Verfahren zur Gewinnung von Primäreierstockkrebszellen von Solid Proben

Trotz seiner relativ geringen Inzidenz, Eierstockkrebs ist die tödlichste der gynäkologischen Krankheiten und die fünfthäufigste Ursache für Todesfälle durch Krebs bei Frauen ^1,2. Dies ist vor allem auf den Mangel an zuverlässigen Tools und Modelle, die treu zu rekapitulieren die Initiierung und Progression der Erkrankung ^3. Die meisten unserer heutigen Wissen über Eierstockkrebs wurde durch die Verwendung von Eierstock verewigt Oberfläche Epithelzellen (IOSen), Eierstockkrebs-Zelllinien und primären Eierstockkrebszellen aus Aszites ^4-7 gewonnen möglich. Leider hat die Verwendung mehrere Einschränkungen, einschließlich einer Reihe von genetischen und phänotypischen Änderungen Immortalisierung Verfahren oder in vitro-Durchgänge zugeordnet ist, und die Heterogenität der Population von Aszitesflüssigkeit Herstellung resultieren.

Daher primären Eierstockkrebszellen aus identifizierbaren und spezifischen festen Proben von Eierstockkrebs abgeleitet sind eine unique Werkzeug für die Untersuchung Eierstockkrebs Progression.

Die Hauptschwierigkeiten in den Erhalt dieser bösartigen Zellen beteiligt sind auf ein übermäßiges Wachstum von Stromazellen oder Fibroblasten mit Verlust der Lebensfähigkeit und vorzeitige fehlende Proliferationskapazität in der Kultur dieser Zellen EOC. Verschiedene Methoden zur Einzelzellsuspensionen aus soliden Tumoren zu erstellen derzeit existiert, durch mechanische Mittel oder enzymatische Dissoziation jedoch bestimmte Techniken ergeben eine größere Menge des bevorzugten Ergebnis ^8. Hier zeigen wir, dass die enzymatische Verdauung mit Dispase II führt zu einer effektiven Wiederherstellung lebensfähiger, Fibroblasten frei EOC-Zellen. Die so erhaltenen Kulturen EOC sind sehr anfällig für genetische Manipulation und sind in Arzneimittel-Screening-Tests, was anzeigt, dass diese EOC Kulturen sind für viele Anwendungen abwärts.

Ethikerklärung
Feste Proben von Eierstockkrebs wurden von der Universität von Minnesota Tissue Beschaffung Facility (TPF) nach Institutional Review Board Committee erhalten: Human Betreff Board (IRB)-Zulassung.

1. Reagenz-Setup

1. Vorbereitung komplettem DMEM Medium durch Hinzu DMEM mit 10% FBS und 100 Einheiten Penicillin-Streptomycin. Speichert das Medium bei 4 ° C und warm auf 37 ° C vor der Verwendung.
2. Aliquot Dispase II in separate Bände 5-10 ml mehreren Gefrier vermeiden taut und bei -20 ° C in einem nonfrost freien Gefrierschrank.

2. Gewebeentnahme

1. Sammeln feste Proben von Eierstockkrebs (~ 5 g in Größe) zum Zeitpunkt der Operation makroskopisch aus Bereichen wie Krebs von einem Pathologen identifiziert. Klinische Proben werden anonymisiert und nach institutionellen Protokolle eingetragen.
2. Zeigen Proben in einem sterilen, screw Deckel, Polypropylen Proben Behälter mit 30 ml eiskaltem PBS gefüllt. Transport der Proben von der chirurgischen Pathologie Labor in die Forschungslabor für die Verarbeitung auf Eis, und innerhalb von 30 Minuten von der Probenentnahme (Abbildung 1).

3. Gewebeverarbeitung

1. Arbeiten unter sterilen Bedingungen, übertragen Sie die Proben auf einer Petrischale (60 mm x 60 mm) mit 10 ml frischem, eiskaltem PBS und mit einer sterilen Rasierklinge, weiter in die kleinstmögliche (2 mm oder weniger) Stücke geschnitten ( Figuren 2A und 2B).
2. Das zerkleinerte Gewebe übertragen in einen 15 ml konischen Röhrchen mit 10 ml vorgewärmtem (37 ° C für 30 min) Dispase II (2,4 U / ml) in DMEM und Inkubation bei 5% CO ₂ und 37 ° C für 30 min. Um eine optimale Verdauung der Proben zu gewährleisten, schüttelt die Hand Zellaufschlämmung alle 5 min.
3. Nach 30 min Inkubation Übertragung (mit10 ml serologische Pipette) die Zelle Aufschlämmung auf eine Zelle Sieb (70 um Maschenweite) auf einem konischen 50 ml-Röhrchen gegeben und Anwendung eines leichten Druck gegen das Gitter unter Verwendung eines Spritzenkolbens. Verwerfen undissoziierter Gewebe (noch auf der Oberseite des Mesh) und sammeln Sie die erhaltene Zellsuspension in der 50 ml konischen Röhrchen steril. Zentrifuge bei 320 × g für 7 min bei 4 ° C (Fig. 3).
4. Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in 10 ml DMEM mit 10% FBS.
5. Inkubieren der Zellsuspension in einer Petrischale mit 5% CO ₂ und 37 ° C (Fig. 4).
6. Ändern Sie das Medium nach 24 Stunden von der ersten Beschichtung. Dies ermöglicht die Entfernung der Zelltrümmer und die Mehrzahl der in der Kultur anwesend Erythrozyten.
7. Ändern Sie das Medium alle drei Tage für die folgenden zwei Wochen, nach der die Kulturen von primären EOC sind bereit für Downstream-Anwendungen.

Frische klinischen Proben von Eierstockkrebs werden nach der Operation gesammelt (Abbildung 1) und in kleine Stücke (2A und 2B), die Zellaufschlämmung bilden geschnitten. Dies erlaubt eine optimale Belichtung der Proben in der enzymatischen Behandlung. Zelle Aufschlämmung einer enzymatischen Verdauung ausgesetzt und bei 37 ° C für 30 min inkubiert. Während der Inkubationszeit der Schlamm wird zunehmend bewölkt (vor allem nach jeder Bewegung), und dies ist ein Zeichen der Gewebegliederung. Am Ende der Inkubationszeit wird die Aufschlämmung auf ein Sieb überführt, um Zell EOC Zellen aus nicht-dissoziierten Gewebe (3) zu trennen. Das zurückgewonnene Zellsuspension wird bei 5% CO 2 und 37 ° C (B ild 4) angeordnet ist. In diesem Stadium der Morphologie der Zellkulturen zeigt das Vorhandensein der beiden EOC-Zellen als Einzelzellsuspension in kleinen Klumpen. Die Kultur an dieser Stelle offenbart auch die Präsentation ce von Erythrozyten und kleine Trümmer wie in Fig. 5 gezeigt. Wichtig ist, während der EOC wird langsam (über einen Zeitraum von 1-3 Tagen), um die Kunststoff-, Erythrozyten und Zelltrümmer halten will und sie schließlich und nach und nach "verschwinden aus der Kultur". Nach Tag 3 von der ersten Beschichtung, die EOC-Kulturen zeigen zunehmende haft EOC Zellhaufen und immer weniger Erythrozyten und Schmutz, wie in Abbildung 6 dargestellt. Von Tag 6-7, EOC Zellen bilden drallartige Formen (Pfeil) und beginnt, sich mit dem Kunststoff verteilt, größere mehrzelligen Aggregaten, die zu der typischen Kopfsteinpflastermorphologie EOC-Zellen, wie in 7 gezeigt, zu bilden. Am Tag 14, EOC-Zellen typischerweise konfluieren (Abbildung 8) und sind nun bereit für Downstream-Tests und Anwendungen.

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1. Sammlung von klinischen Proben. Feste Proben von Eierstock-Krebs zum Zeitpunkt der Operation gesammelt und in einer sterilen, Schraubdeckel, Polypropylen Probenbehälter mit 30 ml eiskaltem PBS gefüllt war.

2. Verarbeitung von klinischen Proben. A) Solid Probe auf eine Petrischale mit 10 ml frischem, eiskaltem 1x PBS. B übertragen) Klinische Proben weiter in Stücke von etwa 2 mm geschnitten.

4. Überzug von EOC resultierende Zellsuspension. Nach dem Entfernen von nicht-dissoziierten Gewebe, die Zellsuspension wird zentrifugiert und in 10 ml DMEM resuspendiert containing 10% FBS und in einer Petrischale mit 5% CO 2 und 37 ° C inkubiert,

5. Morphologie der Zellkulturen EOC unmittelbar nach der Verarbeitung. Zellsuspension unmittelbar nach dem Plattieren zeigt EOC als Einzelzellsuspensionen und in Büscheln (beide durch die Pfeile angedeutet), Erythrozyten und Zelltrümmer Fluss in diesem Stadium noch. Original-Vergrößerung, 20X.

Abbildung 6. Morphologie der EOC Zellkulturen am Tag 3 nach der Beschichtung. EOC Zellkultur am Tag 3 nach der Plattierung zeigt semi-adhärenten EOC cell-Cluster (durch den Pfeil angedeutet) und weniger Erythrozytenkontamination. Original-Vergrößerung, 20X.

Abbildung 7. Gegründet EOC Kulturen nach einer Woche von der Beschichtung. EOC Zellkultur eine Woche nach der ersten Beschichtung zeigt, wie Wirbel-Cluster von Zellen Ausbreitung auf der Gewebekultur-Plastik. Original-Vergrößerung, 20X.

Abbildung 8. Confluent EOC Kulturen. Confluent Monolage von EOC-Zellen, die die typische Kopfsteinpflaster epithelialen Morphologie nach 14 Tagen in der Kultur.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.