Rückwärts Genetische Morpholino Ansatz mit Herz ventrikuläre Injektion auf mehrere Schwer zu Zielgeweben in der Zebrafisch-Larve Transfektion

Zusammenfassung

Ein anpassungsfähiges reversen genetischen Methode für Zebrafisch-Gen-Funktion während der späteren Phasen der Entwicklung und physiologischen Homöostase wie Geweberegeneration unter Verwendung intraventrikuläre Injektion von Gen-spezifischen morpholinos beurteilen.

Zusammenfassung

Der Zebrafisch ist ein wichtiges Modell, um die Zell-und Molekularbiologie der Organ-und Anhängsel Regeneration zu verstehen. Allerdings molekularen Strategien zur reversen Genetik beschäftigen haben noch nicht ausreichend entwickelt, um Gen-Funktion bei der Regeneration oder Gewebe-Homöostase während der Larvenstadien nach Zebrafischembryogenese zu bewerten und mehrere Gewebe innerhalb des Zebrafisch-Larve sind schwer zu zielen. Intraventrikuläre Injektion von genspezifischen Morpholinos bieten ein alternatives Verfahren für die aktuelle Unfähigkeit genomisch Zielzebrafisch-Gene in einer zeitlich gesteuerten Weise in diesen Phasen. Dieses Verfahren ermöglicht eine vollständige Dispersion und anschließende Einarbeitung des Morpholino in verschiedenen Geweben im ganzen Körper, einschließlich Strukturen, die bisher unmöglich zu erreichen, wie sie im Larvenschwanzflosse, eine Struktur oft verwendet, um nicht-invasiv zu erforschen Geweberegeneration waren. Mehrere Gene während der Larven finfold Regeneration aktiviert werden auch Präsentationt bei der Regeneration von Geweben erwachsener Wirbeltiere, so dass die Larve ist ein nützliches Modell, um die Regeneration bei Erwachsenen zu verstehen. Diese Morpholino Dispersionsmethode erlaubt die schnelle und einfache Identifizierung von Genen, die für die Regeneration von Gewebe Larven sowie anderen physiologischen Erscheinungen regulieren Gewebshomöostase nach Embryogenese erforderlich. Daher stellt diese Methode ein Liefer aktuell benötigten Strategie zur zeitlichen Steuerung der Auswertung von Genfunktionen nach Embryogenese.

Einleitung

Regeneration von Organen und Anhängsel ist grundlegend wichtig für das Überleben und Fitness; jedoch haben mehrere Wirbeltieren einschließlich des Menschen regenerative Fähigkeiten beschränkt. Während mehreren Tiermodellen existieren, die umfangreichen Regenerationsfähigkeit haben, Reverse genetische Techniken, um Gen-Funktion während der Organregeneration und Anhängsel zu beurteilen sind sehr begrenzt oder gar nicht vorhanden. Daher sind neue Methoden erforderlich, um die Molekularbiologie der Regeneration in diesen Modellorganismen zu sezieren.

Der Zebrafisch ist ein gut etabliertes Modell für das Verständnis der Zell-und Molekularbiolo....

Protokoll

1. Herstellung der Glas-Nadeln (Abbildung 1)

1. Verwenden Glaskapillaren mit einem Durchmesser von 0,75 mm bis Injektionsnadeln (Abbildung 1A) vorzubereiten.
2. Legen Sie die Glaskapillare in eine Nadel Zieher und ziehen Sie die Nadel mit dem folgenden Parameter: Heizung Zykluswert: 463; Ziehen Zykluswert: 230; Geschwindigkeit: 150 ms; Zeit: 150 ms (Fig. 1B).
3. Brechen Sie das Glas gezogen Kapillare mit Uhrmacher-Pinzette, eine Nadel Durchmesser 20 um unter einem Stereoskop mit einem Mikrometer-Okular zu produzieren.
4. Verwenden Sie eine Drehbank mit einem angefeuchteten Gummi Spinnrad, um die Nadel zu ....

Ergebnisse

Die scharfe, abgeschrägte Injektionsnadel wird einfach in die Herzkammer des Zebrafisch-Larve platziert, wenn dorsal angefahren (3A). Das Herz pumpt weiter und trotz der Anwesenheit der Nadel (3B und 3C) Blutstrom aufrechterhalten wird. Vorsichtig Injektionen nicht stören die Morphologie der Herzkammer oder der Herzkontraktionen (Fig. 3D), trotz der Injektion des Morpholino in das Herz (Fig. 3E).

Innerhalb v.......

Diskussion

Die intraventrikuläre Injektion bietet eine schnelle und zuverlässige Beurteilung Verfahren zur Prüfung der Genfunktion in späteren Phasen der Entwicklung oder der Homöostase des Körpers, ohne die Gen-Funktion während der Embryogenese. Um den Erfolg dieser Technik zu gewährleisten, sollte man sich bewusst sein, vier kritische Punkte: 1) Nadel, 2) Trocknen aus der Nadel, 3) zu minimieren Volumen und 4) minimale Belichtungszeit in der Sedierung Lösung. Nadeln, die zu klein sind, werden häufig verstopfen, während Nadeln, d.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Morpholino mit 3&akut; Fluoreszein-Tag	Gene Tools Inc.	Kundenspezifisch	Weitere Informationen unter www.gene-tools.com
Endo-Porter	Gene Tools Inc.		Weitere Informationen unter www.gene-tools.com
Agarose	Serva 120623		Zum Ausgießen von Platten zum Platzieren des Fisches während der Injektionen und zur Bildgebung
Tricain (L-Ethyl-m-amino-benzat-methansulfonat)	Applichem		Für die Anästhesie
E3 Medium (5 mM NaCl; 0,17 mM KCl; 0,33 mM CaCl2; 0,33 mM MgSO4)			Für die Larvenhaltung
Petrischalen	Sarstedt	821.472	Zum Platzieren des Fisches während der Injektion und zur Bildgebung
Dünnwandige Glaskapillaren	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-3	Zur Vorbereitung von Injektionsnadeln
Microloader Pipettenspitzen	Eppendorf	5,242,956,003	Zum Laden der Nadel
Pasteurpipetten (3 ml/1 ml)	Marke	747760/ 74775	Zum Übertragen von Larven
Flammender/Brauner Nadelabzieher	Sutter		Weitere Informationen unter www.sutter.com
Uhrmacher (Dumont) Pinzette (Größe 5)	World Precision Instrumente, Inc.	501985	Zum Bremsen der Nadel vor dem Schärfen
Präpariermikroskop	Olympus, Leica, Zeiss	Variiert je nach Hersteller	Teil des gesamten Injektionsaufbaus
Fluoreszenzkamera	Olympus, Leica, Zeiss	Variiert je nach Hersteller	Zur Abbildung der Fluoreszenz nach dem Einstechen
PicoDüsen-Kit (Mikroinjektorhalter)	World Precision Instruments	5430-12	Für Mikroinjektionen Pneumatische
PicoPump (Mikroinjektor)	World Precision Instruments	SYS-PV820	Für Mikroinjektionen