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Methodenartikel

Automatisierte Analyse von dynamischen Ca

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DOI:

10.3791/51560

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16. Juni 2014

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Department of Physiology, University of South Alabama

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier ein neuer Bereich von Interesse Analyseprotokoll auf Basis von Sortier Best-Fit-Ellipsen zu Regionen positives Signal innerhalb von zwei-dimensionalen Zeitbild Zeitraffer-Sequenzen zugeordnet wird demonstriert. Dieser Algorithmus kann Forschern ermöglichen, umfassend zu analysieren physiologischen Ca 2 +-Signale mit minimalen Benutzereingaben und Bias.

Zusammenfassung

Intrazelluläre Ca 2 +-Signale sind allgemein mit fluoreszierenden Ca 2 +-Indikatorfarbstoffe, und Mikroskopie-Techniken untersucht. Ist die quantitative Analyse von Ca 2 +-Bilddaten jedoch zeitaufwendig und je nach Vorspannung. Automatisierte Signalanalyse-Algorithmen basieren auf Region von Interesse (ROI) Detektion wurden für eindimensionale Zeilen Messungen durchgeführt worden, aber es gibt keine aktuelle Algorithmus optimiert die Identifizierung und Analyse von ROIs in zweidimensionale Bildsequenzen integriert. Hier wird ein Algorithmus für die schnelle Erfassung und Analyse von ROIs in Bildfolgen beschrieben. Es nutzt Ellipsen passen Rauschen gefilterten Signale, um eine optimale Platzierung ROI zu ermitteln, und berechnet Ca 2 +-Signalparameter der Amplitude, Dauer und räumliche Ausbreitung. Dieser Algorithmus wurde als frei verfügbare Software-Plugin für ImageJ (NIH) durchgeführt. Zusammen mit der Analyse Skripte für die Open-Source-Software R statistische Verarbeitung geschrieben,Dieser Ansatz bietet eine Hochleistungs-Pipeline für die Durchführung schnelle statistische Analyse der experimentellen ausgegeben. Die Autoren schlagen vor, dass die Verwendung dieser Analyseprotokoll wird zu einem vollständigen und unvoreingenommene Charakterisierung der physiologischen Ca 2 +-Signal führen.

Einleitung

Ca 2 + ist ein allgegenwärtiges Signalmolekül second messenger und zytosolischen Ca 2 +-Spiegel sind stark reguliert. Die intrazelluläre Ca2 +-Signale sind komplex und umfassen isolierten Transienten, Schwingungen, Wellen-und Pflanzgut 1-4. Räumliche und zeitliche Steuerung von Ca 2 + wird gedacht, um physiologische Signal Spezifität zugrunde liegen und damit die Analyse von Ca 2 +-Signalmuster ist von großem Interesse für die Ermittler in mehreren Feldern fünf.

Ca 2 +-Indikator-Farbstoffe, wie Fluo-4 und Fura-2 werden üblicherweise verwendet, um intrazelluläre Ca 2 +-Signale mit Fluoreszenzmikroskopie 5-12 messen. 16 - typischerweise werden zeitliche Ca 2 +-Signale als zeitabhängige Änderung der mittleren Fluoreszenz innerhalb einer benutzerdefinierten Bereich oder Region von Interesse (ROI) 5,6,13 ausgewertet. Derzeit ist die manuelle ROI-Analyse sowohl zeitaufwendig und arbeits inSpannender, weil es erfordert, dass Benutzer viele ROIs identifizieren und sich wiederholende Berechnungen 17-19. Diese Techniken können auch mit erheblichen Benutzerfehler, einschließlich Einführung der künstlichen Signalarten und den Ausschluss von niedriger Amplitude oder diffuse Signale 18,20.

Automatisierte ROI Erkennungsalgorithmen sind zuvor unter Verwendung einer Vielzahl von statistischen Methoden, um eine optimale Platzierung ROI ermitteln implementiert worden, aber sie haben im Allgemeinen eine Analyse der Zeilen oder Pseudo-Zeilenbilder, die Analyse auf eine einzige räumliche Dimension in der Zeit 17 begrenzt begrenzt, 19-22. Darüber hinaus sind viele bestehende Algorithmen nicht aus, um die Vielfalt der Ca 2 +-Freisetzung aus Ereignissen, die periodisch, lokalisierten Transienten ausbreitende Wellen 23,24 Bereich umfassen. Umfassende Bewertung der physiologischen Ca2 +-Signale wird oft durch die Anwesenheit von signifikanten Bild Artif komplizierthandeln, dass verwechselt Signal-Rausch-Diskriminierung in vielen experimentellen Systemen.

Zuvor eine automatisierte ROI-Erkennungsalgorithmus Lösung Ca 2 +-Signal Transientenerkennung, als Plugin für NIH ImageJ Software implementiert (National Institutes of Health, Bethesda, MD), wurde entwickelt und validiert 25,26. Dieser Algorithmus, genannt LC_Pro, wurde entwickelt, um zu erkennen und zu analysieren ROIs umfassenden Ca 2 +-Signal-Transienten in zweidimensionalen Zeitraffer-Bildsequenzen. Hier eine praktische Versuchsprotokoll und repräsentative Demonstration einer Anwendung des Algorithmus in Schweineherzkranzarterie Endothel vorgesehen ist, mit zusätzlichen Postprocessing mit der Open-Source-Software R statistische Verarbeitung zu brauchbaren grafischen Ausgabe zu erzeugen.

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Protokoll

1. Fahrzeug Dissection und Imaging

  1. Ernte-Gewebe aus heimischen Jugend Schweine wie in Martens et al 27 beschrieben. Zeigen geerntet Schweine rechten Herzkammer in ein Polydimethylsiloxan (PDMS) unten Dissektion Schale mit HEPES-gepufferte physiologische Kochsalzlösung (PSS).
    1. Mit Hilfe eines Stereomikroskops, sezieren und entfernen ein Segment des linken vorderen absteigenden Koronararterie (~ 8 mm Länge, 0,5 mm Durchmesser) vom umgebenden Gewebe mit einer Pinzette und Schere Frühjahr durch die Gefäßsegment Entfernen aus den umliegenden Herzgewebeschichten. HINWEIS: Achten Sie auf die Gefäßwand nicht durchstechen.
    2. Legen Sie ein PDMS-Block (1 x 0,5 x 0,5 cm) in die Dissektion Gericht, und verwenden Sie eine Nadel, um es auf den Boden zu fixieren. Schneiden Sie ein etwa 40 Mikrometer Durchmesser Wolframdraht in zwölf ~ 0,3 cm lange Segmente bilden Mikropins, und diese in die Schüssel. Mit einer Pinzette, sichern eine Ende des Gefäßsegments zu dem Block mit einem micropin.
    3. Kleine Feder Schere vorsichtig in das Gefäßlumen und längs geschnitten auf einer Seite des Schiffes, um es vollständig zu öffnen. Richten Sie die geöffnet Gefäßsegment mit dem Endothel auf.
    4. Verwenden Sie die restlichen Mikropins, um die Grenzen des geöffneten Gefäßsegment zu sichern, um zu blockieren, so dass das Schiff bildet ein flaches Rechteck. HINWEIS: Mikropinlösung Spitzen sollten bis 90 ° gebogen und bündig mit der Blockoberfläche eingesetzt werden. Es sollte darauf geachtet werden, um das Schiff Zubereitung ohne Überdehnung strecken; endgültige Breite sollte ~ 1,5 Mal die Start ungedehnten Breite werden.
    5. Bereiten ein kleines Volumen (ca. 1 ml) von Fluo-4.00 Beladungslösung durch Mischen von Fluo-4 AM (10 &mgr; M), gelöst in DMSO mit Pluronic (0,03%) in einer HEPES-gepufferten PSS (enthaltend in mM: 134 NaCl, KCl 6 , 1 MgCl, 10 HEPES, 10 Glucose) und stecken Sie den ganzen Block in die Ladelösung für etwa 40 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit.
    6. Nach dem Laden, waschen Sie den Block in HEPES gepuffertPSS für 5-10 min.
    7. Montieren Sie den Block auf 50-100 um dicken Abstandshalter in einem Deckglas untere Kammer enthält HEPES gepuffert PSS. HINWEIS: Metallstifte können als Abstandhalter verwendet werden, und sicherzustellen, dass das Gefäßsegment nach unten und in die Abstandshalter nicht berühren.
    8. Setzen Sie die Kammer auf der Stufe eines inversen Mikroskops für die konfokale Bildgebung ausgestattet ist, und sich auf die endotheliale Zellschicht.
    9. Capture-Zeitbild Zeitraffer-Sequenzen der basalen relativen Fluoreszenz für ~ 3 min bei 20-facher Vergrößerung und einer Bildrate von ~ 8 Bilder pro Sekunde mit der konfokalen Bildsequenzerfassung Software.
    10. Nach ca. 3 Min. Aufzeichnungs basale Fluoreszenz, ersetzen HEPES gepuffert PSS-Lösung mit dem gleichen Volumen (~ 1 ml) von Substanz P (100 pM) in HEPES gepuffert PSS und Rekord für eine addtional 3 min.

2. Automatisierte Analyse

  1. Render-Bild-Sequenz (en) von fluoreszierenden Kalzium-Aktivität aus konfokalen Erfassungssoftware als 8-Bit-, grayscale. "tif"-Format-Dateien ohne angelegte Informations.
  2. Offene ImageJ, klicken Sie auf "Öffnen" im Datei-Menü, und wählen Sie die entsprechende Bildsequenz in der Explorer-Fenster, um die Bildsequenz (en) in ImageJ anzuzeigen.
  3. Bestimmen Sie einen entsprechenden ROI Durchmesser mit Hilfe der rechteckige ROI-Tool, um die oberen und unteren Grenzen der räumlichen Ausbreitung der Aktivität innerhalb der Bildsequenz (en) zu schätzen. HINWEIS: Die mittlere rechteckige Durchmesser ist die richtige Wahl für ROI Durchmesser.
  4. Erstellen Sie einen neuen Ordner auf der Festplatte des Computers, und fügen Sie die Bildsequenz (en) in den Ordner-Verzeichnis.
  5. In ImageJ, klicken Sie auf das Fenster "Plugins", dann klicken Sie auf "LC_Pro ', um die Analyse zu starten.
  6. Geben Sie den Durchmesserwert ROI und wählen Sie den Filter Schwellenwert (entweder 0,05 oder 0,01).
  7. Klicken Sie auf die "Drogenbehandlung" Kästchen und unmittelbar vor und nach der Droge wurde hinzugefügt (in Sekunden) in die Zeitpunktwerte.
  8. Klicken Sie auf "OK", undgeben Sie die Bildsequenz-Verzeichnis in den Datei-Explorer-Fenster.

3. Grafische Ausgabe

  1. Laden R-Version 3.0.2 von http://www.r-project.org/ .
  2. Öffnen Sie die 32-Bit-Version von R.
  3. Klicken Sie auf "Datei", dann "Open Skript" und wählen Sie die 'traceplot.R "R-Skript zur Erzeugung grafischer Versuchsberichte.
  4. Installieren Sie die Kalibrierung, und gplots Pakete mit 'Pakete', 'Installieren von Paketen ", und die Auswahl der zweckdienlichen Pakete.
  5. Klicken Sie auf "Datei", dann "change directory"-Befehl, und verwenden Sie das Explorer-Fenster auf das Verzeichnis, das auf die Analyse LC_Pro Ausgang entspricht wählen.
  6. Klicken Sie auf das Skript-Fenster und dann die 'laufen alle "zu befehlen, das Skript auszuführen.

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Ergebnisse

Eine benutzerdefinierte Algorithmus, LC_Pro, wurde entwickelt und umgesetzt, um die automatisierte Analyse von Ca 2 + durchführen Dynamik auf konfokalen Bildsequenzen. Wie in Abbildung 1 dargestellt ist, nutzt sequentielle Verarbeitungsmodule, die A) erkennen und von dynamischen Websites Spur Ca 2 + der Algorithmus ändern statistischen oben (p <0,01) Lärm, B) definieren Regionen von Interesse (ROI) automatisch am aktiven Zentrum Zentren und C) Berechnen Sie die durchschnittliche...

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Diskussion

Die Entschlüsselung komplexer Ca 2 +-Signale auf zellulärer Ebene und mehrzelligen strengen experimentellen und analytischen Ansätze erfordern. Hier wird ein Ansatz beschrieben, bei dem zeitaufgelöste konfokale Bildsequenzen von Ca 2 +-abhängige Fluoreszenz an einer automatisierten Analyse identifiziert und quantifiziert statistisch relevanten Ca2 +-Signale in intakten Zellfelder Im speziellen Fall dargestellt unterworfen, wurde isoliert eine Arterie Segment aus Schweineherz, merken geöf...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde zum Teil von der National Institutes of Health unterstützt Grants HL-085887, HL-092992, S10RR027535 und MOP-93676.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
SezierschaleFisher Sci#08-772-70
Polydimethylsiloxan (PDMS)Fisher Sci#NC9644388Elastomer-Kit, muss in Schalen eingegossen werden
HEPES-gepuffert PSSSigma#H3375-250GHEPES säure
StereomikroskopNikon Inst.
PinzetteFine Science Tools#11223-20
FederschereFine Science Tools15003-08
WolframdrahtScientific Inst Svcs#406
Fluo-4AM Life Tech.#F-14201
Pluronic F-127Life Tech.
MetallstifteFine Science Tools#26002-10
Deckglas-BodenkammerSpeziell entwickeltes
konfokales Spinning-Disc-MikroskopPerkin ElmerRS-3
ImageJ Softwaredownload bei: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro Plugin für imageJdownload unter: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R softwaredownload unter: http://www.r-project.org/
R traceplot scriptdownload unter: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing
#MNA42000#P3000MP

Referenzen

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  26. Taylor, M. S., et al. Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium. Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).
  27. Martens, C. J., et al. Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).

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