore läuft dann Mitose die vielzelligen weiblichen Gametophyten, die zu den Gameten geben wird, die Eizelle und Zentralzellen bilden zusammen mit akzessorischen Zellen. Die begrenzte Zugänglichkeit der MMC, meiocyte und weiblichen Gametophyten innerhalb der Samenanlage ist technisch anspruchsvoll für die zytologische und zytogenetische Analysen auf Einzelzellebene. Insbesondere ist eine direkte oder indirekte Immundetektion von zellulären oder Kern Epitope durch schlechte Penetration der Reagenzien innerhalb der Pflanzenzelle und Einzelzellenabbildungs ​​beeinträchtigt wird durch den Mangel an optischer Klarheit in whole-mount Gewebe demised.

So eine effiziente Methode, um die nucl analysieren entwickelten wirOhr Organisation und Chromatin-Modifikation bei hoher Auflösung von Einzelzell ganz-Mount eingebettet Arabidopsis Samenanlagen. Es ist auf Dissektion und Einbettung von festen Eizellen in einer dünnen Schicht aus Acrylamid-Gel auf einen Objektträger beruht. Die Samenanlagen eingebettet werden, um chemische und enzymatische Behandlungen zur Verbesserung der Gewebe Klarheit und Durchlässigkeit für die Immunfärbung Reagenzien unterzogen. Diese Behandlungen erhalten zellulären und Chromatin-Organisation, DNA-und Protein-Epitope. Die Proben können für unterschiedliche nachgeschaltete zytologische Analysen einschließlich Chromatin Immunfärbung, Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH), und DNA-Färbung für Heterochromatin Analyse verwendet werden. Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) Bildgebung mit hoher Auflösung, gefolgt von 3D-Rekonstruktion erlaubt eine quantitative Messungen an Einzelzellauflösung.

Introduction

In blühenden Pflanzen, die Einrichtung von Fortpflanzungslinien beginnt mit der Differenzierung von SMC, MMC weiblichen und männlichen Pollenmutterzelle. Die MMC entwickelt sich aus einer Unter nucellar epidermalen Zelle an der distalen Spitze der Samenanlage primordium und die Pollenmutterzellen entwickelt von sporenbildenden Gewebes in der Anthere locule, die tief in den Blütenorganen ¹ angeordnet sind. SMCs Meiose haploide Sporen, die dann führen zu den Gametophyten bei der Mitose zu produzieren. Der weibliche Gametophyt oder Embryosack, besteht aus einer Eizelle, einer Zentralzelle, zwei und drei Synergiden antipodals. Der männliche Gametophyt oder Pol....

Protocol

Das Verfahren wird im Arbeitsablauf in Fig. 1 beschrieben, und die Einrichtung für die Präparation und Einbetten von Geweben sind in Figur 2 dargestellt.

1. Gewebefixierung

1. Sammeln 20-30 Fruchtblätter in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit frisch gemacht BVO Fixierungspuffer auf Eis.
2. Fix das Gewebe 30 min unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur.
3. Drehen Sie die Rohre, die die Fruchtblätter in Fixiermittel in einer Tischmikrozentrifuge 1 min bei 400 x g.
4. Entfernen Sie vorsichtig die Fixierungspuffer und 1 ml PBT, legen Sie die Röhrchen auf Eis.

Results

Wir bieten eine robuste Protokoll für die großtechnische Herstellung und Verarbeitung von Arabidopsis Samenanlagen geeignet für zytologische Färbung ganz-mount. Durch die Einbettung sind die Samenanlagen behalten eine 3-dimensionale Struktur (Fig. 3). Darüber hinaus ist die Gewebeverarbeitung einschließlich der optischen Klärung ermöglicht die Abbildung subzellulärer Strukturen mit hoher Auflösung. Abbildung 4 zeigt DNA-Färbung in whole-mount Eizelle Primordia wo Heterochromati.......

Discussion

In blühenden Pflanzen wird die weiblichen Fortpflanzungs Abstammung von mehreren Zellschichten einschließlich der Nucellus der Samenanlage und teguments umgeben, damit Rendering zytologische Färbung in whole-mount technisch anspruchsvoll. Hier stellen wir eine effiziente Protokoll ermöglicht die Erstellung und Bearbeitung einer großen Anzahl von Eizellen geeignet für zytologische Färbung wie Immunfärbung, DNA-Färbung und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung ganz-mount. Wir erfolgreich verwendet sie für die Analys.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lösungen
BVO Fixierungspuffer (basierend auf32)			2 mM EGTA, pH 7,5, 1 % (v/v) Formaldehyd, 10 % DMSO, 1x PBS, 0,1 % Tween-20
PBT			1x PBS, 0,1 % Tween-20
PBT-F			1x PBT, 2,5 % (v/v) Formaldehyd
30 % Acrylamid:Bisacrylamid			3 g Acrylamid, 0,33 g Bisacrylamid, 1x PBS (10 ml zubereiten, bei 4 & deg; C)
200 ml 5% Acrylamid-Mischung in PBS			34 ml 30% Acrylamid:Bisacrylamid, 166 ml 1x PBS (frisch aus 30% Bestand herstellen)
20% Ammoniumpersulfte			0,2 g Ammoniumpersulfte, 1 ml steriles Wasser (Aliquots mit 1 ml herstellen und bei -20 & deg lagern; C)
20% Natriumsulfit			0,2 g Natriumsulfit, 1 ml steriles Wasser (Aliquote mit 1 ml zubereiten und bei -20 & deg lagern; C)
Zellwand-Enzymmischung			0,5 % (w/v) Cellulase, 1 % (w/v) Driselase, 0,5 % (w/v) Pektoliase
Reagenzien und Materialien
Formaldehyd	Sigma-Aldrich	F1635
DMSO	Sigma	D5879
Tris	Amaresco	0497
Ethanol	Schaurlau	ET00102500
Methanol	Schaurlau	ME03062500
Xylol	ROTH	4436.1
Cellulase	Sigma	1794
Driselase	Sigma	D8037
Pektoliase	Sigma	P5936
Tween-20	Merck	8.22184.0500
EGTA	Sigma	E-4378
Acrylamid	Sigma	A-3553
Bisacrylamid	Sigma	M2022	giftiges
Ammoniumpersulfat	Sigma	A9164
Natriumsulfit	Fluka	71988
Anti-Trimethyl-Histon H3 (Lys4)	Upstate	07-473
Anti-Monomethyl-Histon H3 (Lys27)	Upstate	07-448
Alexa Fluor 488~ziege ~anti ~Kaninchen (H+L)	Molekulare Sonde	A11008
ProlongGold	Invitrogen	P36934
Propidiumiodid	Sigma	P4170	toxisches
	DAPI Sigma	D9542	toxische
RNAse A	Roche	10109169001
Coplin Glas	Huber & CO	10.055
Pinzette	DUMONT BIOLOGY
Schüttler	Heidolph	543-12310-00-0
Feuchtkammer			In die Box wird eine Kunststoffbox mit einem feuchten Papiertuch eingelegt, in die eine Kunststoffstütze eingelegt wird, um die Objektträger abzustützen und die Objektträger vom Wasser fernzuhalten.
Superfrost Plus Rutsche	Thermo Fisher J1800AMNZ		Menzel-Glä ser
FISH Tag DNA KIt	Invitrogen	F32947
GFP Booster	Chromotek