Method Article

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

DOI:

10.3791/51629

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June 9th, 2014

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1Graduate Program in Neuroscience, SMBS, University at Buffalo, SUNY, 2Department of Biochemistry, SMBS, University at Buffalo, SUNY, 3Molecular and Cellular Neuroscience Department, The Scripps Research Institute, 4Department of Biochemistry and Graduate Program in Neuroscience, SMBS, University at Buffalo, SUNY

In This Article

Summary

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Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Erlangung weite Strecken der aktuellen Aufnahme von einem Ionenkanal mit der Cell-Attached-Patch-Clamp-Technik. Diese Methode erlaubt die Beobachtung in Echtzeit, das Muster der Öffnungs-Schließ-Kanal-Konformationen, die die biologische Signal zugrunde liegen. Diese Daten informieren über Kanaleigenschaften in ungestörten biologischen Membranen.

Abstract

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Ionenkanal-Proteine ​​sind universelle Geräte für die schnelle Kommunikation durch biologische Membranen. Die zeitliche Signatur des Ionenflusses erzeugen sie hängt von intrinsischen Eigenschaften zu jedem Kanalprotein sowie den Mechanismus, mit dem sie erzeugt und gesteuert und stellt einen wichtigen Bereich der aktuellen Forschung. Informationen über die Betriebsdynamik der Ionenkanal-Proteine ​​können durch Beobachten langen Strecken von Strom, der von einem einzigen Molekül produziert, erhalten werden. Hier beschrieben ist ein Protokoll zum Erhalten eines Kanal Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahmen Strom für einen Liganden abhängigen Ionenkanals des NMDA-Rezeptor heterolog in HEK293-Zellen oder nativ in kortikalen Neuronen exprimiert. Es werden auch Anweisungen, wie man die Methode auf andere Ionenkanäle von Interesse durch die Vorlage am Beispiel der mechanisch-sensitive Kanal PIEZO1 anzupassen. Dieses Verfahren kann Daten liefern hinsichtlich Leitfähigkeit Eigenschaften und der zeitlichen Abfolge der OPE des Kanalsn-Konformationen geschlossen, aus denen Aktivierungsmechanismus des Kanals, um dadurch ihre Funktionen in Gesundheit und Krankheit zu verstehen.

Introduction

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Schnelle Kommunikation durch biologische Membranen erfolgt fast ausschließlich im oligomeren porenbildende Membranproteine, die allgemein als Kanäle bezeichnet. Diese Proteine ​​unterscheiden sich stark in Aktivierungssignale, Gating-Mechanismen und Leitfähigkeit Eigenschaften. Kanal-Proteine, deren Poren selektiv Ionen als Ionenkanäle klassifiziert; ihre Aktivierung produziert Ionenströme durch die Membran, und ihre Antworten können mit hoher Auflösung in Echtzeit mit Hilfe elektrophysiologischer Techniken aufgezeichnet werden. Die Aktivierungssignale umfassen eine breite Palette von chemischen und physikalischen Eingänge einschließlich Konzentrationsgradienten, mec....

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Protocol

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1. Zellkultur und Proteinexpression

  1. Aufrechterhaltung HEK293-Zellen (ATCC-Nummer CRL-1573) zwischen den Durchgängen 22 und 40, die Durchgänge durch die ATCC geführt, in Monolayer-Kultur in DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) enthält und 1% Penicillin / Streptomycin-Gemisch bei 5% CO 2 und 37 ° C. Zwischen Experimenten Passage-Zellen in T25-Kolben 5-20 fachen Verdünnungen in einem Endvolumen von 10 ml gelöst. Hinweis: Die Verwendung dieser Zellen während der Passagen garantiert günstigen Zellgesundheit, die für eine optimale Abdichtung Bildung und Patch-Stabilität ermöglicht.
  2. Zur Transfektion Platte HEK293-Zellen in 35 mm-Sc....

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Results

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Rekombinante NMDA-Rezeptoren

NMDA-Rezeptoren binden und auf die gleichzeitige Einwirkung von zwei mit-Agonisten: Glutamat und Glycin. Sie montieren wie Heterotetramere von zwei Glycin-Bindungs ​​GluN1 Untereinheiten und zwei Glutamat-Bindungs ​​GluN2 Untereinheiten. GluN2 Untereinheiten sind durch vier Gene (AD) und von diesen codiert die am häufigsten transkribiert Formen in Gehirn sind GluN2A bei Erwachsenen und GluN2B an Jungtieren. Aufgrund der Vielfalt von NMDA-Rezeptor.......

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Discussion

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In der Ionenkanal-Bereich wird ein wichtiger Bereich der Forschung zum Verständnis der Abfolge der Ereignisse, die zum Öffnen oder Gating-Mechanismus des Kanals Kanal führt gewidmet. Für die meisten Sender ist dieses Verfahren komplex und beinhaltet mehrere Bewegungsschritte, die nicht vom makroskopischen Mehrkanalsignal abgeleitet werden kann. Im Gegensatz dazu kann Experimenten beobachtet werden, wo die Reihenfolge der offene / geschlossene Veranstaltungen im Single Channel Datensatz kann detaillierte Informationen üb.......

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Disclosures

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Die Autoren dieses Manuskript erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde von F31NS086765 (KAC) unterstützt, F31NS076235 (MAP) und R01 NS052669 (GKP) und EIA9100012. Die Autoren danken Eileen Kasperek für Know-how und Unterstützung bei der molekularen Biologie und Gewebekultur; und Jason Myers für den Austausch von Daten aus frühen präfrontalen kortikalen Neuronen erhalten.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ChemikalienSigmaVarious
Borosillicate GlassSutterBF-150-86-10
Hellfeld-InversmikroskopOlympus1x51Nikon hat auch ähnliche Mikroskope
Fluroescent BoxX-citeSeries 120
Liquid Light GuideX-citeOEX-LG15
MikromanipulatorSutter InstrumentsMP-225
OszilloskopTektronixTDS1001
VerstärkerMolecular DevicesAxon Axopatch 200B
TischTMC63561
NIDAQ-KarteNational Instruments776844-01
AbzieherNarishigePC-10
PoliererNarishigeMicroforge MF-830
Faradayscher KäfigTMC8133306
Hochgeschwindigkeits-DruckklemmeALA Scientific InstrumentsALA HSPC
Druck-/VakuumpumpeALA Scientific InstrumentsALA PV-PUMPEfür HSPC-1

References

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  1. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  2. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques f....

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Cell attached Patch clampSingle Channel RecordingIon Channel ProteinsNMDA ReceptorPIEZO1 ChannelHEK293 CellsCortical NeuronsVoltage ClampQUB Data AcquisitionFire Polished Pipette

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