Quantifizierung der Mikrogefäßdurchlässigkeit im Einzel isolierten Blutdurchbluteten Lungen Rat Vorbereitung

Summary

Die isolierten durchbluteten Lungenpräparat macht es möglich, Mikrogefäßnetzwerken auf der Lungenoberfläche zu visualisieren. Hier beschreiben wir einen Ansatz zur Durchlässigkeit der einzelnen Mikrogefäße in isolierten Lungen quantifizieren mit Echtzeit-Fluoreszenz-Bildgebung.

Abstract

Die isolierten durchbluteten Lungenpräparat ist weit verbreitet, zu visualisieren und zu definieren Signalisierung in einzelnen Mikrogefäßen. Durch Kopplung dieser Zubereitung mit Echtzeit-Bildgebung, wird es möglich, Veränderungen der Durchlässigkeit der einzelnen Lungenmikrogefäßen zu bestimmen. Hier beschreiben wir Schritte, um Rattenlungen isolieren und durchströmen sie mit Eigenblut. Dann skizzieren wir Schritte, um Fluorophore oder Agenten über einen Mikrokatheter in eine kleine Lungenbereich ziehen lassen. Mit diesen beschriebenen Verfahren haben wir festgestellt Lässigkeit erhöht in Rattenlunge Mikrogefäße als Reaktion auf Infusionen von bakteriellen Lipopolysaccharide. Die Daten zeigten, dass Lipopolysaccharid erhöhte Flüssigkeitsleck über beide venulären und Kapillar-Mikrogefäßsegmente. Somit macht es dieses Verfahren möglich, die Durchlässigkeit Reaktionen unter Gefäßsegmente zu vergleichen und definieren keine Heterogenität in der Antwort. Während häufigsten verwendeten Methoden, um Lungendurchlässigkeit definieren erfordern Nachbearbeitung von Lungengewebeproben, dieVerwendung von Echtzeit-Bildgebung entfällt diese Anforderung aus dem vorliegenden Verfahren als deutlich. So bietet die isolierte Lungenpräparat kombiniert mit Echtzeit-Bildgebung mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden der Lungenmikrovaskuläre Permeabilität zu bestimmen, noch ist eine einfache Methode zu entwickeln und umzusetzen.

Introduction

Erhöhte mikrovaskuläre Permeabilität in der Lunge führt zu einer Entwicklung der alveolären Ödem und beeinträchtigt den Gasaustausch und ist ein wesentliches Merkmal des akuten Lungenversagens (ALI) ^03.01. Somit sind die Schätzungen der vaskulären Permeabilität bei der Festlegung des Umfangs der Lungenschädigung und die Wirksamkeit der vorgeschlagenen therapeutischen Maßnahmen wichtig. Gravimetrische Analyse wie Blut kostenlos Lungen nass-Trocken-Verhältnis und mikrovaskulären Filtrationskoeffizient sind weit verbreitete Methoden, die Durchlässigkeit ^4,5 schätzen. Andere Methoden umfassen die Quantifizierung der Retention von radioaktiven oder f....

Protocol

Alle Versuche an Tieren durchgeführt wurden, wie durch die Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of Tennessee Health Science Center genehmigt.

1. Schläuche zur Perfusion Rattenlunge Vorbereitungen

1. Bereiten Sie ein Schlauchsystem mit Tygon-Schlauch (# 18) für die Durchblutung, wie in Abbildung 1 dargestellt. Verbinden Druckwandler (P23XL) und legen Sie den Schlauch auf dem Mikroskoptisch.
2. Eingestellt Wasserbadtemperatur auf 37 ° C
3. Schließen Sie die Lunge und Austritts vorübergehend mit Tygon-Schlauch.

Results

Isoliertes bluteten Lungen Zubereitung der Infusionsschlauch und zugehörige Ausrüstung verbunden ist, in Fig. 2 gezeigt. Zu Demonstrationszwecken verwendeten wir eine Sprague-Dawley-Ratten, obwohl die hierin beschriebenen Verfahren können mit beliebigen Spezies Ratte verwendet werden. Infusionen über einen linksatrialen Mikro erreichen nur einen kleinen Bereich der Lunge. Das aufgegossene Region kann durch die Infusion induzierte Verfärbung (Fig. 3) identifiziert werden. Die Lunge Zuber.......

Discussion

Die isolierten durchbluteten Lungenpräparat in Verbindung mit Echtzeit-Bildgebung liefert ein einfaches Tool zur Bestimmung der Durchlässigkeit Veränderungen in einzelnen Mikrogefäßen der Lunge. Diese Methode wurde die Durchlässigkeit sich in Reaktion auf Infusionen von LPS zu definieren. Unsere Daten legen nahe, dass deutlich LPS-Infusion verursacht einen Anstieg der mikrovaskulären Durchlässigkeit. Ferner können die Daten auch, dass Veränderungen der Durchlässigkeit durch LPS induzierten waren in beiden Venen und Kapi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tygon Tubing	Fisher Scientific		#18
Druckmessumformer	Data Sciences International	P23XL	Benötigte Menge 3
Butterfly Needle	Greiner Bio-One	450081	21 G
Schlauchpumpe	Cole Parmer	Masterflex L/S
PE-90 Schlauch	Becton Dickinson	427421	30 cm benötigt
PE-10 Schlauch	Becton Dickinson	427401	40 cm benötigt
Spritzenpumpe	Braintree Scientific	BS8000
O-Ring			Sonderanfertigung mit einem 20 mm Durchmesser Loch und einem Griff zur Befestigung des O-Rings an der Halterung
Aufrechte Fluoreszenzmikroskop	Olympus America	BX61WI
Bilderfassungssoftware	Molekulare Geräte	Metamorph
FITC Dextran 20KD	Sigma Aldrich		0,5 mg/ml (Es kann ein Dextran mit unterschiedlicher Molekülgröße ausgewählt werden, wenn Versuchsexperimente auf der Grundlage der berechneten Permeabilitätsindexwerte auf seine Eignung hinweisen)
Lipopolysaccharid	Sigma Aldrich		Serotyp 0111:B4