Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Kombinierte DNA-RNA-Leuchtstoff

27.7K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/51628

⸱

14. Juni 2014

 , 
1Department of Reproduction and Development, Erasmus MC - University Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) erlaubt den Nachweis von Nukleinsäuren in ihrer natürlichen Umgebung innerhalb der Zellen. Wir beschreiben ein Protokoll für den kombinierten, gleichzeitigen Nachweis von RNA und DNA mit Hilfe von FISH, die verwendet werden können, um X-Chromosom Inaktivierung in embryonalen Maus-Stammzellen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) ist eine Technik, die die molekularen Nachweis von Nukleinsäuren in Zellen ermöglicht. FISH DNA ist oft in der Zytogenetik und Krebsdiagnostik verwendet und können Aberrationen des Genoms, die oft wichtige klinische Auswirkungen erkennen. RNA-FISH können verwendet werden, um RNA-Moleküle in Zellen zu erfassen und wichtige Einblicke in die Regulation der Genexpression zur Verfügung gestellt. Die Kombination von DNA-und RNA FISH innerhalb der gleichen Zelle ist technisch anspruchsvoll, da die Bedingungen für DNA-FISH vielleicht zu hart für zerbrechlich, einzelsträngige RNA-Moleküle sein. Wir präsentieren hier eine leicht anwendbare Protokoll, das die kombinierte, simultane Detektion von Xist RNA und DNA von den X-Chromosomen kodiert ermöglicht. Diese kombinierte DNA-RNA-FISH-Protokoll kann wahrscheinlich andere Systeme, bei denen sowohl RNA und DNA nachgewiesen werden müssen aufgebracht werden.

Einleitung

Studieren Zellen und Gewebe mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) hat sich seit ihrer Einführung in den späten 1970er Jahren ein, konnten die Forscher um Gene, Chromatin-Organisation und Genexpression auf subzellulärer Ebene zu studieren. DNA-FISH wird häufig in Zytogenetik, Karyotypisierung 2, 3 und Krebsdiagnostik Präimplantations-Screening-4 verwendet wird, und hat eine wichtige Rolle in der Molekularforschung 6.5, da es die Detektion von Nukleinsäuren in ihrer natürlichen Umgebung ermöglicht. Einzelzell-Expressionsanalyse von RNA-FISH können native primären Transkripte zu erkennen und nicht-kodierenden RNAs transkribiert Chromosomen aus und bietet Vorteile gegenüber anderen Techniken, die Genexpression auf Bevölkerungsebene Einschätzung liegen, wie beispielsweise quantitative RT-PCR, genomweite Expressionsanalyse oder Northern Blot . Durch die Visualisierung RNA-Transkripte, die direkt aus ihren Ursprungsorten hat es zum Beispiel gewesen,bemerkt, dass die Genexpression stochastischen 7, und kann manchmal allelspezifische 8 sein. Verbesserungen in der Technik sogar erlaubt den Nachweis und die Quantifizierung der einzelnen mRNA-Moleküle innerhalb von Zellen 9-11.

Das Grundprinzip besteht aus FISH-Hybridisierung von Nukleinsäuren in der Zelle zu einer Nukleinsäuresonde mittels hochspezifische Watson und Crick Basenpaarung. Die Sonde kann entweder direkt oder indirekt erfasst, was zu einem Signal, das mikroskopisch sichtbar gemacht werden kann. Anfängliche Versuche bestand aus radioaktiv markierten Sonden, die Nachteile der Grundlage von Sicherheitsfragen, begrenzte räumliche Auflösung und die Fähigkeit, nur ein Ziel zu einer Zeit zu erfassen 12-14 hatten. Die weitere Entwicklung der nicht-radioaktiven Labels, darunter Fluorochrome, Haptene, und Enzyme, hat die weit verbreitete Nutzung von FISH als Routine Molekularbiologie Technik erlaubt. Die FISH-Sonde kann entweder direkt mit fluoroch gekennzeichnet werdenromes durch chemische Verknüpfung der Fluoreszenzmoleküle an Nukleinsäure-Sequenzen 15 und die Integration der fluoreszierend markierten Nucleotide 16-19, oder die Sonde kann indirekt nach Integration Haptene (wie Biotin und Digoxigenin) und immunologischen Nachweis von Haptenen durch Hapten spezifischen Antikörper konjugiert visualisiert fluoreszierenden Reportermoleküle 20-21. Der letztere Ansatz erlaubt eine Signalverstärkung durch die Verwendung mehrerer Schichten aus fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die verwendet werden, um das ursprüngliche Signal zu verstärken, und ermöglicht den Nachweis von RNA-Spezies, die auf niedrigem Niveau exprimiert werden. Durch die Kombination von direkten und indirekten Markierungstechniken und verschiedene Haptene können mehrere Ziele gleichzeitig innerhalb der gleichen Zelle sichtbar gemacht werden.

Einer der wichtigsten Schritte bei der FISH-Protokolle ist die Hybridisierung der Sonde an ihr Ziel. Obwohl in der Theorie, eine Sonde zu binden, die spezifisch nur an sein Ziel in der Praxis diese Spezifitätist nicht immer erreicht, da Sonden, um homologe Regionen binden und Hybridisierungsbedingungen nicht immer ideal für eine bestimmte DNA-Region oder RNA Spezies. Post-Hybridisierungswaschanlagen sind daher von besonderer Bedeutung, da sie die Stringenz der FISH-Verfahren zu erhöhen, und kann nicht-spezifische Bindung von FISH-Sonden, die in einem hohen Pegel von Hintergrundrauschen führen würde. Wie RNA-Moleküle werden Einzelstrang können sie leicht zu einer FISH-Sonde hybridisiert werden. Im Gegensatz dazu benötigt das doppelsträngige DNA-Molekül einen ersten Denaturierungsschritt, wonach eine Sonde hybridisieren kann. Dies wird normalerweise durch Erhitzen der Probe, die Denaturierung der DNA Ergebnisse erzielt. Doch unter diesen harten Bedingungen kann zerbrechlich, einsträngige RNA-Moleküle verloren. Daher kombinierten DNA-RNA-FISH erfordert erhebliche Optimierung der Bedingungen und ist technisch anspruchsvoll gegenüber der getrennten Erkennung von nur RNA oder DNA.

Hier haben wir Präsentationta detailliertes Protokoll der kombinierten, gleichzeitigen DNA-RNA-FISH, die uns erlaubt hat, X-Chromosom-Inaktivierung (XCI) bei der Differenzierung von weiblichen Maus embryonale Stammzellen 22-24 studieren. XCI ist ein entscheidender epigenetischen Mechanismus für weibliche Embryonalentwicklung 25 und führt heterochromatinization und somit Silencing eines der beiden X-Chromosomen in weiblichen Individuen 26-27. Wesentlich für dieses Verfahren ist die nicht-kodierende RNA Xist 28-30, die durch die RNF12 22-23 und 24 REX1 Proteine ​​reguliert wird. Xist Expression wird über die Zukunft inaktiven X-Chromosom (Xi) während der embryonalen Entwicklung oder bei der ES-Zelldifferenzierung in vitro hochreguliert und kann entlang der X-Chromosom verteilt und dadurch gewinnen Chromatin Remodeling Enzyme, die in der Transkriptionsherunterfahren des X-Chromosoms 31 führen. Diese Ausbreitung Xist RNA durch RNA-FISH als Beschichtung des X-Chromosom visualisierteinige, die auch als Xist Wolke bezeichnet wird. Da weibliche ES-Zellen können einem ihrer X-Chromosomen durch genomische Instabilität zu verlieren, wir und andere kombinierte DNA-RNA-FISH eingesetzt haben, XCI zu untersuchen, um sicherzustellen, dass nur karyotypisch stabile Zellen werden in der Analyse dieses wichtigen Prozesses 22,32 bewertet -34. Wie in jedem molekularbiologischen Technik haben mehrere ausgezeichnete Protokolle veröffentlicht 35-38. Hier präsentieren wir unsere Methode, ausgehend von der Induktion der Differenzierung in Maus-ES-Zellen, Fixierung von Zellen, die Kennzeichnung von FISH-Sonden durch Nick-Translation, Vorbehandlung von fixierten Zellen zu ermöglichen Permeabilisierung und anschließender Sondenaufnahme, Hybridisierung der Sonde an die Ziel und schließlich Detektion der Sonde durch Fluoreszenz-markierten Antikörpern. Die hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Gläubigen Erkennung von Xist RNA und das X-Chromosom innerhalb einer Frist von zwei Tagen, und die Grundlagen dieser Technik kann wahrscheinlich angepasst werden otihre Systeme und Forschungsbereiche.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

1. Induktion der Differenzierung in weiblich embryonalen Stammzellen zu X-Chromosom-Inaktivierung herbei

HINWEIS: Weiblich embryonalen Stammzellen der Maus (auf Anfrage erhältlich) werden unter Standardbedingungen auf ES-Zellkulturschalen verkleistert mit embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) beschichtet gewachsen. Wir hier davon aus, dass der Leser mit Standardzellkulturtechniken 39-41 vertraut ist. Um die Differenzierung zu induzieren, werden ES-Zellen in T25 Schalen gezüchtet aus den MEFs getrennt werden, und wird in Differenzierungsmedium plattiert werden.

  1. Entfernen ES-Medium aus der ES-Zell-Kultur, und zweimal waschen mit Zellkultur PBS.
  2. 1,5 ml Trypsin-EDTA (37 ° C vorgewärmt) und inkubieren Zellen bei 37 ° C für 7 min. Nach 3,5 min, schütteln die Schale vorsichtig, brechen die Kolonien.
  3. Inaktivierung des Trypsin-EDTA durch Zugabe von 3,5 ml Differenzierungsmedium zu den Zellen. Pipette Zellen nach oben und unten, um eine einzelne Zelle Lösung zu erhalten, und sammelnin einem 15-ml-Tube. Spin für 5 min bei 200 × g gesammelt und Zellen in 10 ml Differenzierungsmedium.
  4. Hinzufügen Zellsuspension auf eine nicht-gelatinierten Kulturschale, und Inkubation für 1 h in einem Zellkulturbrutschrank. HINWEIS: MEFs in der Lage, mit dem nicht-gelatinierten Kulturschale anhaften, während ES-Zellen in Suspension verbleiben.
  5. In der Zwischenzeit, fügen sterilisierte Glasdeckgläser (24 x 24 mm) auf 6-Well-Platten mit 0,2% Gelatine und inkubieren minimal 5 min bei Raumtemperatur.
  6. Nach 1 Stunde Sammeln des Überstands des vorgalvanisierten ES-Zellkultur, die hauptsächlich aus wird der nichthaftenden ES-Zellen. Platte ES-Zellen zu 6-well-Platten mit Deckgläsern. HINWEIS: Verwenden Sie ⅙ th einer konfluenten T25 Gericht für 6 Vertiefungen einer 6-Well-Platte. Dies wird eine Differenzierung konfluenten gut nach 3 Tagen der Differenzierung zu ermöglichen. Änderungsmedium auf einer täglichen Basis. Für längere Zeit Differenzierungskurse, Platte vor, vernickelt ES-Zellen in Differenzierungsmedium in bakteriellen Gerichte und incubaß auf einem Schüttler Zelle in den Zellkulturbrutschrank integriert. Dies ermöglicht es den Zellen, embryonale Körper, die 1-2 Tage vor der Fixierung auf Deckgläsern ausplattiert werden können zu bilden.

2. Fixierung von differenzierten ES-Zellen für spätere DNA-RNA-FISH-Analyse

  1. Entfernen Differenzierungsmedium von Differenzierung Kulturen, und zweimal waschen mit Zellkultur PBS. HINWEIS: In den PBS sorgfältig verhindern, dass die Zellen weggewaschen.
  2. Entfernen Zellkultur PBS und fixieren Zellen durch Zugabe von 4% Paraformaldehyd (PFA) / PBS und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. ACHTUNG: PFA ist giftig und kann erhebliche gesundheitliche Risiken verursachen, wenn sie eingeatmet oder wenn sie in Kontakt mit Haut oder Augen. Darüber hinaus ist PFA krebserregend.
  3. Entfernen Sie 4% PFA / PBS und Deckgläser 3x waschen mit 70% Ethanol. HINWEIS: Richtig Waschen ist wichtig, da eine Spur von PFA wird mit anschließender FISH Schritte stören. Deckgläser in 70% Ethanol bei -20 ° C für mehrere Monate vor der F gespeichert werdenISH-Analyse.

3. Markierung von DNA-Sonden für FISH Experimente

HINWEIS: Besorgen Sie sich ein DNA-Fragment mit dem Gen von Interesse (Mindestlänge> 2 kb für die RNA-FISH, oder> 20 kb für die DNA-FISH), oder eine BAC für das Gen von Interesse. Für RNA-Nachweis kann eine kleinere Sonde ausreichend sein im Vergleich zu den DNA-Nachweis, da wahrscheinlich die Transkription in mehreren Transkripte, die gleichzeitig detektiert werden können führen. Für ein starkes Signal auf der Einzelkopie-DNA-Strang wird eine längere Sonde erforderlich ist, um eine ausreichende Anzahl von einge Haptene erkennen. Vorzugsweise wird ein nicht-transkribierte genomische Region für die Gestaltung der DNA-Sonde ausgewählt. Wenn außerdem die Verwendung einer kleineren Sonde, um die RNA zu detektieren, wird es verhindert, dass die genomische Loci von der die RNA transkribiert wird, die in der kombinierten DNA-RNA-FISH Ansatz erkannt, obwohl dies nicht ganz ausgeschlossen werden kann. Um zu erkennen, Maus Xist wurde ein 5,5 kb cDNA-Sonde verwendet. Für detbschnitt des X-Chromosoms, BAC mehrere Sonden verwendet werden. Gute Ergebnisse wurden mit einer Mischung aus BAC RP23-100E1 und 474E4-BAC CT7, die in der Nähe des Ortes angeordnet sind Xist ermittelt. Je nach dem Gen oder Chromosom von Interesse ist, kann mehrere unterschiedliche Sonden erforderlich, um optimale Ergebnisse zu erhalten. Immer, wenn die Arbeit mit Materialien, die für RNA-FISH verwendet werden soll, verwenden Sie sterile Filterspitzen, RNase-freiem H 2 O, und die Arbeit in einer sauberen Umgebung.

  1. Nimm 1 ug DNA und verdünnt in H 2 O in einem Gesamtvolumen von 16 ul. In 4 ul von Digoxigenin oder Biotin Markierungslösung (siehe Reagenzien), durch Vortexen mischen und Inkubation bei 16 ° C für 90 min. HINWEIS: Die Biotin oder Digoxigenin markierten Nukleotiden wird nun durch Nick-Translation eingebaut werden.
  2. In der Zwischenzeit bereiten G50 Spalten auf nicht-integrierte Nukleotide zu entfernen. Nehmen Sie ein 2-ml-Spritze, entfernen Sie den Stempel, und fügen sterilisiert Baumwolle in die Spritze. In G50-Kugeln in Lösung to Füllen der Spritze, Spritze in einem 15 ml-Zentrifugenrohr und bei 642 g für 1 min. HINWEIS: Rund 80% der Spritze sollte jetzt mit G50 gefüllt werden. Wiederholen Sie, wenn weniger G50 vorhanden ist.
  3. Nach 90 min werden 40 ul H 2 O zu der Nick-Translation Reaktionsgemisch, und fügen Sie die Reaktion auf die Säule G50. Fügen Sie ein Leerrohr unter der Spalte und Zentrifugieren bei 642 g für 2 min. Die Strömung durch Sammeln in einem Reaktionsrohr.
  4. Messung des Volumens der Strömung durch mit einer Pipette, und geben H 2 O auf ein Gesamtvolumen von 200 &mgr; l zu erreichen. Ausfällung der Strömung durch Zugabe von 13,3 ul Lachssperma-DNA (10 mg / ml), 13,3 ul Hefe-tRNA (10 mg / ml), 26,7 &mgr; l Maus Cot-1-DNA (1 mg / ml) und 28 ul 2 M NaAc, pH-Wert 5.6. Mischen durch Vortexen, und fügen Sie 533 ul eiskaltem 100% Ethanol. Schütteln des Röhrchens und Zentrifuge bei 16.200 × g für 30 min bei 4 ° C
  5. Entfernen Sie den Überstand und Wasch Pellet zweimal mit 70% Ethanol. Zentrifugieren bei 16.200 × g für 5 min bei4 ° C und an der Luft trocknen die Pellets. Dann werden 50 &mgr; l Hybridisierungslösung + 50, und bei 37 ° C für 30 min bis Auflösen zu erleichtern. HINWEIS: Die markierte Sonde kann für mehrere Jahre bei -20 ° C gelagert werden ACHTUNG: 50 + Hybridisierungslösung enthält Formamid, das giftig ist, kann die Haut, die Augen und die Atemwege reizen, und ist auch ein teratogen.

4. Permeabilisierungs, Vorbehandlung und Hybridisierung der fixierten Zellen für den kombinierten DNA-RNA-FISH

  1. Rehydrieren fixierten Zellen auf Deckgläsern, indem 70% Ethanol und die Zugabe von Zellkultur PBS auf die 6-well-Platten. Inkubation für 5 min. Wiederholen insgesamt drei Mal.
  2. Zellkultur-PBS entfernen, und fügen Sie 0,2% Pepsin zu den 6-Well-Platten, um die Zellen permeabilisiert. Inkubieren Platten mit 6 Vertiefungen in einem Wasserbad bei 37 ° C für 4 min. Entfernen Pepsin, und inaktivieren mit RNAse freien H 2 O.
  3. Postfix-Zellen durch Inkubation mit 4% PFA / PBS für 5 min bei Raumtemperatur. Nach fixatiauf, zweimal waschen mit Zellkultur PBS für 5 min.
  4. Dehydratisieren Zellen durch Inkubation mit 70% Ethanol für 3 min, 90% Ethanol 3 min und 100% Ethanol für 3 min. Überdeckgläser aus der 6-Well-Platten und an der Luft trocknen Deckgläser für einige Minuten.
  5. Alter Zellen durch Inkubation Deckgläser bei 65 ° C für 1 Stunde auf einer Wärmeplatte.
  6. Pre-FISH-Sonde hybridisieren, mit Maus-Cot-1 DNA durch Addition zu jedem Deck analysiert, 25 ul 50 + Hybridisierungslösung, 0,5 &mgr; l Maus-Cot-1-DNA, 1 &mgr; l Biotin-markierten Sonde Xist und 1 &mgr; l Digoxigenin markierten BAC-Sonde Erfassung der X-Chromosom. Vortexen und Denaturierung bei 99 ° C für 5 min. Inkubation sofort auf 37 ° C für 45 min, damit Cot-1-DNA zu hybridisieren, um in den Sonden vorhandenen Sequenzen wiederholen.
  7. Nach der Alterung Stelle 50 ul Denaturierungspuffer (bestehend aus 70% formamide/2x SSC/10 mM Phosphatpuffer) auf einem Glasträger und Deckgläser gelegt oben mit Zellen gegen towards Denaturierung Puffer. Inkubieren bei 65 ° C für 2 min.
  8. In Deckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und Post-fix-Zellen durch Inkubation in eiskaltem 70% Ethanol für 5 min.
  9. Dehydratisieren Zellen durch anschließende Inkubation in 70% Ethanol für 3 min, 90% Ethanol 3 min und 100% Ethanol für 3 min. Deckgläser entfernen von 6-Well-Platten und der Luft trocknen lassen für einige Minuten.
  10. Finde Pre-hybridisierten Sonde auf einem Glasobjektträger und Deckglas auf inkubiert. Die Objektträger in einer feuchten Kammer mit 50 ml 50% formamide/2x SSC gefüllt und inkubiert über Nacht bei 37 ° C.

5. Post-Hybridisierung Waschanlagen und Antikörper-vermittelte Erkennung von Probe

  1. Füllen 6-Well-Platten mit 2x SSC und Pre-warmen bis 42 ° C Hinzufügen Deck nach Inkubation über Nacht, und Inkubieren bei 42 ° C für 5 min.
  2. Entfernen 2x SSC, und Inkubieren Deckgläser mit 50% formamide/2x SSC für 10 min bei 42 ° C. Wiederholen Sie insgesamt 3-mal (30 min Waschen insgesamt).
  3. Entfernen von 50% formamide/2x SSC und Waschen Folien mit Tris-Kochsalzlösung-Tween (TST) für 2 x 5 min bei Raumtemperatur.
  4. Punkt 50 ul Tris-Kochsalzlösung-BSA (TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation Kopf für die Sperrung während 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchteten dunkle Kammer.
  5. Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST.
  6. Punkt 50 ul Schaf-anti-Dig-Antikörper (1:500 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation upside-down für den ersten Schritt der Inkubation während 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchteten dunkle Kammer.
  7. Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST.
  8. Punkt 50 ul Kaninchen-Anti-Schaf-Antikörper konjugiert mit FITC (1:250 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation Kopf für den zweiten Schritt der Inkubation während 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchteten dunkle Kammer .
  9. Transfer Deckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST.
  10. Spot 50 ul Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper, konjugiert mit FITC (1:250 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger und Deckgläser inkubieren Kopf zum dritten Inkubationsschritt bei 30 min bei Raumtemperatur in einem TST-befeuchteten Dunkelkammer .
  11. Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST.
  12. Punkt 50 ul Maus-Anti-Biotin-Antikörper (1:200 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation Kopf für den vierten Schritt während der Inkubation 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchteten dunkle Kammer.
  13. Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST.
  14. Punkt 50 ul Esel-Anti-Maus-Antikörper konjugiert mit Rhodamin (1:250 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation Kopf zum fünften Inkubationsschritt während 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchtet dunklen chambäh.
  15. Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST.
  16. Punkt 50 ul Ziege-anti-Pferd-Antikörper konjugiert mit Rhodamin (1:250 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation Kopf zum sechsten Schritt die Inkubation während 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchteten dunkle Kammer . HINWEIS: die Ziege-anti-Pferd-Antikörper die Esel-anti-Maus-Antikörper zu erkennen; wenn verfügbar, um den Forscher, wird ein Ziege-anti-Antikörper Esel so gut funktionieren.
  17. Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST. Waschen Sie weitere 5 min mit Tris-Kochsalzlösung (TS).
  18. Dehydratisieren Zellen durch anschließende Inkubation in 70% Ethanol für 3 min, 90% Ethanol 3 min und 100% Ethanol für 3 min. Deckgläser entfernen von 6-Well-Platten und der Luft trocknen lassen für einige Minuten.
  19. Spot eine Tropfen Eindeckmedium mit DAPI (siehe Reagenzien) auf einen Objektträger und Deckglas fügen Kopf an der Spitze. Siegel Dias mit Nagellack undbeurteilen FISH-Ergebnisse durch Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 1).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Verwendung des vorstehend erwähnten Protokolls für den kombinierten DNA-RNA-FISH, waren wir in der Lage, X-Chromosom Inaktivierung der Differenzierung embryonaler Stammzellen weiblichen visualisieren. Fig. 1 zeigt ein repräsentatives Beispiel für ein DNA-RNA-FISH-Experiment, wo wir beide Xist (was detektiert als sogenannte Xist RNA Wolke auf dem inaktiven X-Chromosom und einem basalen Transkriptionspunkt auf dem aktiven X-Chromosom) und einer Region des X-Chromosoms, die als punktSigna...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Kombinierte DNA-RNA-FISH technisch eine Herausforderung sein, die Bedingungen für DNA-FISH können zu hart für weniger stabile RNA-Moleküle sein. Es wurden verschiedene Ansätze angewendet, um sowohl DNA als auch RNA in einer Zelle zu untersuchen, unter Umgehung der Notwendigkeit einer gleichzeitigen Inkubation mit Sonden Erfassen sowohl der DNA und RNA. Beispielsweise in einer Überlagerungsansatz wird zuerst RNA-FISH durchgeführt, und die Zellen abgebildet werden, und die Koordinaten genommen werden. Anschließend werden ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Die Autoren danken allen bisherigen und aktuellen Mitgliedern der Abteilung für Reproduktion und Entwicklung des Erasmus MC für die hilfreichen und anregenden Diskussionen in den letzten Jahren. Wir möchten uns auch bei den drei anonymen Rezensenten für ihr hilfreiches Feedback bedanken. Die Arbeit im Labor in Gribnau wird durch eine Förderung des niederländischen Forschungsrats (NWO-VICI) und einen ERC Starting Grant unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Embryonale Stammzellenwerden auf Anfrage zur Verfügung gestellt
Embryonale Fibroblastenkönnen aus E13.5-Embryonen oder über kommerzielle Quellen z. B. Millipore
ES Zellkulturmediumgewonnen werdenDMEM, 15 % fötales Kälberserum, 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin, nicht-essentielle Aminosäuren, 0,1 mM γ-Mercaptoethanol und 1.000 U/ml LIF. Filter, sterilisieren und bei 4 ° lagern; C für maximal 2 Wochen.
LIFChemiconESG1107
DMEMInvitrogen11960085
Fötales KälberserumInvitrogen10099141
Penicillin– Streptomycin (100x)Invitrogen15140-122
Nicht-essentielle AminosäurenInvitrogen11140-050
γ-MercaptoethanolSigma-AldrichM7522
ES ZelldifferenzierungsmediumIMDM-Glutamax, 15% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum, 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin, nicht-essentielle Aminosäuren, 37,8 μ l/L Monothioglycerin und 50 μ g/ml Ascorbinsäure
IMDM-GlutamaxInvitrogen31980-030
Ascorbinsäure (50 mg/ml)Sigma-AldrichA4403
MonothioglycerinSigma-AldrichM6145
T25 ZellkulturschalenGreiner Bio-one690160
6-Well-ZellkulturschalenGreiner Bio-one662160
PBSSigma-AldrichD8537
Trypsin-EDTA 0,25 % (v/v) Trypsin/0,2 % (w/v) EDTA in PBSGibco25200-056
Falcon-RöhrchenFalcon 352196
24 x 24 mm DeckgläserMenzle780882
GelatineSigma-AldrichG1890-100Gbereiten Sie eine 0,2 %ige Gelatine/Zellkultur-PBS-Lösung vor und autoklavieren
PepsinSigma-AldrichP7000Verdünnung auf 0,2 % in 0,01 M HCl (pH 2,0)
absolut 100 % EthanolSigma-Aldrich32221-2,5Lverwendet absolut 100 % Ethanol und RNAse freies Wasser zur Herstellung von 70 % und 90 % Ethanol
Lösungen RNAse freies WasserBaxterTKF7114
sterile FilterspitzenRainin Bio CleanGP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
Digoxigenin-Markierungskit (DIG-Nick-Übersetzung)Roche11745816910
Biotin-Markierungskit (Biotin Nick-Übersetzung)Roche11745824910
Sephadex G50Sigma-AldrichG5080
ml SpritzeBD Plastipak300013
sterilisierte Baumwolle
EppendorfTuben Eppendorf
Hefe tRNA 10 mg/mlInvitrogen15401-029
Lachs Spermien DNA 10 mg/mlInvitrogen15632-011
Maus cot-1 DNA 1 mg/mlInvitrogen18440-016
Eppendorf Tisch-MikrozentrifugeEppendorfModell 5417R
Eppendorf gekühlte ZentrifugeEppendorfModell 5810R
2 M NaAc, pH 5,6Sigma-AldrichS7670
50+ Hybridisierungslösung50 % Formamid, 2x SSC, 50 mM Phosphatpuffer pH 7, 10 % Dextransulfat pH 7
FormamidAcros organische Stoffe3272350000
DextransulfatFluka31403
10 mM Phosphatpuffer, pH 757,7 ml 1 M Na2HPO4 und 42,3 ml 1 M NaH2PO4; DEPC-behandeltes Wasser und Autoklav-Denaturierungspuffer
verwenden 70% Formamid/2x SSC/10 mM Phosphatpuffer pH 7
Tween-20Sigma-AldrichP2287
2 M Tris pH 7,5 Lösung
Tris-Kochsalzlösung-Tween Waschlösung (TST)100 ml 10x Kochsalzlösung, 50 ml 2M Tris, 500 μ l Tween-20, RNAse freies Wasser bis 1 l
10x Kochsalzlösungzugeben, 85 g NaCl in 1 l RNAse freies H2O aufzulösen und
Tris-Kochsalzlösung-BSA (TSBSA)500 μ autoklavieren; L 10x Kochsalzlösung, 250 μ l 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse frei H2O
BSA, gereinigt, 100xNew England BiolabsB9001S
Diagnosticsverwendet 1:500 verdünnt in TSBSA
Kaninchen-Anti-Schaf-Antikörper, konjugiert mit FITCJackson Laboreverwenden 1:250 verdünnt in TSBSA
Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper, konjugiert mit FITCJackson verwenden 1:250 verdünnt in TSBSA
Maus-Anti-Biotin-AntikörperRoche Diagnosticsverwenden 1:200 verdünnt in TSBSA
Esel-Anti-Maus-Antikörper, konjugiert mit RhodaminJackson Laboreverwenden 1:250 verdünnt in TSBSA
Ziegen-Anti-Pferde-Antikörper, konjugiert mit RhodaminJackson Laboreverwenden 1:250 verdünnt in TSBSA
Tris-Kochsalzlösung (TS)10 ml 10x Kochsalzlösung, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse freies H2O
Vectashield Eindeckmedium mit DAPIVectorlabsH-1200
Nagellack
fluoreszierendes Miscroskop
der weiblichen Maus der Maus Sie 2 30120086 Schaf-Anti-Ausgrabungs-Antikörper Roche Labore

Referenzen

  1. Rudkin, G. T., Stollar, B. D. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence. Nature. 265, 472-473 (1977).
  2. Imataka, G., Arisaka, O. Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY). Cell Biochem Biophys. 62, 13-17 (2012).
  3. Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
  4. Mastenbroek, S., et al. Preimplantation genetic screening: a systematic review and meta-analysis of RCTs. Hum Reprod Update. 17, 454-466 (2011).
  5. Martins-Taylor, K., Xu, R. H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 22-27 (2012).
  6. Rens, W., et al. Resolution and evolution of the duck-billed platypus karyotype with an X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5 male sex chromosome constitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16257-16261 (2004).
  7. Munsky, B., et al. Using gene expression noise to understand gene regulation. Science. 336, 183-187 (2012).
  8. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  9. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Rep. 46, 65-72 (2013).
  10. Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
  11. Femino, A. M., et al. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  12. Buongiorno-Nardelli, M., Amaldi, F. Autoradiographic detection of molecular hybrids between RNA and DNA in tissue sections. Nature. 225, 946-948 (1970).
  13. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  14. John, H. A., et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature. 223, 582-587 (1969).
  15. Bauman, J. G., et al. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  16. Wiegant, J., et al. In situ hybridization with fluoresceinated DNA. Nucleic Acids Res. 19, 3237-3241 (1991).
  17. Langer, P. R., et al. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 6633-6637 (1981).
  18. Manuelidis, L., et al. High-resolution mapping of satellite DNA using biotin-labeled DNA probes. J Cell Biol. 95, 619-625 (1982).
  19. Kislauskis, E. H., et al. Isoform-specific 3'-untranslated sequences sort alpha-cardiac and beta-cytoplasmic actin messenger RNAs to different cytoplasmic compartments. J Cell Biol. 123, 165-172 (1993).
  20. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, 7331-7335 (1982).
  21. Corput, M. P., et al. Fluorescence in situ hybridization using horseradish peroxidase-labeled oligodeoxynucleotides and tyramide signal amplification for sensitive DNA and mRNA detection. Histochem Cell Biol. 110, 431-437 (1998).
  22. Jonkers, I., et al. RNF12 is an X-Encoded dose-dependent activator of X chromosome inactivation. Cell. 139, 999-101 (2009).
  23. Barakat, T. S., et al. RNF12 activates Xist and is essential for X chromosome inactivation. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Gontan, C., et al. RNF12 initiates X-chromosome inactivation by targeting REX1 for degradation. Nature. 485, 386-390 (2012).
  25. Lyon, M. F. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L). Nature. 190, 372-373 (1961).
  26. Barakat, T. S., Gribnau, J. X. chromosome inactivation in the cycle of life. Development. 139, 2085-2089 (2012).
  27. Augui, S., et al. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nat Rev Genet. 12, 429-442 (2011).
  28. Brown, C. J., et al. A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome. Nature. 349, 38-44 (1991).
  29. Brockdorff, N., et al. Conservation of position and exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome. Nature. 351, 329-331 (1991).
  30. Borsani, G., et al. Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome. Nature. 351, 325-329 (1991).
  31. Barakat, T. S., Gribnau, J. X chromosome inactivation and embryonic stem cells. Adv Exp Med Biol. 695, 132-154 (2010).
  32. Chaumeil, J., et al. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
  33. Okamoto, I., et al. Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development. Nature. 472, 370-374 (2011).
  34. Gribnau, J., et al. X chromosome choice occurs independently of asynchronous replication timing. J Cell Biol. 168, 365-373 (2005).
  35. Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
  36. Van Tine, B. A., et al. Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence. Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).
  37. Pollex, T., et al. Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center. Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).
  38. Chaumeil, J., et al. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
  39. Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).
  40. Meissner, A., et al. Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).
  41. Nichols, J., Ying, Q. L. Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture. Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Kombinierte DNA-RNA-FISHXist-RNA-NachweisDNA-SondenmarkierungNick-Translationimmunfluoreszenzmikroskopische UntersuchungParaformaldehyd-FixierungHybridisierungspufferfluoreszierende Antikörper
Kombinierte DNA-RNA-Leuchtstoff
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.