Methodenartikel

MicroRNA Expressionsprofile der Menschen iPS-Zellen, Retinapigmentepithel Abgeleitet aus iPS und Fetal Retinapigmentepithel

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DOI:

10.3791/51589

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24. Juni 2014

 ,  ,  ,  , 
1Ocular Trauma, U.S. Army Institute of Surgical Research, JBSA Fort Sam Houston

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die microRNA (miRNA)-Profile der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen), retinale Pigmentepithel (RPE) aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) (iPS-RPE) und fetale RPE abgeleitet, wurden verglichen.

Zusammenfassung

Ziel des Berichts ist es, die Protokolle für den Vergleich der microRNA (miRNA)-Profile von Menschen verursachten-pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen), retinale Pigmentepithel (RPE) aus menschlichen iPS-Zellen (iPS-RPE) abgeleitet und fetale RPE zu beschreiben. Die Protokolle beinhalten Sammlung von RNA für Microarray-Analyse durch, und die Analyse von Microarray-Daten zu miRNAs, die unterschiedlich zwischen drei Zelltypen exprimiert werden. Die Methoden zur Kultur der iPS-Zellen und fetaler RPE erklärt. Das zur Unterscheidung von menschlichen RPE von iPS-Protokoll verwendet, ist ebenfalls beschrieben. Die RNA-Extraktion Technik, die wir beschreiben, wurde ausgewählt, um maximale Erholung von sehr kleinen RNA, die für die Verwendung in einem miRNA-Microarray zu ermöglichen. Schließlich wird zellulären Weg-und Netzwerk-Analyse von Microarray-Daten erläutert. Diese Techniken werden den Vergleich der miRNA-Profile von drei unterschiedlichen Zelltypen zu erleichtern.

Einleitung

Stammzellen haben die Fähigkeit, ohne Begrenzung der Möglichkeit, in jedem Zelltyp zu differenzieren replizieren. Die Entwicklung von Techniken, um Körperzellen in pluripotente Stammzellen umzuprogrammieren hat große Aufregung in der Forschung und bei den Ärzten hervorgerufen, wie die Einführung von personalisierten Geweberegeneration ist am Horizont ein. Induzierte pluripotente Stammzellen-(iPS-Zellen) weisen die gleichen Merkmale der unbegrenzten Replikationspotential und Pluripotenz embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) unter Umgehung der ethischen Dilemmata mit WSR verbunden. Darüber hinaus wird von einem Patienten abgeleitete Stammzellen nicht stimulieren eine Immunantwort, die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen therapeutischen Anwendungen 2-3 stark erhöht. Unter bestimmten Kulturbedingungen haben iPS-Zellen gezeigt worden, um in verschiedene Zelltypen in vitro, einschließlich Herzmuskelzellen, Neuronen pankreatischen Betazellen, Leberzellen und Retina-Pigmentepithel (RP unterscheidenE) 12.04.

Das RPE ist eine spezialisierte Schicht pigmentierten Epithelzellen an der Rückseite der Retina, die mehrere Funktionen, die für visuelle Gesundheit und Funktion wie die Absorption von Streulicht, Phagozytose der Photorezeptoraußensegmente führt befindet, und die Verarbeitung von Retinoiden für die Herstellung der visuellen Chromophor. Dysfunktion des RPE aufgrund von Schäden oder Krankheit zutiefst betroffen Photorezeptor Gesundheit und visuellen Funktion, wie durch die blendende Krankheiten, die das Ergebnis der zugrunde liegenden RPE Pathologie wie der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), Stargardt-Krankheit und Retinitis pigmentosa (RP) sind belegt 13. Wirklich wirksame Behandlungen, die Vision wiederherstellen können nicht erreicht wurden, und der Ersatz der erkrankten RPE mit gesunden RPE kann die beste Option, um einen Verlust der Sehkraft 14-15 zu verhindern. RPE von iPS (iPS-RPE) abgeleitet ist eine mögliche Quelle von Zellen, die beschädigte RPE ersetzen. iPS-RPE drückt Merktic RPE Proteine ​​LRAT, CRALBP, PEDF und RPE65; zeigt die klassische stark pigmentierten hexagonalen RPE-Morphologie; und führt RPE-Funktionen wie Phagozytose, Retinoid-Verarbeitung und Sekretion von 11 - cis-Retinal 5,16. Doch bevor iPS-RPE therapeutisch genutzt werden kann, die iPS-RPE gründlich charakterisiert werden. Verständnis der Faktoren, Differenzierungs RPE regeln ist notwendig, um die Ausbeute und Reinheit der Zellen für klinische Anwendungen verwendet werden, zu verbessern.

Zelldifferenzierung ist das Ergebnis stark regulierten Genexpression. Epigenetische Umbau des Genoms und die Koordination von Transkriptionsfaktoren sind für Zellschicksal Entscheidungen, die während der Differenzierung und Entwicklung 17 auftreten erforderlich. Verordnung der Nachricht RNA (mRNA) Übersetzung von microRNA (miRNA) präsentiert noch eine weitere Ebene der Regulierung, die das Schicksal der Zelle 1 betrifft. MiRNAs sind kurze, ~ 22 nt, Längen von Nukleotiden, die entweder unterdrücken ÜbersetzungBindung an die 3'-UTR der mRNA oder mRNA, die für das Ziel-Abbau. MiRNAs haben in nahezu allen Geweben nachgewiesen worden, und bis heute über 2.000 einzigartigen menschlichen microRNAs im miRBase Datenbank registriert. Da miRNAs erfordern nur eine teilweise Komplementarität zu der Ziel-mRNA binden kann eine einzelne miRNA potenziell Dutzende oder Hunderte von Targets und umgekehrt zu binden, dh eine einzelne mRNA kann durch verschiedene miRNAs richtet sein. Diese Promiscuous Bindung charakteristisch erhöht drastisch die Komplexität der Regulierung sowie der Schwierigkeitsgrad der Bestimmung der Funktionen einzelner miRNAs und die jeweiligen Aufgaben in der zellulären Funktionen 18-21. Dennoch haben Studien gezeigt, dass miRNA verfeinert Genexpression während der Differenzierung durch die Beeinflussung DNA-Methylierungsstatus 17. In einer Studie mit mehr spezifisch auf die RPE, miR-204/211 wurde gezeigt, dass die epithelialen Phänotyp der RPE 22 zu fördern. Eine weitere Gruppe untersuchte die miRNA-Profilvon RPE während der Differenzierung von ES-Zellen und zeigte verschiedene Sätze von miRNA werden während des Differenzierungsprozesses 23 ausgedrückt. In der Tat kann miRNA Profile eindeutig unterscheiden Zelltypen, einschließlich ES Zellen, Vorläuferzellen und terminal differenzierte Zellen 24,25. Über 250 miRNAs in der Netzhaut exprimiert. Basierend auf diesen Studien die Hypothese auf, dass wir miRNAs eine wichtige Rolle während der Differenzierung von RPE von iPS.

Ziel des Berichts ist es, die Protokolle für die Differenzierung der RPE von IMR90-4 iPS-Zellen zu beschreiben, Sammlung von RNA für die Analyse von Mikroarrays und die Analyse von Microarray-Daten zu miRNAs, die unterschiedlich zwischen drei Zelltypen exprimiert werden, iPS-Zellen zu identifizieren , iPS-RPE und fetale RPE. Gesamt-RNA wurde aus Kulturen von jedem Zelltyp extrahiert und hybridisiert mit einem Mikroarray-miRNA, die bestimmte für 1.205 menschlichen miRNAs und 144 viralen miRNAs Sonden. Die Microarray-Ergebnisse wurden vergleichend zu bestimmen, welche miRNAs differentiell zwischen den verschiedenen Zelltypen exprimiert. miRNAs mit 2-fach oder mehr-fache Veränderung der Expression wurden für die weitere Analyse ausgewählt. Eine miRNA-Analyse-Software-Programm wurde verwendet, um potentielle Ziele der differentiell exprimierten miRNAs identifizieren und Mobilfunknetze durch die ausgewählten miRNAs reguliert erzeugen.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Reagenzien und Kultur Kulturplatten

  1. mTeSR1 Medien: Bereiten mTeSR1 Medien gemäß den Anweisungen des Herstellers. Auftauen 100 ml mTeSR1 5x Ergänzung Nacht bei 4 ° C. Fügen Sie die 100 ml mTeSR1 5x Ergänzung zu 400 ml mTeSR1 Grundmedien und gut mischen. Dieses Medium wird bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen und bei -20 ° C für 6 Monate stabil.
  2. Differenzierungsmedium: Vorbereiten Differenzierungsmedien in DMEM/F12 bis 0,1 mM β-Mercaptoethanol, 0,1 mM nichtessentiellen Aminosäuren, 2,0 mM L-Glutamin, 10% KO Serum und 10 ug / ml Gentamicin zu ergeben.
  3. iPS-RPE Medien: Bereiten iPS-RPE Medien in MEM, um 1x N1 Ergänzung, 0,1 mM nicht essentielle Aminosäuren, 250 ug / ml Taurin, 13 ng / ml Triiod-L-Thyronin Natriumsalz, 20 ng / ml Hydrocortison, 5 ug ergeben / ml Gentamicin, und 15% FBS 26.
  4. Triiod-L-Thyronin Natriumsalz Stammlösung. Um Stammlösung aufzulösen 1,0 mg Triiod-L-ThyroninNatriumsalz in 1 N Natronlauge durch vorsichtiges Schwenken. Als nächstes fügen 49,0 ml Basismedium auf 50,0 ml 20 pg / ml Triiod-L-Thyronin Natriumsalz zu machen. Aliquots und bei -20 ° C bis benötigt. Verwenden Sie geeignete Volumen, um die gewünschte Konzentration in der letzten Kulturmedien zu erreichen.
  5. Hydrocortison-Stammlösung: Zur Herstellung einer Stammlösung Hydrocortison, löslich zu 1 mg Hydrocortison in 1 ml absolutem Ethanol durch leichtes Schütteln. Weiter für 20 ml Hydrocortison Stammlösung von 50 ug / ml hinzuzufügen 19,0 ml Basismedium. aliquotieren und bei -20 ° C, bis sie benötigt. Verwenden Sie geeignete Volumen, um die gewünschte Konzentration in der letzten Kulturmedien zu erreichen.
  6. Fetal RPE Wachstumsmedium. Bereiten Sie die Wachstumsmedien durch Mischen aller Reagenzien im Kit RTEGM im Basalmedium nach den Herstelleranweisungen mit Ausnahme der FBS.
  7. Fetal RPE Plattenmedien. Plattenmedien herzustellen, indem eine kleine Menge an Wachstumsmedium in einen sterilen Behälter unddd FBS bis zu einer Endkonzentration von 2%.
  8. Dispase: Vorbereiten von Dispase Arbeitslösung von 1 mg / ml in DMEM/F12.
  9. Matrigel-beschichtete Platten: Bereiten Matrigel in DMEM/F12 bis 0,08 mg / ml.
  10. Coat jede Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 1,0 ml der Matrigel-Lösung.
  11. Die beschichteten Platten bei Raumtemperatur für 1,0 Stunden.
  12. Nach 1,0 h Inkubation saugen das überschüssige DMEM/F12.
  13. 0,5 ml der mTeSR1 Medien um Trocknung zu verhindern. Die Matrigel beschichteten Platten sind nun bereit für den Einsatz.

2. IPS Kultur

  1. Vor der iPS-Zellaussaat haben alle Rohre, warm mTESR1 Medien auf Raumtemperatur und die Matrigel beschichteten Platten bereit.
  2. Tauen schnell die IMR90-4 iPS-Zellen in einem 37 ° C Wasserbad. Dann entfernen Sie die Kryoröhrchen aus dem Wasserbad und sterilisieren mit 70% Ethanol.
  3. Übertragen der Zellen in ein 15 ml konisches Röhrchen mit einer 2 ml-Pipette zu Bruch von Zellaggregaten zu minimieren.
  4. Tropfenweise mit 5 ml warm mTeSR1 Medien zu den Zellen und vorsichtig mischen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 g für 5 min bei Raumtemperatur und Überstand.
  5. Der Zellaggregate vorsichtig resuspendieren in 2 ml mTeSR1 Medien und Samen der Zellen auf eine Vertiefung einer sechs Well-Platte.
  6. Legen Sie die Platte in eine 37 ° C-Inkubator und Kultur mit 5% CO 2, 95% Luftfeuchtigkeit.
  7. Ändern Sie den iPS-Zellkulturmedien täglich. Undifferenzierte Kolonien wird 5-7 Tage nach Aussaat erscheinen. Prüfen Sie, ob undifferenzierte Kolonien, die bereit für den Durchgang (Kolonien mit einem dichten Zentrum) sind.

3. Passagierung von iPS-Zellen

  1. Vor Beginn um den Durchgang die iPS-Zellen haben alle Rohre, Dispase Lösung erwärmt DMEM/F12 und mTERS1 Medien auf Raumtemperatur und die Matrigel beschichteten Platten bereit.
  2. Vor der Passage iPS-Zellen, entfernen Sie alle Bereiche der Differenzierung durch Abschaben der Bereich und Absaugen der Medien. Differenzierung sollte unter 20% der gut für hoch bleibenQualität Kulturen. Die iPS-Zellen enthaltende gut mit 2 ml DMEM/F12 Sorgfältig abspülen und 1 ml 1 mg / ml Dispase in jede Vertiefung.
  3. Inkubieren bei 37 ° C für 7 min. Saugen Sie den Dispase und sanft spülen Sie die Zellkolonien mit 2 ml DMEM/F12 zweimal.
  4. Nach dem Spülen 2 ml mTSER1 in jede Vertiefung.
  5. Mit einem 5 ml-Pipette vorsichtig abkratzen die Kolonien von der Platte, um Aggregate zu bilden.
  6. Übertragen der abgelösten Kolonien zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Ausreichend mTeSR1 Medien, um den nächsten Durchgang von Zellen Saatgut.

4. Differenzierung von iPS-Zellen zu iPS-RPE

  1. Platte die iPS-Zellen auf eine neu beschichtete Platte in mTESR1 Medien.
  2. Lassen iPS-Zellkolonien für 4-5 Tage in Kultur zu erweitern.
  3. Ersatz mTeSR1 Medien mit 4 ml Differenzierungsmedium. Ändern Sie die eine Hälfte der Medien alle 3 Tage.
  4. Ermöglichen pigmentierte Herde groß genug, um von Hand aus der Kultur präpariert werden (40-50 Tage) wachsen.
  5. Verwenden Sie ein200 ul Pipettenspitze auf rund geschnitten und heben Sie die pigmentierte Kolonien.
  6. Sammeln und zu bündeln, die seziert Kolonien in einem 15 ml konischen Röhrchen.
  7. Dann werden 5 ml DMEM/F12 zu den gepoolten RPE-Zellen und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min zweimal.
  8. Bereiten Sie eine einzelne Zelle Lösung durch Inkubation der gepoolten iPS-RPE mit 0,25% Trypsin-EDTA.
  9. Spülen Sie die iPS-RPE-Zellen mit iPS-RPE Medien und Platte die gesammelten Zellen auf eine frische Matrigel-beschichteten und in 4 ml iPS-RPE-Medien.
  10. Kultur die Zellen für 3 Wochen vor dem Durchgang. Ändern Sie die Medien alle 3 Tage. Für das Experiment Platte iPS-RPE bei 100.000 Zellen / cm 2. Sammeln Zellen an Tag 17. Zählen Sie die Tage der Aussaat als Tag 0.

5. Probenentnahme

  1. iPS-Zellen-Sammlung
    1. Kultur die iPS-Zellen bis undifferenzierte Kolonien beobachtet dicht in der Mitte zu sein.
    2. Spülen Sie die Kolonien in DMEM/F12.
    3. Distanzieren in einzelne Zellen mit accutas E. Sammeln der Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 300 × g für 5 min. Überstand wird abgesaugt. Resuspendieren in 2 ml DMEM/F12.
  2. Fetal RPE-Sammlung
    1. Fetal RPE-Zellkulturen mit DMEM/F12 ausspülen und distanzieren in einzelne Zellen unter Verwendung von 0,25% Trypsin-EDTA.
    2. Sammeln der Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifugieren bei 300 g für 5 min. Überstand wird abgesaugt. Resuspendieren in 2 ml DMEM/F12.
  3. iPS-Zellen-RPE-Sammlung
    1. Wenn die iPS-RPE erreichen Durchgang 3 und Kanal 5, sammeln die Zellen an Tag 17 nach dem Durchgang. Spülen iPS-RPE zweimal in PBS und bereiten eine Einzelzellsuspension durch Inkubation mit 1,0 ml 0,25% Trypsin.
    2. Neutralisieren Trypsin mit 2 ml eiskaltem iPS-RPE-Medien.
    3. Sammeln der Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 300 × g für 5 min. Überstand wird abgesaugt.
    4. Resuspendieren der Zellsuspension in 3 ml Färbepuffer aus Mikrokügelchen-Kit.
ve_title "> 6. Negative Auswahl der iPS-RPE undifferenzierten Zellen zu entfernen

  1. Halten Sie alle Reagenzien bei 4 ° C bis zur Verwendung, aber nicht auf Eis zu arbeiten. Zentrifuge Zellsuspension aus Schritt 5.3.4 bei 300 × g für 5 min. Überstand wird abgesaugt.
  2. Die Zellen in 100 &mgr; l Färbepuffer von Mikrokügelchen Satz pro 2 × 10 6 Zellen.
  3. Hinzufügen von 10 ul Anti-TRA-1-60-PE-Antikörper pro 2 × 10 6 Zellen.
  4. Gut mischen und Inkubation bei 4 ° C für 10 min.
  5. Waschen der Zellen in 1-2 ml Puffer pro 2 × 10 6 Zellen. Zentrifuge für 10 min bei 300 x g. Überstand wird abgesaugt.
  6. Die Zellen in 80 &mgr; l Färbepuffer pro 2 × 10 6 Zellen. Hinzufügen von 20 ul Anti-PE markierten Mikrokügelchen (aus dem Kit) pro 2 × 10 6 Zellen. Gut mischen. Inkubation für 15 min bei 4 ° C
  7. Hinzufügen 1-2 ml Färbepuffer pro 2 × 10 6 Zellen. Zentrifuge für 10 min bei 300 x g. Überstand wird abgesaugt.
  8. Die Zellen in 500 & #956, l Färbepuffer.
  9. Magnetische Zelltrennung:
    1. Zeigen Spalte in magnetischen Zellsortierer. Spülen Säule mit 3 ml Färbepuffer.
    2. Bewerben Zellsuspension von 6,8 auf Spalte.
    3. Setzen Sie ein Rohr an der negativen Port, um die TRA-1-60 negativen Zellen zu sammeln.

7. Gesamt-RNA-Extraktion

  1. Lyse der Zellen, indem Sie die Proben durch einen handelsüblichen Mikro Homogenisator Mini-Spin-Säule für die Nukleinsäure-Minipräparationen konzipiert.
  2. Auszug Gesamt-RNA aus iPS-Zellen, iPS-RPE und fetale RPE mit dem kommerziell erhältlichen RNA-Extraktions-Kits entwickelt, um kleine RNA-Moleküle 27 zu bewahren.
  3. Bestimmen Sie die Gesamt-RNA-Konzentrationen mit Hilfe eines Nanodrop Spektralphotometer.

8. Bioanalyzer und Microarray-Assay

  1. Überprüfen Sie die Integrität der RNA mit Bioanalyzer in Verbindung mit handelsüblichen Qualität der RNA-Kit.
  2. Inkubation von 100 ngGesamt-RNA mit Kälberdarm-Phosphatase bei 37 ° C für 30 min
  3. Denaturierung der RNA unter Verwendung von 100% DMSO bei 100 ° C für 5 min.
  4. Bezeichnen die Proben PCP-Cy3 mit T4-Ligase Inkubation bei 16 ° C für 1 Stunde.
  5. Hybridisieren auf einer 8_x_15K Format menschlichen miRNA-Array.
  6. Gemäß den Anweisungen des Herstellers Waschen Sie die Arrays und Scannen mit einer Auflösung von 5 um mit Hilfe eines Scanners.
  7. Erwerben Daten mittels Microarray Merkmalsextraktion-Software mit der miRNA-Microarray kompatibel.
  8. Verarbeiten Sie die miRNA-Signale, um die relative Höhe der Expression in jeder Probe zu bestimmen.
  9. Vergleichen Sie die Expressionsniveaus der einzelnen miRNA zwischen den Probengruppen. Wählen miRNAs mit mindestens zweifacher Differentialausdruck für die weitere Analyse.
  10. Verwendung handelsüblicher Software zur Datenanalyse, befolgen Sie die Anweisungen, um die Wärmekarten zur Visualisierung von differentiell exprimierten miRNAs 28 zu generieren.

9. Pathway Analysis

  1. Speichern Sie Daten von den in 8.9 im Excel-Format ausgewählt miRNAs.
  2. Melden Sie sich im Online-RNA-Weg-Analyse-Programm. Laden Sie die Excel-Datei. Wählen Sie "Flexible Format" für die Datei-Format und wählen Sie "Agilent" aus der Dropdown-Liste für Typ-Kennung.
  3. Unter Rohdaten Überschrift zuweisen "ID" ID-Spalte zu untersuchen und zuordnen "Beobachtungs 1" und "log ratio" in die Protokollration Spalte. Wählen Sie "ignorieren" für alle anderen Spalten.
  4. Wählen Sie die Parameter für die Analyse wie folgt: Vertrauen: nur experimentell beobachtet; beinhaltet direkte und indirekte Beziehungen; und gehören endogene Chemikalien; Wählen Sie die Ingenuity Wissensdatenbank als Referenzsatz. Wählen Sie die Datenbank mit Referenzmoleküle, die Daten von allen Arten, alle Zelllinien und Geweben, und alle Mutationen enthält.
  5. Netzwerk-und Run-Weg-Analysen.

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Ergebnisse

IPS-Zellen (1A) in Differenzierungsbedingungen gezüchtet, um die Differenzierung in iPS-RPE-Zellen zu induzieren. Die iPS-RPE RPE zeigte klassische Phänotyp der hexagonalen pigmentierte Zellmorphologie (Abbildung 1B) ähnlich fetale RPE (Abbildung 1C).

Um die Rolle der miRNA kann während der Prozess der Differenzierung von iPS zu iPS-RPE spielen, besser zu verstehen, wurde Microarray-Analyse von miRNA-Expression durchgeführt. Gesamt-RNA aus i...

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Diskussion

Im Ergebnis dieser Bericht beschreibt die Kultur zu iPS-Zellen verwendeten Methoden, iPS-RPE und fetale RPE. RPE von iPS abgeleitet sind morphologisch und funktionell ähnlich fetale RPE. Die iPS-RPE drückt auch RPE charakteristischen Genen einschließlich RPE65, CRALBP, PEDF und LRAT 16. Zur weiteren Charakterisierung dieser Zellen wurde RNA extrahiert und dazu verwendet, Mikroarray-Analyse durchzuführen, um differentiell exprimierte miRNA identifizieren. Die Analyse der Signalintensitäten ergab, dass die größ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Die hierin enthaltenen Meinungen und Aussagen sind die privaten Ansichten der Autoren und sind nicht als offizielle oder als die die Ansichten der Abteilung der Armee oder des Verteidigungsministeriums ausgelegt werden.

Diese Untersuchung wurde durchgeführt, während die Autoren Whitney A. Greene, Alberto Muñiz und Ramesh R. Kaini hielt eine Postdoctoral Research Associateship National Research Council an der USAISR.

Microarray-Assays wurden durch die Greehey Kinderkrebsforschungsinstitut Microarray-Core Facility und Bioinformatik-Abteilung an der UT Health Science Center in San Antonio durchgeführt.

Diese Arbeit wurde von der US Army Klinische Rehabilitative Medizin Research Program (CRMRP) und Operational Military Medicine Research Program (MOMRP) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
mTeSR1 Medium + 5X SupplementStem Cell Technologies5850
DMEM/F12Life Technologies11330-032
2-β-mercaptoethanolSigmaM-7154
Nicht-essentielle AminosäurenHyclone (Fisher)SH30853.01
Knockout-SerumersatzLife Technologies10828-028
Gentamicin Life Technologies15750-060
MEM MedienLife Technologies10370-021
N1 NahrungsergänzungsmittelSigmaN-6530-5ML
TaurinSigmaT-8691-25G
HydrocortisonSigmaH0888-1G
Fötales RinderserumHyklon (Fisher)SH3008803HI
Trijod-l-Thyronin-NatriumsalzSigmaT6397
NatriumhydroxidSigmaS5881
Fetales RPE-Medium RTEGM-KitLife Technologies195406
DispaseLife Technologies17105-041
MatrigelBD Biosciences354277
Phosphatgepufferte KochsalzlösungHyklon (Fisher)10010-023
Trypsin-Hyklon(Fischer)25200-072
Miltenyi Biotec WaschpufferStemGent130-092-987
Miltenyi Biotec SpülpufferStemGent130-092-222
Anti-TRA-1-60 Mikrokügelchen-KitStemGent130-095-816
Miltenyi Biotec ZellsortiersäuleStemGent130-021-101
RNeasy Micro KitQiagen74004
QIA AktenvernichterQiagen79654
RNA 6000 Pico LabChip KitAgilentG2938-90046
Humane miRNA Microarray v16AgilentG4471A

Referenzen

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F tales RPERNA ExtraktionMicroarray AnalysePfadanalyseZelldifferenzierungZellkulturDurchflusszytometrie

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