Die Fähigkeit, T-Zell-Antworten im Detail in vivo Überwachung ist wichtig für die Entwicklung des Verständnisses der Immunantwort. Hier beschreiben wir die Verwendung von fluoreszierenden Zielarrays (FHA) in einem in vivo-T-Zell-Assay,> 250 Parameter beurteilt gleichzeitig mittels Durchflusszytometrie.
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Methodenartikel
Die Verwendung von fluoreszierenden Ziel Arrays zur Beurteilung der T-Zell-Antworten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Fähigkeit, T-Zell-Antworten in vivo zu überwachen, ist wichtig für die Entwicklung des Verständnisses der Immunantwort und die Gestaltung der Immuntherapie. Hier beschreiben wir die Verwendung von fluoreszierenden Zielarrays (FTA)-Technologie, die Vitalfarbstoffe wie Carboxyfluoreszein Succinimidylester (CFSE), violetten Laser erregbar Farbstoffe (CellTrace Violett: CTV) nutzt und rote Laser erregbar Farbstoffe (Dye Cell Proliferation eFluor 670: CPD ) Etiketten Maus Lymphozyten in> 250 erkennbar fluoreszierenden Zellhaufen kombinato. Zellhaufen innerhalb dieser Freihandelsabkommen mit Haupthistokompatibilitäts (MHC)-Klasse-I und MHC-Klasse-II-bindenden Peptiden gepulst werden und dienen als Zielzellen für CD8 + und CD4 + T-Zellen, die jeweils damit. Diese FTA Zellen lebensfähig bleiben und voll funktionsfähig und kann daher in Mäuse verabreicht werden, um Beurteilung der CD8 + T-Zell-vermittelte Abtötung von Zielzellen und FTA CD4 + T-Zell-meditierten hel ermöglichenp von freien Zielzellen B-Zellen in Echtzeit in vivo durch Durchflusszytometrie. Da> 250 Zielzellen auf einmal geprüft werden, ermöglicht die Technik der Überwachung der T-Zell-Antworten gegen verschiedene Antigen-Epitope in verschiedenen Konzentrationen und in mehreren Wiederholungen. Als solche kann die Technik T-Zell-Antworten sowohl auf quantitative (zB der kumulativen Größe der Antwort) und eine qualitative (z. B.. Funktionelle Avidität und Epitop-Kreuzreaktivität der Antwort-) Pegel zu messen. Hier beschreiben wir, wie diese Freihandelsabkommen sind konstruiert und geben ein Beispiel, wie sie angewendet werden, um T-Zell-Antworten durch einen rekombinanten Pockenvirus-Impfstoff induziert beurteilen.
Einleitung
T-Zellen spielen eine zentrale Rolle in der adaptiven Immunantwort und werden oft für die Manipulation in der Immuntherapie richtet. CD4 + Effektor-T-Zellen reagieren auf fremde Antigen durch Sekretion von Zytokinen, die viele Aspekte der Immunität regulieren und kann auch direkt helfen, B-Zellen, Antikörper zu produzieren. CD8 + zytotoxischer T-Zellen (CTLs) können auch Fremdantigen reagieren durch Sekretion von Zytokinen und spielt eine zentrale Rolle bei der Abtötung von Zellen direkt ein fremdes Antigen exprimiert. Die grundlegende Interaktion, die diese T-Zell-Effektorfunktionen initiiert beinhaltet die Interaktion des T-Zell-Rezeptor (TCR)....
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Protokoll
Hinweis: Die Mäuse aus diesem Protokoll wurden gemäß den Richtlinien der Australian National University Tierversuche Ethikkommission und Mäuse behandelt wurden durch Genickbruch getötet.
1. Dye-und Peptid Vorbereitung
- Dye Vorbereitung
Hinweis: Die Farbstoffe werden in unterschiedlichen Konzentrationen vorverdünnt die Kennzeichnung von Zellen an diskreten Fluoreszenzintensitäten ermöglichen. CFSE ist sieben Konzentrationen über 3,5-fach serielle Verdünnungen verwendet und CTV und CPD sind an sechs verschiedenen Konzentrationen über 3,7-fache serielle Verdünnungen verwendet (siehe Tabellen 2-4). Die Aktien....
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Ergebnisse
Als ein Beispiel der Verwendung des FHA-Assay wurde eine BALB / c-Maus, die mit rekombinantem Vaccinia-Virus (VV), das HIV-I-Epitope (VV-HIV) und Antworten auf die HIV-I-CTL-Epitope immunisiert, Gag, Gag mut, Env und Pol, der VV CTL-Epitope F2L und F2L mut, und die HIV-I T H-Zell-Epitop, Gag Th (wie unter 2 beschrieben) wurden mit einem 252-Parameter FTA-Assay (Abbildung 1B) bewertet. Epitop-Varianten Gag (Gag mut) und F2L (F2L mut) sind nicht im VV-HIV-Vektor exprimiert und daher .......
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Diskussion
Der Vorteil der FTA-basierten Assays ist, dass sie die Unterscheidung von> 250 lebensfähigen und funktionsZielZellPopulationen aus einer Wirtstier durch Durchflusszytometrie zu ermöglichen. Dies bietet ein Maß an Komplexität in vivo Durchflusszytometrie basierenden Assays, die bisher nicht möglich war vor. Dies wird in den 2 oben gezeigt Tierversuchen, in Reaktion auf 7 verschiedene virale Epitope bei 6 Konzentrationen könnten in Replikaten von 6 gleichzeitig in einem einzigen Tier erlaubt Parameter wie AUC .......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von Project Grants # 1010395 (BQ und CP) und # 525431 (CR), und einem Programm Zuschuss # 455395 (CP) aus dem National Health and Medical Research Council of Australia, einem australischen Zentrum für Hepatitis-und HIV-Virologie EOI unterstützt 2012 Stipendium (CR und RJJ) und einem Zuschuss von der Gordon und Gretel Bootes Foundation (BQ und CR). Wir möchten Harpreet Vohra und Michael Devoy für ihre hervorragende Pflege des JCSMR FACS Labor danken, die australische Cancer Research Foundation Biomolekulare Ressourcenfazilität, JCSMR, ANU, für die Peptidsynthese, und Dr. David Boyle, CSIRO Animal Health Laboratories, Geelong, Australien für die Bere....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Fötales Kälberserum | Serana | FCS-500 | |
| CTV | Invitrogen | C34557 | |
| CFDA, SE | Invitrogen | C1157 | |
| CPD | eBioscience | 65-0840-90 | |
| Anti-B220 PerCp-Cy5.5 | eBioscience | 110730 | |
| Anti-CD69 brillantes Violett 605 | Biolegend | 104529 | |
| PKH-26 | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| Vortex | Scientific Industries Inc | ||
| Zentrifuge | Eppendorf | ||
| Durchflusszytometer (Fortessa oder gleichwertig mit blauer, roter und violetter Laserquelle) | BD Bioscience |
Referenzen
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R.
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Nachdrucke und Genehmigungen
