Verfahren zur Gewinnung von Primäreierstockkrebszellen von Solid Proben

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt eine detaillierte Methode zur Isolierung und Charakterisierung von primären Eierstockkrebszellen aus soliden klinischen Proben. Eierstockkrebs klinischen Proben werden enzymatische Verdauung unterzogen, um lebensfähig, Fibroblasten frei epithelialen Eierstockkrebs (EOC) Zellen sehr gut für Downstream-Anwendungen zu erhalten.

Zusammenfassung

Zuverlässige Werkzeuge für die Untersuchung von Eierstockkrebs Initiierung und Progression sind dringend erforderlich. Während die Verwendung von Eierstock-Krebszelllinien bleibt ein wertvolles Werkzeug für das Verständnis von Eierstock-Krebs hat ihr Einsatz viele Einschränkungen. Dazu gehören der Mangel an Heterogenität und die Fülle von genetischen Veränderungen mit erweiterten In-vitro-Passage verbunden. Hier beschreiben wir eine Methode, die für eine schnelle Einrichtung der primären Eierstockkrebszellen bilden können feste klinischen Proben zum Zeitpunkt der Operation gesammelt. Das Verfahren besteht aus der klinischen Proben zur enzymatischen Verdau für 30 min. Die isolierten Zellsuspension wird erlaubt, zu wachsen und kann für Folgeanwendungen einschließlich Arzneimittel-Screening verwendet werden. Der Vorteil der primären Eierstockkrebszelllinien gegenüber etablierten Eierstock-Krebszelllinien ist, dass sie repräsentativ für die ursprünglichen spezifischen klinischen Proben sie von abgeleitet und kann von verschiedenen Stellen abgeleitet werden, ob es primary oder metastasierenden Eierstockkrebs.

Einleitung

Trotz seiner relativ geringen Inzidenz, Eierstockkrebs ist die tödlichste der gynäkologischen Krankheiten und die fünfthäufigste Ursache für Todesfälle durch Krebs bei Frauen ^1,2. Dies ist vor allem auf den Mangel an zuverlässigen Tools und Modelle, die treu zu rekapitulieren die Initiierung und Progression der Erkrankung ^3. Die meisten unserer heutigen Wissen über Eierstockkrebs wurde durch die Verwendung von Eierstock verewigt Oberfläche Epithelzellen (IOSen), Eierstockkrebs-Zelllinien und primären Eierstockkrebszellen aus Aszites ^4-7 gewonnen möglich. Leider hat die Verwendung mehrere Einschränkungen, einschließlich einer Reihe von genetischen und phänotypischen Änderungen Immortalisierung Verfahren oder in vitro-Durchgänge zugeordnet ist, und die Heterogenität der Population von Aszitesflüssigkeit Herstellung resultieren.

Daher primären Eierstockkrebszellen aus identifizierbaren und spezifischen festen Proben von Eierstockkrebs abgeleitet sind eine unique Werkzeug für die Untersuchung Eierstockkrebs Progression.

Die Hauptschwierigkeiten in den Erhalt dieser bösartigen Zellen beteiligt sind auf ein übermäßiges Wachstum von Stromazellen oder Fibroblasten mit Verlust der Lebensfähigkeit und vorzeitige fehlende Proliferationskapazität in der Kultur dieser Zellen EOC. Verschiedene Methoden zur Einzelzellsuspensionen aus soliden Tumoren zu erstellen derzeit existiert, durch mechanische Mittel oder enzymatische Dissoziation jedoch bestimmte Techniken ergeben eine größere Menge des bevorzugten Ergebnis ^8. Hier zeigen wir, dass die enzymatische Verdauung mit Dispase II führt zu einer effektiven Wiederherstellung lebensfähiger, Fibroblasten frei EOC-Zellen. Die so erhaltenen Kulturen EOC sind sehr anfällig für genetische Manipulation und sind in Arzneimittel-Screening-Tests, was anzeigt, dass diese EOC Kulturen sind für viele Anwendungen abwärts.

Protokoll

Ethikerklärung
Feste Proben von Eierstockkrebs wurden von der Universität von Minnesota Tissue Beschaffung Facility (TPF) nach Institutional Review Board Committee erhalten: Human Betreff Board (IRB)-Zulassung.

1. Reagenz-Setup

1. Vorbereitung komplettem DMEM Medium durch Hinzu DMEM mit 10% FBS und 100 Einheiten Penicillin-Streptomycin. Speichert das Medium bei 4 ° C und warm auf 37 ° C vor der Verwendung.
2. Aliquot Dispase II in separate Bände 5-10 ml mehreren Gefrier vermeiden taut und bei -20 ° C in einem nonfrost freien Gefrierschrank.

2. Gewebeentnahme

1. Sammeln feste Proben von Eierstockkrebs (~ 5 g in Größe) zum Zeitpunkt der Operation makroskopisch aus Bereichen wie Krebs von einem Pathologen identifiziert. Klinische Proben werden anonymisiert und nach institutionellen Protokolle eingetragen.
2. Zeigen Proben in einem sterilen, screw Deckel, Polypropylen Proben Behälter mit 30 ml eiskaltem PBS gefüllt. Transport der Proben von der chirurgischen Pathologie Labor in die Forschungslabor für die Verarbeitung auf Eis, und innerhalb von 30 Minuten von der Probenentnahme (Abbildung 1).

3. Gewebeverarbeitung

1. Arbeiten unter sterilen Bedingungen, übertragen Sie die Proben auf einer Petrischale (60 mm x 60 mm) mit 10 ml frischem, eiskaltem PBS und mit einer sterilen Rasierklinge, weiter in die kleinstmögliche (2 mm oder weniger) Stücke geschnitten ( Figuren 2A und 2B).
2. Das zerkleinerte Gewebe übertragen in einen 15 ml konischen Röhrchen mit 10 ml vorgewärmtem (37 ° C für 30 min) Dispase II (2,4 U / ml) in DMEM und Inkubation bei 5% CO ₂ und 37 ° C für 30 min. Um eine optimale Verdauung der Proben zu gewährleisten, schüttelt die Hand Zellaufschlämmung alle 5 min.
3. Nach 30 min Inkubation Übertragung (mit10 ml serologische Pipette) die Zelle Aufschlämmung auf eine Zelle Sieb (70 um Maschenweite) auf einem konischen 50 ml-Röhrchen gegeben und Anwendung eines leichten Druck gegen das Gitter unter Verwendung eines Spritzenkolbens. Verwerfen undissoziierter Gewebe (noch auf der Oberseite des Mesh) und sammeln Sie die erhaltene Zellsuspension in der 50 ml konischen Röhrchen steril. Zentrifuge bei 320 × g für 7 min bei 4 ° C (Fig. 3).
4. Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in 10 ml DMEM mit 10% FBS.
5. Inkubieren der Zellsuspension in einer Petrischale mit 5% CO ₂ und 37 ° C (Fig. 4).
6. Ändern Sie das Medium nach 24 Stunden von der ersten Beschichtung. Dies ermöglicht die Entfernung der Zelltrümmer und die Mehrzahl der in der Kultur anwesend Erythrozyten.
7. Ändern Sie das Medium alle drei Tage für die folgenden zwei Wochen, nach der die Kulturen von primären EOC sind bereit für Downstream-Anwendungen.

Ergebnisse

Frische klinischen Proben von Eierstockkrebs werden nach der Operation gesammelt (Abbildung 1) und in kleine Stücke (2A und 2B), die Zellaufschlämmung bilden geschnitten. Dies erlaubt eine optimale Belichtung der Proben in der enzymatischen Behandlung. Zelle Aufschlämmung einer enzymatischen Verdauung ausgesetzt und bei 37 ° C für 30 min inkubiert. Während der Inkubationszeit der Schlamm wird zunehmend bewölkt (vor allem nach jeder Bewegung), und dies ist ein Zeichen de...

Diskussion

Ein besseres Verständnis der Ätiologie und Eierstockkrebs-Entwicklung ist entscheidend für die Verbesserung der Ergebnisse der Frauen, die von dieser schweren Krankheit betroffen. In diesem Zusammenhang ist der Einsatz von etablierten und "handelsüblichen" Eierstockkrebs-Zelllinie ist zweifellos enorm nützlich. Doch heute wissen wir, dass Krebszelllinien sind nicht repräsentativ für den menschlichen Tumor sie aus in viele Aspekte, einschließlich der Mangel an Heterogenität ^9,10 entstanden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1x PBS, steril	Invitrogen	14190-144
Schraubdeckel, Probenbehälter aus Polypropylen, steril	Thermo Scientific	02 1090
DMEM-Medium, steril	Invitrogen	11995-065
Fötales Rinderserum, steril	Thermo Scientific Hyclone	SH30396.03
100x Penicillin-Streptomycin, flüssig	Invitrogen	15140-122
Dispase II, steril	Roche	04942 078 001
Kleine Pinzette mit feiner Spitze und Skalpellklinge, steril	Fisher Scientific	Pinzette: 08-953E, Klingen: 08-927-5D
Kleine Präparierschere, steril	Fisher Scientific	08-945
15 ml Röhrchen mit konischem Deckel, steril	BD Falcon	352097
50 ml Röhrchen mit konischem Deckel, steril	BD Falcon	352027
10 ml Serologische Pipette, steril	Corning	13-678-11E
6 ml Spritzenkolben, steril	Tyco Healthcare	8881516911
Nylonfilter (70 μ m ) Zellsieb, steril	BD Falcon	352350
5 cm Petrischale, steril	Corning	430166
10 cm Petrischale, steril	Corning	430167