Summary
Diese Studie beschreibt eine detaillierte Methode zur Isolierung und Charakterisierung von primären Eierstockkrebszellen aus soliden klinischen Proben. Eierstockkrebs klinischen Proben werden enzymatische Verdauung unterzogen, um lebensfähig, Fibroblasten frei epithelialen Eierstockkrebs (EOC) Zellen sehr gut für Downstream-Anwendungen zu erhalten.
Abstract
Zuverlässige Werkzeuge für die Untersuchung von Eierstockkrebs Initiierung und Progression sind dringend erforderlich. Während die Verwendung von Eierstock-Krebszelllinien bleibt ein wertvolles Werkzeug für das Verständnis von Eierstock-Krebs hat ihr Einsatz viele Einschränkungen. Dazu gehören der Mangel an Heterogenität und die Fülle von genetischen Veränderungen mit erweiterten In-vitro-Passage verbunden. Hier beschreiben wir eine Methode, die für eine schnelle Einrichtung der primären Eierstockkrebszellen bilden können feste klinischen Proben zum Zeitpunkt der Operation gesammelt. Das Verfahren besteht aus der klinischen Proben zur enzymatischen Verdau für 30 min. Die isolierten Zellsuspension wird erlaubt, zu wachsen und kann für Folgeanwendungen einschließlich Arzneimittel-Screening verwendet werden. Der Vorteil der primären Eierstockkrebszelllinien gegenüber etablierten Eierstock-Krebszelllinien ist, dass sie repräsentativ für die ursprünglichen spezifischen klinischen Proben sie von abgeleitet und kann von verschiedenen Stellen abgeleitet werden, ob es primary oder metastasierenden Eierstockkrebs.
Introduction
Trotz seiner relativ geringen Inzidenz, Eierstockkrebs ist die tödlichste der gynäkologischen Krankheiten und die fünfthäufigste Ursache für Todesfälle durch Krebs bei Frauen 1,2. Dies ist vor allem auf den Mangel an zuverlässigen Tools und Modelle, die treu zu rekapitulieren die Initiierung und Progression der Erkrankung 3. Die meisten unserer heutigen Wissen über Eierstockkrebs wurde durch die Verwendung von Eierstock verewigt Oberfläche Epithelzellen (IOSen), Eierstockkrebs-Zelllinien und primären Eierstockkrebszellen aus Aszites 4-7 gewonnen möglich. Leider hat die Verwendung mehrere Einschränkungen, einschließlich einer Reihe von genetischen und phänotypischen Änderungen Immortalisierung Verfahren oder in vitro-Durchgänge zugeordnet ist, und die Heterogenität der Population von Aszitesflüssigkeit Herstellung resultieren.
Daher primären Eierstockkrebszellen aus identifizierbaren und spezifischen festen Proben von Eierstockkrebs abgeleitet sind eine unique Werkzeug für die Untersuchung Eierstockkrebs Progression.
Die Hauptschwierigkeiten in den Erhalt dieser bösartigen Zellen beteiligt sind auf ein übermäßiges Wachstum von Stromazellen oder Fibroblasten mit Verlust der Lebensfähigkeit und vorzeitige fehlende Proliferationskapazität in der Kultur dieser Zellen EOC. Verschiedene Methoden zur Einzelzellsuspensionen aus soliden Tumoren zu erstellen derzeit existiert, durch mechanische Mittel oder enzymatische Dissoziation jedoch bestimmte Techniken ergeben eine größere Menge des bevorzugten Ergebnis 8. Hier zeigen wir, dass die enzymatische Verdauung mit Dispase II führt zu einer effektiven Wiederherstellung lebensfähiger, Fibroblasten frei EOC-Zellen. Die so erhaltenen Kulturen EOC sind sehr anfällig für genetische Manipulation und sind in Arzneimittel-Screening-Tests, was anzeigt, dass diese EOC Kulturen sind für viele Anwendungen abwärts.
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Protocol
Ethikerklärung
Feste Proben von Eierstockkrebs wurden von der Universität von Minnesota Tissue Beschaffung Facility (TPF) nach Institutional Review Board Committee erhalten: Human Betreff Board (IRB)-Zulassung.
1. Reagenz-Setup
- Vorbereitung komplettem DMEM Medium durch Hinzu DMEM mit 10% FBS und 100 Einheiten Penicillin-Streptomycin. Speichert das Medium bei 4 ° C und warm auf 37 ° C vor der Verwendung.
- Aliquot Dispase II in separate Bände 5-10 ml mehreren Gefrier vermeiden taut und bei -20 ° C in einem nonfrost freien Gefrierschrank.
2. Gewebeentnahme
- Sammeln feste Proben von Eierstockkrebs (~ 5 g in Größe) zum Zeitpunkt der Operation makroskopisch aus Bereichen wie Krebs von einem Pathologen identifiziert. Klinische Proben werden anonymisiert und nach institutionellen Protokolle eingetragen.
- Zeigen Proben in einem sterilen, screw Deckel, Polypropylen Proben Behälter mit 30 ml eiskaltem PBS gefüllt. Transport der Proben von der chirurgischen Pathologie Labor in die Forschungslabor für die Verarbeitung auf Eis, und innerhalb von 30 Minuten von der Probenentnahme (Abbildung 1).
3. Gewebeverarbeitung
- Arbeiten unter sterilen Bedingungen, übertragen Sie die Proben auf einer Petrischale (60 mm x 60 mm) mit 10 ml frischem, eiskaltem PBS und mit einer sterilen Rasierklinge, weiter in die kleinstmögliche (2 mm oder weniger) Stücke geschnitten ( Figuren 2A und 2B).
- Das zerkleinerte Gewebe übertragen in einen 15 ml konischen Röhrchen mit 10 ml vorgewärmtem (37 ° C für 30 min) Dispase II (2,4 U / ml) in DMEM und Inkubation bei 5% CO 2 und 37 ° C für 30 min. Um eine optimale Verdauung der Proben zu gewährleisten, schüttelt die Hand Zellaufschlämmung alle 5 min.
- Nach 30 min Inkubation Übertragung (mit10 ml serologische Pipette) die Zelle Aufschlämmung auf eine Zelle Sieb (70 um Maschenweite) auf einem konischen 50 ml-Röhrchen gegeben und Anwendung eines leichten Druck gegen das Gitter unter Verwendung eines Spritzenkolbens. Verwerfen undissoziierter Gewebe (noch auf der Oberseite des Mesh) und sammeln Sie die erhaltene Zellsuspension in der 50 ml konischen Röhrchen steril. Zentrifuge bei 320 × g für 7 min bei 4 ° C (Fig. 3).
- Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in 10 ml DMEM mit 10% FBS.
- Inkubieren der Zellsuspension in einer Petrischale mit 5% CO 2 und 37 ° C (Fig. 4).
- Ändern Sie das Medium nach 24 Stunden von der ersten Beschichtung. Dies ermöglicht die Entfernung der Zelltrümmer und die Mehrzahl der in der Kultur anwesend Erythrozyten.
- Ändern Sie das Medium alle drei Tage für die folgenden zwei Wochen, nach der die Kulturen von primären EOC sind bereit für Downstream-Anwendungen.
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Representative Results
Frische klinischen Proben von Eierstockkrebs werden nach der Operation gesammelt (Abbildung 1) und in kleine Stücke (2A und 2B), die Zellaufschlämmung bilden geschnitten. Dies erlaubt eine optimale Belichtung der Proben in der enzymatischen Behandlung. Zelle Aufschlämmung einer enzymatischen Verdauung ausgesetzt und bei 37 ° C für 30 min inkubiert. Während der Inkubationszeit der Schlamm wird zunehmend bewölkt (vor allem nach jeder Bewegung), und dies ist ein Zeichen der Gewebegliederung. Am Ende der Inkubationszeit wird die Aufschlämmung auf ein Sieb überführt, um Zell EOC Zellen aus nicht-dissoziierten Gewebe (3) zu trennen. Das zurückgewonnene Zellsuspension wird bei 5% CO 2 und 37 ° C (B ild 4) angeordnet ist. In diesem Stadium der Morphologie der Zellkulturen zeigt das Vorhandensein der beiden EOC-Zellen als Einzelzellsuspension in kleinen Klumpen. Die Kultur an dieser Stelle offenbart auch die Präsentation ce von Erythrozyten und kleine Trümmer wie in Fig. 5 gezeigt. Wichtig ist, während der EOC wird langsam (über einen Zeitraum von 1-3 Tagen), um die Kunststoff-, Erythrozyten und Zelltrümmer halten will und sie schließlich und nach und nach "verschwinden aus der Kultur". Nach Tag 3 von der ersten Beschichtung, die EOC-Kulturen zeigen zunehmende haft EOC Zellhaufen und immer weniger Erythrozyten und Schmutz, wie in Abbildung 6 dargestellt. Von Tag 6-7, EOC Zellen bilden drallartige Formen (Pfeil) und beginnt, sich mit dem Kunststoff verteilt, größere mehrzelligen Aggregaten, die zu der typischen Kopfsteinpflastermorphologie EOC-Zellen, wie in 7 gezeigt, zu bilden. Am Tag 14, EOC-Zellen typischerweise konfluieren (Abbildung 8) und sind nun bereit für Downstream-Tests und Anwendungen.
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1. Sammlung von klinischen Proben. Feste Proben von Eierstock-Krebs zum Zeitpunkt der Operation gesammelt und in einer sterilen, Schraubdeckel, Polypropylen Probenbehälter mit 30 ml eiskaltem PBS gefüllt war.
2. Verarbeitung von klinischen Proben. A) Solid Probe auf eine Petrischale mit 10 ml frischem, eiskaltem 1x PBS. B übertragen) Klinische Proben weiter in Stücke von etwa 2 mm geschnitten.
3. Trennung von EOC-Zellen aus Geweben undissoziierten. Nach enzymatischer Verdauung werden klinische Proben auf eine Zelle Sieb übertragen und mit einem leichten Druck auf die verdauten klinischen Proben unter Verwendung einer Spritzenkolben aufgebracht. Diese ermöglichen eine mechanische Ablösung des EOC von Bindegewebe und Verwertung von EOC-Zellen.
4. Überzug von EOC resultierende Zellsuspension. Nach dem Entfernen von nicht-dissoziierten Gewebe, die Zellsuspension wird zentrifugiert und in 10 ml DMEM resuspendiert containing 10% FBS und in einer Petrischale mit 5% CO 2 und 37 ° C inkubiert,
5. Morphologie der Zellkulturen EOC unmittelbar nach der Verarbeitung. Zellsuspension unmittelbar nach dem Plattieren zeigt EOC als Einzelzellsuspensionen und in Büscheln (beide durch die Pfeile angedeutet), Erythrozyten und Zelltrümmer Fluss in diesem Stadium noch. Original-Vergrößerung, 20X.
Abbildung 6. Morphologie der EOC Zellkulturen am Tag 3 nach der Beschichtung. EOC Zellkultur am Tag 3 nach der Plattierung zeigt semi-adhärenten EOC cell-Cluster (durch den Pfeil angedeutet) und weniger Erythrozytenkontamination. Original-Vergrößerung, 20X.
Abbildung 7. Gegründet EOC Kulturen nach einer Woche von der Beschichtung. EOC Zellkultur eine Woche nach der ersten Beschichtung zeigt, wie Wirbel-Cluster von Zellen Ausbreitung auf der Gewebekultur-Plastik. Original-Vergrößerung, 20X.
Abbildung 8. Confluent EOC Kulturen. Confluent Monolage von EOC-Zellen, die die typische Kopfsteinpflaster epithelialen Morphologie nach 14 Tagen in der Kultur.
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Discussion
Ein besseres Verständnis der Ätiologie und Eierstockkrebs-Entwicklung ist entscheidend für die Verbesserung der Ergebnisse der Frauen, die von dieser schweren Krankheit betroffen. In diesem Zusammenhang ist der Einsatz von etablierten und "handelsüblichen" Eierstockkrebs-Zelllinie ist zweifellos enorm nützlich. Doch heute wissen wir, dass Krebszelllinien sind nicht repräsentativ für den menschlichen Tumor sie aus in viele Aspekte, einschließlich der Mangel an Heterogenität 9,10 entstanden.
Hier berichten wir über eine schnelle und zuverlässige Methode zur Isolation und Kultivierung von primären Eierstockkrebszellen direkt aus klinischen Proben von Eierstockkrebs in 30 min von chirurgischen Probe Isolation.
Da die Primärzellen von einer festen Probe gegen Ascites-Flüssigkeit isoliert, hat dies den Vorteil der Isolierung von Zellen aus frühen Stadien der Krankheit vor dem Zeitpunkt, Aszitesflüssigkeit Bildung auftritt. Diese Technik hat auch die advantage der Isolierung von primären Eierstockkrebszellen aus einem bestimmten Ort. Der Erfolg bei der Beschaffung lebensfähigen primären Eierstockkrebszellen unter Verwendung dieses Protokolls ist weitgehend davon abhängig, wie schnell die Probe nach der Operation verarbeitet werden. Für beste Ergebnisse sollten die Proben innerhalb von 30 Minuten von der Operation erhalten werden. Wenn dies nicht möglich ist, sollte die Probe bei 4 ° C (in PBS) über Nacht aufbewahrt und verarbeitet werden am folgenden Tag. Nach unseren Erfahrungen, die Verarbeitung von Proben nach Lagerung über Nacht sinkt die Ausbeute. Einwirkung von Dispase II länger als 30 min reduziert auch die Lebensfähigkeit der Zellen und nicht ausgeführt werden sollte. Eine Alternative zur Behandlung Dispase II kann die Behandlung mit Kollagenase oder Hyaluronidase sein. Dies führt jedoch zu einer verminderten Ausbeute 8. Aufgrund der großen Variabilität in klinischen Proben, können einige größere roten Blutzellkontamination haben im Vergleich zu anderen. Wenn das der Fall ist, empfehlen wir, "Waschen" die zerkleinerten Gewebe (Schritt3.1) mit PBS vor Aussetzen sie einem enzymatischen Verdau. Dadurch wird die Anzahl der roten Blutzellen bei der Herstellung zu verringern und schließlich die Haftung der primären Epithelzellen zu erleichtern.
Da die klinischen Proben nicht steril sind (sie Sterilität verlieren, sobald sie an der chirurgischen Pathologielabor ankommen), ist es wichtig, alle Schritte unter streng sterilen Bedingungen durchzuführen. Während die Verunreinigung der Kultur möglich ist, es in der Regel bei weniger als 10% der Fälle. Das obige Protokoll kann mit einer beliebigen Konsistenz des klinischen Probe verwendet werden.
Die Hauptbeschränkung dieses Protokolls ist, daß die Anzahl von Zellen aus jeder Probe gewonnen ist stark abhängig von der Größe der Proben vorgesehen. Größe ein typisches Exemplar ist ca. 3 cm x 3 cm. Eine weitere Einschränkung ist durch die Tatsache dargestellt, dass während primären Eierstockkrebszellen wachsen exponentiell für bis zu 10 Passagen in vitro (also Bestimding die Möglichkeit, lebensfähige Bestände zu machen) sie letztlich altern und sterben, damit die Verfügbarkeit von Zellen von einem einzelnen Spender begrenzen. Während wir keinerlei Trennung von Tumorzellen von Fibroblasten nicht durchführen, nehmen wir an, daß die relativ hoch (10%) Serumkonzentration während des gesamten Prozesses kann Eierstockkrebszellen geben einen Überlebensvorteil gegenüber Fibroblasten. Es ist auch wahrscheinlich, dass Zellen, die weniger anfällig für die Trennung von der stromalen Fach (Fibroblasten) sind nicht zerlegen und auf dem Filter während der Trennung zu bleiben.
Zellen, die mit diesem Protokoll erhalten werden, sind sehr gut geeignet für künftige Anwendungen wie Untersuchungen das Ziel, die Prozesse, die zu Eierstockkrebs Initiierung und Entwicklung zu verstehen. Zukünftige Anwendungen sind auch mit diesen Primärzellen für in vitro-und in-vivo-Tests von neuen Chemotherapeutika für Eierstockkrebs sowie Biomarker für die Früherkennung.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir möchten uns für die Unterstützung bei Patienten Gewebeproben Sammlung danke den Mitarbeitern des Tissue Beschaffungsmöglichkeiten der Universität von Minnesota. Diese Arbeit wurde durch das Department of Defense Eierstockkrebs-Forschungsprogramm (OCRP) OC093424 zu MB, die von der Randy Shaver Krebsforschung und Gemeinschaftsfonds zur MB, von der Minnesota-Eierstockkrebs-Allianz zu MB und durch die Gynäkologische Onkologie Abteilungs Fonds MB. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Zubereitung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, sterile | Invitrogen | 14190-144 | |
| Screw lid, polypropylene specimen container, sterile | Thermo Scientific | 02 1090 | |
| DMEM medium, sterile | Invitrogen | 11995-065 | |
| Fetal bovine serum, sterile | Thermo Scientific Hyclone | SH30396.03 | |
| 100x Penicillin-streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| Dispase II, sterile | Roche | 04942 078 001 | |
| Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile | Fisher Scientific | forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D | |
| Small dissecting scissors, sterile | Fisher Scientific | 08-945 | |
| 15 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352027 | |
| 10 ml Serological pipette, sterile | Corning | 13-678-11E | |
| 6 ml Syringe plunger, sterile | Tyco Healthcare | 8881516911 | |
| Nylon filter (70 μm ) cell strainer, sterile | BD Falcon | 352350 | |
| 5 cm Petri dish, sterile | Corning | 430166 | |
| 10 cm Petri dish, sterile | Corning | 430167 |
References
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