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Methodenartikel

Die Verwendung von fluoreszierenden Ziel Arrays zur Beurteilung der T-Zell-Antworten

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DOI:

10.3791/51627

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19. Juni 2014

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, John Curtin School of Medical Research, Australian National University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Fähigkeit, T-Zell-Antworten im Detail in vivo Überwachung ist wichtig für die Entwicklung des Verständnisses der Immunantwort. Hier beschreiben wir die Verwendung von fluoreszierenden Zielarrays (FHA) in einem in vivo-T-Zell-Assay,> 250 Parameter beurteilt gleichzeitig mittels Durchflusszytometrie.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit, T-Zell-Antworten in vivo zu überwachen, ist wichtig für die Entwicklung des Verständnisses der Immunantwort und die Gestaltung der Immuntherapie. Hier beschreiben wir die Verwendung von fluoreszierenden Zielarrays (FTA)-Technologie, die Vitalfarbstoffe wie Carboxyfluoreszein Succinimidylester (CFSE), violetten Laser erregbar Farbstoffe (CellTrace Violett: CTV) nutzt und rote Laser erregbar Farbstoffe (Dye Cell Proliferation eFluor 670: CPD ) Etiketten Maus Lymphozyten in> 250 erkennbar fluoreszierenden Zellhaufen kombinato. Zellhaufen innerhalb dieser Freihandelsabkommen mit Haupthistokompatibilitäts (MHC)-Klasse-I und MHC-Klasse-II-bindenden Peptiden gepulst werden und dienen als Zielzellen für CD8 + und CD4 + T-Zellen, die jeweils damit. Diese FTA Zellen lebensfähig bleiben und voll funktionsfähig und kann daher in Mäuse verabreicht werden, um Beurteilung der CD8 + T-Zell-vermittelte Abtötung von Zielzellen und FTA CD4 + T-Zell-meditierten hel ermöglichenp von freien Zielzellen B-Zellen in Echtzeit in vivo durch Durchflusszytometrie. Da> 250 Zielzellen auf einmal geprüft werden, ermöglicht die Technik der Überwachung der T-Zell-Antworten gegen verschiedene Antigen-Epitope in verschiedenen Konzentrationen und in mehreren Wiederholungen. Als solche kann die Technik T-Zell-Antworten sowohl auf quantitative (zB der kumulativen Größe der Antwort) und eine qualitative (z. B.. Funktionelle Avidität und Epitop-Kreuzreaktivität der Antwort-) Pegel zu messen. Hier beschreiben wir, wie diese Freihandelsabkommen sind konstruiert und geben ein Beispiel, wie sie angewendet werden, um T-Zell-Antworten durch einen rekombinanten Pockenvirus-Impfstoff induziert beurteilen.

Einleitung

T-Zellen spielen eine zentrale Rolle in der adaptiven Immunantwort und werden oft für die Manipulation in der Immuntherapie richtet. CD4 + Effektor-T-Zellen reagieren auf fremde Antigen durch Sekretion von Zytokinen, die viele Aspekte der Immunität regulieren und kann auch direkt helfen, B-Zellen, Antikörper zu produzieren. CD8 + zytotoxischer T-Zellen (CTLs) können auch Fremdantigen reagieren durch Sekretion von Zytokinen und spielt eine zentrale Rolle bei der Abtötung von Zellen direkt ein fremdes Antigen exprimiert. Die grundlegende Interaktion, die diese T-Zell-Effektorfunktionen initiiert beinhaltet die Interaktion des T-Zell-Rezeptor (TCR) mit fremden Peptiden auf MHC-Molekülen auf der Oberfläche von Zellen angezeigt. CD4 + T-Zellen erkennen Peptide an MHC-Klasse-II-Molekülen auf Antigen-präsentierenden Zellen und CD8 + T-Zellen erkennen das Peptiden auf MHC-Klasse-I-Moleküle, die typischerweise auf Mikrobe infizierten Zellen angezeigt werden, angezeigt.

Umdie Rolle T-Zellen in einer Immunantwort spielen zu beurteilen, ist es wichtig, dass ihre Effektor-Funktionen werden durch zuverlässige und empfindliche Methoden gemessen. Gemeinsame Methoden für die T-Zellantwort Bewertung einzubeziehen; MHC-Tetramer class-I/II/peptide Reaktivität; Zytokin-Produktion durch ELISPOT und intrazellulären Zytokin-Färbung; und Tötungskapazität von 51 Cr-Release-Assays. Diese Tests sind jedoch in der Regel ex vivo durchgeführt in vitro Stimulation oder einen begrenzten Einblick in die T-Zellfunktion. Idealerweise bei der Messung von T-Zellantworten wäre es vorteilhaft, diese in situ zu beurteilen, in vivo, wie sie auftreten, ohne Manipulation von T-Zellen, so dass Änderungen der funktionellen Parameter, die durch in vitro-Stimulation auftreten können, zu vermeiden. Einige der am häufigsten in vivo T-Zell-Funktionsassays verwendet werden zur Messung CTL-vermittelte Abtötung von Zielzellen, die mit MHC-Klasse I-bindenden Peptiden gepulst, die in vivo aufgezählt werden basierendüber deren Nachweis durch Fluoreszenzmarkierung mit Vitalfarbstoffe wie CFSE. Während diese Arten von Tests können CTL-vermittelte Abtötung von Zielen zu überwachen, wenn sie in vivo vorkommen, sie vorher eine relativ begrenzte Kapazität zur Tötung von mehreren Zielen präsentiert verschiedenen Konzentrationen und verschiedenen Typen von Peptid-Epitopen, die erforderlich ist, qualitative Parameter, damit beurteilt hatten als funktionelle Avidität und Epitop Variante Kreuzreaktivität bewertet werden. Diese Tests auch nicht bieten keine Informationen über CD4 + T-Zell-vermittelte Reaktionen.

Zu überwinden viele der Beschränkungen verwendet werden, um T-Zellreaktionen zu bewerten gegenwärtigen Verfahren, haben wir vor kurzem ein Multiplex-Assay auf Basis von fluoreszierenden Zielarrays (FHA), die die Kontrolle der T-Zell-Antworten gegen> 250 Zielzellen gleichzeitig in einem tierischen ermöglicht entwickelten Durchflusszytometrie 1, 2. Freihandelsabkommen sind von Lymphozyten mit meh beschriftet umfasstBundes Konzentrationen und Kombinationen von Vitalfarbstoffe wie CFSE, CTV und CPD erlaubt> 250 Zellhaufen von einzigartigen Fluoreszenz erzeugt werden. Da diese Zellen lebensfähig und funktionsfähig bleiben, können sie in Tiere injiziert werden, um die Überwachung ihrer Wechselwirkung mit Effektor-T-Zellen in vivo 3 zu ermöglichen. Zum Beispiel kann die FTA Zellcluster mit MHC-Klasse-I-bindende Peptide gepulst werden, um Beurteilung der Antigen-spezifischen CTL-vermittelte Abtötung von Zielzellen 1 zu ermöglichen. Darüber hinaus können die FTA Zellcluster auch mit MHC-Klasse-II-bindenden Peptiden gepulst werden, das eine Bewertung von Antigen-spezifischen T-Helferzellen (T H)-Aktivität durch Bestimmung der Aktivierung (durch Bewertung des Aktivierungsmarker, wie CD69, CD44 und / oder CD62L) von B-Zellen in der FTA Lager verwandten Peptid 2. Seit mehr als 250 Ziele können gleichzeitig erfasst werden, ist es möglich, CTL und T H-Antworten gegen viele Zielzellcluster mit n gepulst messenahlreiche Peptide bei verschiedenen Konzentrationen und die Aufnahme der vielen Wiederholungen. Die FTA-Test ist daher ein beispielloses Niveau von T-Zell-Antwort-Effektor Beurteilung in vivo.

Hier beschreiben wir im Detail die Konstruktion einer FTA und zeigen, wie sie zur Bestimmung der T-Zellantworten in vivo angewendet werden. Das Verfahren beschreibt die Konstruktion eines FTA 252 erkennbaren Zellcluster durch die Verwendung von drei Vitalfarbstoffen, 6 Wiederholungen der 42 Zellcluster mit MHC-Klasse-I und-II-bindenden Peptiden gepulst aufweist, aufweisend. Die Markierung von Zellclustern 42 erfolgt in 10 ml-Röhrchen mit konischem Boden und es ist hilfreich, um diese in einem Reagenzglasgestell lag wie in Tabelle 1 dargestellt. Dieses Verfahren kann für eine kleinere Anzahl von erkennbaren Cluster eingestellt, wie durch die Verringerung der Menge der Markierung erforderlich jeder Farbstoff 1 durchgeführt.

Wir zeigen den Nutzen des Tests zeigen, wie es Respons messenes durch rekombinante Pocken-Virus-Impfung gegen mehrere Epitope in einer kleinen Kohorte von Mäusen erzeugt. Dies zeigt, wie das Freihandelsabkommen Test kann verwendet werden, um kumulative Antworten und funktionelle Avidität durch zu messen, bzw. die Verwendung von Fläche unter der Kurve (AUC) Untersuchungen bzw. die Messung der effektiven erforderlich, um die Hälfte der maximalen Antworten (EG 50) erzeugen Peptidkonzentration werden.

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Protokoll

Hinweis: Die Mäuse aus diesem Protokoll wurden gemäß den Richtlinien der Australian National University Tierversuche Ethikkommission und Mäuse behandelt wurden durch Genickbruch getötet.

1. Dye-und Peptid Vorbereitung

  1. Dye Vorbereitung
    Hinweis: Die Farbstoffe werden in unterschiedlichen Konzentrationen vorverdünnt die Kennzeichnung von Zellen an diskreten Fluoreszenzintensitäten ermöglichen. CFSE ist sieben Konzentrationen über 3,5-fach serielle Verdünnungen verwendet und CTV und CPD sind an sechs verschiedenen Konzentrationen über 3,7-fache serielle Verdünnungen verwendet (siehe Tabellen 2-4). Die Aktien Konzentrationen in den Tabellen 2-4 aufgeführten Farbstoffe verwendet werden, um Zielzellen bei den in den Tabellen 2-4 aufgeführt endgültige Farbstoffkonzentrationen zu markieren. Farbstoffe reagieren bei Einwirkung von wässriger Lösung. Es ist daher wichtig, daß Fläschchen auf RT vor dem Öffnen, um die Exposition von Farbstoffen, um eine Kondensation zu minimieren äquilibriert werden.
    1. CFSE
      Hinweis: CFSE als Carboxyfluoresceindiacetat succinimidylester (CFDA, SE; MW 557,47) gekauft, in der Regel bei 25 mg / Fläschchen.
      1. Resuspendieren 25 mg in 4,48 ml CFSE DMSO, um eine 10 mM Stammlösung zu erhalten.
      2. Serienmäßig verdünnen CFSE: Fügen Sie 35 ul 10 mM CFSE Lager in 87,5 ul DMSO und wiederholen Sie dies mit verdünnter Stammlösung, um jede Farbstoffkonzentration in der Tabelle 3 zu geben.
    2. CTV
      Hinweis: CTV wird typischerweise in Packungen 9 Ampullen, die jeweils mit 10 &mgr; l DMSO aufgelöst werden, um eine 10 mM Lösung des Farbstoffs zu erzeugen gekauft.
      1. Rekonstituieren und Pool Alle 9 Fläschchen CTV mit 90 ul DMSO, um eine 10 mM Lösung.
      2. Serienmäßig verdünnen CTV: Fügen Sie 11 ul 10 mM CTV Lager in 29,7 ul DMSO und wiederholen Sie dies mit verdünnter Stammlösung, um jede Farbstoffkonzentration in der Tabelle 2 zu geben.
    3. CPD
      Hinweis: CPD (MW 792,6) ist typischly gekauft als 0,5 mg / Fläschchen.
      1. Resuspendieren 0,5 mg CPD in 63 ml DMSO, um eine 10 mM Lösung zu erhalten.
      2. Serienmäßig verdünnen CPD: Fügen Sie 11 ul 10 mM CPD Lager in 29,7 ul DMSO und wiederholen Sie dies mit verdünnter Stammlösung, um jede Farbstoffkonzentration in der Tabelle 4 geben.
        Hinweis: Dye Aktien können bei -20 ° C für mehrere Monate gelagert werden und kann mehrmals aufgetaut und wieder eingefroren werden, ohne signifikanten Verlust in der Funktion.
  2. Peptid-Vorbereitung
    Hinweis: MHC-Klasse-I-bindende Peptide sind in der Regel verwendet, um Zielzellen bei 6 verschiedenen Konzentrationen unter Verwendung von Impuls 10fache Verdünnungen von einer Startkonzentration von 1 &mgr; M (Tabelle 5). MHC-Klasse-II-bindenden Peptiden werden im Allgemeinen verwendet, um Zielzellen bei 6 verschiedenen Konzentrationen unter Verwendung von Impuls 3 fachen Verdünnungen von einer Ausgangskonzentration von 400 &mgr; M (Tabelle 5). Jedes Peptid wird mit 2x Endkonzentration in PBS wie that jedes Peptidkonzentration hat eine Mindestmenge von 250 ul. Peptid-Aktien können vor der FTA Konstruktion hergestellt und bei -20 ° C ohne wesentliche Funktionsverlust gelagert werden.
    1. Vorbereiten Lager MHC-Klasse-I-bindenden Peptiden
    2. Bereiten Sie die höchste Konzentration von jedem Peptid-Epitop zu 2 uM Stammlösungen (2x 1 uM)
    3. Serienmäßig verdünnen MHC-Klasse-I-bindende Peptide: add 44,4 ul 2 uM Peptid-Stammlösung in 400 ul PBS. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit verdünnter Stammlösung, um jede Peptidkonzentration in der Tabelle 5 zu geben.
    4. Vorbereiten Lager MHC-Klasse-II-bindenden Peptide
    5. Bereiten Sie die höchste Konzentration von jedem Peptid-Epitop bis 800 um Stammlösungen (2x 400 uM).
    6. Serienmäßig verdünnen MHC-Klasse-II-bindenden Peptide: add 150 ul 800 uM Peptid-Lösung in 300 ul PBS. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit verdünnter Stammlösung, um jede Peptidkonzentration in Tabelle 5 geben .

2. FTA Vorbereitung

Hinweis: Das folgende Verfahren beschreibt die Konstruktion eines FTA von Zellen mit 7 verschiedenen Peptid-Epitopen gepulst bei 6 unterschiedlichen Konzentrationen (dh 42 Zellcluster.) 6 mal wiederholt, um 252 erkennbaren Zellcluster zu erzeugen besteht. In jeder Wiederholung ein Zellcluster mit keinem Epitop (null) gepulst wird, wird als Kontrolle eingeschlossen. Es ist hilfreich für Freihandelsabkommen, eine CD45 Allotyp Unterschied Wirtstiere müssen ihre Diskriminierung von Empfängerzellen durch Antikörpermarkierung zum Zeitpunkt der Analyse zu ermöglichen. Ansonsten Freihandelsabkommen mit anderen Farbstoffen wie PKH-26 für diesen Zweck (in Schritt 2.6 beschrieben) gekennzeichnet werden. Typischerweise wird die FTA Vorbereitung Verfahren von Anfang durchgeführt, um während einer Sitzung zu beenden.

  1. Etikett 42, 10 ml Kunststoffröhrchen mit konischem Boden 1-42 (wie in Tabelle 1 zum Beispiel).
  2. Vorbereitung der Zellen
    1. Isolieren Milz und / oder lymphnodes von Mäusen. Bereiten Einzelzellsuspension von Gewebe durch Maischen durch eine 70 um brütete Sieb mit einer 5 ml Spritzenkolben und zählen Zellen mit einer Zählkammer.
    2. Resuspendieren Lymphozyten bei bis zu 200 x 10 6 Zellen / ml in 11,5 ml Rochester Park Memorial Institute 1640 (RPMI, oder Äquivalent), das 5% fötales Kälberserum (FCS). Hinweis: Es ist wichtig, einen Puffer mit hohem Amingehalt zu verwenden, um die Toxizität für Zellen Farbstoff 3 zu minimieren.
  3. CTV Kennzeichnung
    Hinweis: Die Zellen werden zunächst mit sechs Konzentrationen von CTV markiert.
    1. Die Zellen gründlich resuspendieren durch Umdrehen des Röhrchens mehrmals. Fügen Sie 1,9 ml der Zellsuspension in 6 der 10-ml-Röhrchen beschriftet 37-42, kümmert sich nicht um die obere Hälfte der Röhren zu benetzen.
    2. Um Zellen mit CTV beschriften, entfernen Sie die Rohrkappe und legte den Schlauch horizontal.
    3. In 83 ul PBS zu dem nicht benetzten Teil am oberen Ende des Rohres, und dieses Add 17 ul Lager CTV (siehe Tab.le 2, für die Stammlösung wird auf die Tube) zugeordnet. Hinweis: Ein nicht benetzt Rohr ist wichtig, um die Zellsuspension Bewegung und vorzeitiges Mischen der Zelllösung mit der Farbstofflösung zu verhindern.
    4. Das Röhrchen und mischen Sie die Zellsuspension mit dem Farbstoff schnell und gründlich durch Vortexen.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.2-2.3.4 für die Stammlösungen von CTV in den in Tabelle 2 beschrieben bezeichnet Röhren.
    6. Inkubiere Zellen für mindestens 5 min bei RT (20 ° C).
  4. CFSE Kennzeichnung
    1. Nach CTV Kennzeichnung, 5 ml RPMI mit 5% FCS in jedes Röhrchen und gründlich resuspendieren durch Vortexen.
      1. Von Rohr 37 1 ml der Zellsuspension in die Rohre 31, 25, 19, 13, 7 und 1.
      2. Von Rohr 38 1 ml der Zellsuspension in die Rohre 32, 26, 20, 14, 8 und 2.
      3. Von Rohr 39 1 ml der Zellsuspension in die Rohre 33, 27, 21, 15, 9 und 3.
      4. Von Rohr 40 1 ml der ZellSuspension Rohre 34, 28, 22, 16, 10 und 4.
      5. Von Rohr 41 je 1 ml der Zellsuspension in Rohren 35, 29, 23, 17, 11 und 5.
      6. Von Rohr 42 je 1 ml der Zellsuspension auf Rohre 36, 30, 24, 18, 12 und 6
        Hinweis: Achten Sie darauf, die obere Hälfte der Rohre während der Schritte 2.4.1.1-2.4.1.6 benetzen.
    2. Um Zellen mit CFSE beschriften, entfernen Sie die Rohrkappe und legte den Schlauch horizontal.
    3. In 103 ml PBS auf die nicht benetzt Abschnitt an der Oberseite der Röhre, und diese 7 ml Stamm CFSE hinzufügen (siehe Tabelle 3, für die Stammlösung wird auf die Röhre zugeordnet).
    4. Das Röhrchen und mischen Sie die Zellsuspension mit dem Farbstoff schnell und gründlich durch Vortexen.
    5. Haben Schritte 2.4.2-2.4.4 für die Stammlösungen von CFSE in den in Tabelle 3 beschrieben bezeichnet Röhren.
    6. Inkubiere Zellen für mindestens 5 min bei RT (20 ° C).
    7. Waschen der Zellen: Zellsuspension verdünnt mit 9 ml 20 ° CRPMI mit 5% FCS, Sediment durch Zentrifugieren bei 300 × g für 10 min bei 20 ° C und entfernt Überstände durch Absaugen mit einer Transferpipette.
  5. Peptid-Pulsen und Zellwasch
    Hinweis: Nach der Zellen mit CTV und CFSE markiert worden sind, werden sie mit MHC-Klasse-I-und / oder MHC-Klasse-II-bindenden Peptide (in 1.2 hergestellten) gepulst. Eine der Zellpopulationen sind ebenfalls nicht mit Peptid (zB. Nil in Tabelle 1) gepulst werden und als negative Kontrolle für die Berechnung der T-Zell-Reaktionen verwendet.
    1. Peptid-Pulsen
      1. Die Zellen in einem Gesamtvolumen von 250 ul RPMI mit 5% FCS. Anmerkung: In der Regel 50 ul Zellsuspension verbleibt nach dem Absaugen des Überstands am Ende von Schritt 2.4.7 daher mit 200 ul Medium, um Pellets Zelle.
      2. Add 250 ul Peptid pre bereit Bestände (wie in Tabelle 5), die Rohre (wie in Tabelle 1) entsprechend bezeichnet und sein surallein e, ein Steuerrohr des PBS aufgenommen sind ohne Peptid als Nil Kontrolle.
      3. Mischen Zellsuspensionen mit einem Wirbel. Hinweis: Es ist wichtig, dass jedes Peptid-Epitop und jede Peptidkonzentration an einem einzelnen Rohr zugeordnet und diese eindeutig auf der Grundlage der erwarteten Fluoreszenz der Zellen in diesem Rohr erfaßt wird, weil die Fluoreszenz-Signatur des Clusters wird dieses Peptid zu definieren (wie in Tabelle 1 zum Beispiel).
      4. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C für 1 Stunde.
    2. Zellwasch
      1. 5 ml eiskaltem (4 º C) RPMI mit 5% FCS zu der Zellsuspension und resuspendieren Zellen durch Umdrehen des Röhrchens. Sorgfältig Unterlage der Zellsuspension mit 3 ml eiskaltem (4 ° C) FCS.
      2. Sedimentieren der Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C Verwenden langsame Beschleunigung und Bremsen, um die Schnittstelle des FCS zu gewährleisten und die Zellsuspension Lösung aufrechterhalten wird.
      3. Vorsichtig absaugen und dann das RPMIdie FCS mit einer Transferpipette, so dass die gewaschenen Zellpellets ungestört. Anmerkung: Die Verwendung einer Unterlage FCS zu Zellen zu waschen hilft sicherzustellen soviel Peptidlösung aus den Zellen wie möglich entfernt und dadurch Belichtung der Zellpopulation, um mehrere freie Peptide Begrenzung, wenn die Zellen gepoolt.
      4. Waschen der Zellen wieder: Resuspendieren der Zellpellets in 10 ml 4 º C RPMI mit 5% FCS. Sedimentieren der Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C Gießen Sie die Überstände.
      5. Pool alle Zellpopulationen in einem einzigen Rohr mit einer Pipette unter Verwendung von 6 ml 4 ° C RPMI mit 5% FCS. Sediment gesammelt Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C. Absaugen Überstand mit einer Transferpipette.
  6. CPD Zellmarkierung
    Anmerkung: An diesem Punkt sechs Intra-Assay Wiederholungen können durch Markierung Peptid gepulste Zellen mit 6 verschiedenen Konzentrationen der CPD erzeugt werden.
    1. In 11,4 ml 20 ° CRPMI mit 5% FCS zu der gepoolten Zellpellet resuspendieren sorgfältig mit einer Pipette.
    2. Fügen Sie 1,9 ml der Zellsuspension in 6, 10-ml-Röhrchen beschriftet AF, kümmert sich nicht um die obere Hälfte der Röhren zu benetzen.
    3. Um Zellen mit CPD beschriften, entfernen Sie die Rohrkappe und legte den Schlauch horizontal.
    4. In 92 ul PBS zu dem nicht benetzten Teil am oberen Ende des Rohres, und dieses Add Lager CPD (siehe Tabelle 4 für die Menge der Stammlösung in jedes Röhrchen zugeordnet).
    5. Das Röhrchen und mischen Sie die Zellsuspension mit dem Farbstoff schnell und gründlich durch Vortexen.
    6. . 2.6.3-2.6.5 Sie Schritte für die Stammlösungen der CPD in den in Tabelle 4 beschrieben bezeichnet Rohre Hinweis: Im Gegensatz CFSE und CTV, ist die CPD Kennzeichnung Konzentration nicht exakt linear zu der resultierenden Fluoreszenzintensität der markierten Zellen verwandt und so die Kennzeichnung Konzentration verwendet werden, um gleich weit Fluoreszenzspitzen von mehreren markierten Populationen zu erhalten, wurdeempirisch ermittelt (siehe Tabelle 4).
    7. Inkubiere Zellen für mindestens 5 min bei RT (20 ° C).
    8. Waschen der Zellen zweimal: Die Zellen auf 10 ml mit 20 ° C RPMI mit 5% FCS. Sedimentieren der Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei 20 ° C. Absaugen Überstand mit einer Transferpipette. Wiederholen.
    9. Pool alle Zellen in einer einzigen Röhre mit 8 ml 4 ° C RPMI mit 5% FCS mit einer Pipette. Sediment gesammelt Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C und absaugen des Überstandes mit einer Transferpipette.
  7. (Optional) PKH-26 Zellmarkierung
    Hinweis: Wenn Freihandelsabkommen kann nicht mit Zellen eine CD45 exprimieren allotypische Unterschied um Mäuse Gastgeber konstruiert werden, können sie mit PKH-26 markiert werden, um ihre Diskriminierung von Empfängerzellen zu ermöglichen.
    1. Hinzufügen von 2,9 ml 20 ° C PBS gepoolten Zellpellet zu resuspendieren und sorgfältig mit einer Pipette.
    2. In Zellsuspension auf eine nichtn benetzt 10-ml-Tube, kümmert sich nicht um die obere Hälfte der Röhre zu benetzen.
    3. Entfernen Sie die Rohrkappe und legte den Schlauch horizontal.
    4. In 58 ul Verdünnungsmittel C (im PKH-26-Farbstoff-Kit) auf die nicht benetzt Abschnitt an der Oberseite der Röhre, und diese 42 ul 1 mM Stamm PKH-26 hinzufügen.
    5. Das Röhrchen und mischen Zelllösung mit dem Farbstoff gründlich durch Rühren.
    6. Zellen, Inkubation für mindestens 10 min bei RT (20 ° C).
    7. Waschen der Zellen zweimal: Die Zellen auf 10 ml mit 20 ° C RPMI mit 5% FCS. Sedimentieren der Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei 20 ° C. Absaugen Überstand mit einer Transferpipette. Wiederholen.
  8. Injizieren Freihandelsabkommen in Wirtstiere
    Hinweis: Um die T-Zellreaktionen in vivo zu messen, werden FHA in Tieren, die eine aktive Immunantwort haben und in situ belassen bis zu 24 Std. Es ist entscheidend, dass die FHA werden ebenfalls in einem naiven Tier als negative Kontrolle injiziert.
    1. Die Zellen zählen und bei 2,5 x 10 8 Zellen pro ml in PBS. Injizieren Sie 200 ul von Zellen intravenös in Mäuse-Host, einschließlich einer naiven Tier als Kontrolle.

3. Durchflusszytometrie

  1. 18-24 Stunden nach der Injektion FTA Ernte Blut oder Milz (oder anderen Geweben von Interesse) von Host-Mäusen.
  2. Bereiten Einzelzellsuspension von Gewebe durch Maischen durch eine 70 um brütete Sieb mit einer 5 ml Spritzenkolben.
  3. Die Zellen mit bis zu 65 x 10 6 Zellen / ml in PBS, enthaltend 0,1% BSA.
  4. Verteilen von 100 &mgr; l Aliquots der Zellsuspension in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte zur Antikörpermarkierung.
  5. Label-Zellen mit Fluorochrom markierten Antikörper und fluoreszierende Sonden Lebensfähigkeit mit spektral kompatibel Fluoreszenz CFSE, CTV und CPD. Hinweis: Antikörper gegen Zellmarker wie B220 und Aktivierungsmarkern wie CD69 B sind für die B-Zell-Aktivierung zu messen, wenn mit Hilfe der FTA bis H T-Zellreaktionen zu messen 2. Fügen Sie einen Antikörper gegen CD45.1 und / oder wenn die Freihandelsabkommen CD45.2-und Host-Mäuse haben eine CD45 allotypische Unterschied.
  6. 100 l 2x Stammlösung von Antikörper / Lebensfähigkeit Farbstoffe (in PBS mit 0,1% BSA) bis 100 ul Aliquots von Zellen, gut mischen und Inkubation auf Eis (4 ° C) für 30 min.
  7. Waschen der Zellen: Sediment Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C Überstand zu entfernen. Die Zellen in 200 &mgr; l PBS, enthaltend 0,1% BSA, Sediment Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C Überstand zu entfernen.
  8. Die Zellen in einem Gesamtvolumen von 400 &mgr; l PBS, enthaltend 0,1% BSA, Filterzellen durch einen 70 &mgr; m-Mesh und durch Durchflusszytometrie analysiert Strömungs im Durchflußzytometer der Lage, die entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffen und Konjugate. Sammeln Sie bis zu 3 x 10 6 Lymphozyten-Ereignisse, um jede Zelle FTA-Cluster zu lösen und zu gewinnen genug Zellen für die statistischecal-Analyse. Hinweis: Stellen Sie sicher, alle typischen Steuerelemente (z. B. Einzelbunt Kontrollen) für die Durchflusszytometrie eingesetzt werden. Typischerweise erfordert CFSE Anregung aus einer blauen Laserquelle (in der Regel bei 488 nm) und Detektion mit Bandpass-Filter über 520 nm zentriert; CTV erfordert Anregung aus einem violetten Laserquelle (in der Regel bei 405 nm) und Detektion mit Bandpass-Filter über 450 nm zentriert; und CPD erfordert Anregung von einem roten Laserquelle (in der Regel bei 633 nm oder 640 nm) und Detektion mit Bandpass-Filter über 670 nm zentriert.

4. Datenanalyse

  1. Analysieren Durchflusszytometrie Daten mit Standard-Durchflusszytometrie-Software (siehe repräsentatives Ergebnis für ein Beispiel von der Art der Gating-Strategie beschäftigt).
  2. Für% spezifisch Tötung ermitteln Sie die Anzahl der Zellen in jeder Zelle FTA-Cluster mit MHC-Klasse-I-bindenden Peptide und der FTA-Cluster, die nicht gepulst wurden Peptid ("Null"), gepulst und mit folgender Formel zu berechnenSpezifische% Töten.
    Spezifische% Töten figure-protocol-1
    Anmerkung: In der obigen Formel "grundiert" bezieht sich auf Ziele von Tieren, die gedacht sind, um eine Immunantwort gegen die Zielpeptide "naiven" bezieht sich auf Ziele von naiven Tieren, "Peptid" bezieht sich auf Ziele mit Peptiden und "nil" gepulst bezieht sich auf Ziele nicht mit Peptiden gepulst.
  3. Für B-Zell-Aktivierung als Maß der T-H-Aktivität, die Berechnung der geometrischen mittleren Fluoreszenzintensität (GMFI) des CD69-Antikörper Fluoreszenz auf FTA B-Zellen mit MHC-Klasse-II-Bindungspeptide in "grundiert" Tiere und von diesem subtrahieren GMFI gepulst CD69 Expression auf den entsprechenden FTA-B-Zellen in "naiv" Tiere um ein Maß der T-H-Aktivität zu geben.
  4. Von den in den Schritten 4.2 und 4.3, die Verwendung erzeugt Statistikenmathematischen Tabellenkalkulationssoftware wie GraphPad Prism zu anderen quantitativen und qualitativen Parameter wie Fläche unter der Kurve und EC 50 (eine in der Tiefe Beschreibung, wie diese Berechnungen durchgeführt für AUC berechnen sind zu finden unter
    http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm, und EC50: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. htm? reg_the_ec50.htm).

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Ergebnisse

Als ein Beispiel der Verwendung des FHA-Assay wurde eine BALB / c-Maus, die mit rekombinantem Vaccinia-Virus (VV), das HIV-I-Epitope (VV-HIV) und Antworten auf die HIV-I-CTL-Epitope immunisiert, Gag, Gag mut, Env und Pol, der VV CTL-Epitope F2L und F2L mut, und die HIV-I T H-Zell-Epitop, Gag Th (wie unter 2 beschrieben) wurden mit einem 252-Parameter FTA-Assay (Abbildung 1B) bewertet. Epitop-Varianten Gag (Gag mut) und F2L (F2L mut) sind nicht im VV-HIV-Vektor exprimiert und daher ...

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Diskussion

Der Vorteil der FTA-basierten Assays ist, dass sie die Unterscheidung von> 250 lebensfähigen und funktionsZielZellPopulationen aus einer Wirtstier durch Durchflusszytometrie zu ermöglichen. Dies bietet ein Maß an Komplexität in vivo Durchflusszytometrie basierenden Assays, die bisher nicht möglich war vor. Dies wird in den 2 oben gezeigt Tierversuchen, in Reaktion auf 7 verschiedene virale Epitope bei 6 Konzentrationen könnten in Replikaten von 6 gleichzeitig in einem einzigen Tier erlaubt Parameter wie AUC ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von Project Grants # 1010395 (BQ und CP) und # 525431 (CR), und einem Programm Zuschuss # 455395 (CP) aus dem National Health and Medical Research Council of Australia, einem australischen Zentrum für Hepatitis-und HIV-Virologie EOI unterstützt 2012 Stipendium (CR und RJJ) und einem Zuschuss von der Gordon und Gretel Bootes Foundation (BQ und CR). Wir möchten Harpreet Vohra und Michael Devoy für ihre hervorragende Pflege des JCSMR FACS Labor danken, die australische Cancer Research Foundation Biomolekulare Ressourcenfazilität, JCSMR, ANU, für die Peptidsynthese, und Dr. David Boyle, CSIRO Animal Health Laboratories, Geelong, Australien für die Bereitstellung der Mutter HIV-Impfstoff-Aktien.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
RPMISigmaR8758
Fötales KälberserumSeranaFCS-500
CTVInvitrogenC34557
CFDA, SEInvitrogenC1157
CPDeBioscience65-0840-90
Anti-B220 PerCp-Cy5.5eBioscience110730
Anti-CD69 brillantes Violett 605Biolegend104529
PKH-26SigmaPKH26GL-1KT
VortexScientific Industries Inc
ZentrifugeEppendorf
Durchflusszytometer (Fortessa oder gleichwertig mit blauer, roter und violetter Laserquelle)BD Bioscience

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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