Einführung von kleinen Molekülen in die Entwicklungs Drosophila-Embryo bietet ein großes Potenzial für die Charakterisierung der biologischen Aktivität der neuen Verbindungen, Drogen und Giftstoffe sowie für die Sondierung grundlegenden Entwicklungspfade. Hier beschriebenen Verfahren skizzieren Schritte, die natürlichen Barrieren zu diesem Ansatz zu überwinden, erweitern den Nutzen der Drosophila-Embryo-Modell.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Ein Verfahren zur Permeabilisierung der
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Drosophila-Embryo ist seit langem ein leistungsfähiges Labormodell für die Aufklärung der molekularen und genetischen Mechanismen, welche die Entwicklung steuern. Die Einfachheit der genetischen Manipulationen mit diesem Modell pharmakologische Ansätze, die in anderen Tiermodellen und Tests auf Zellbasis alltäglich sind verdrängt. Hier beschreiben wir die jüngsten Fortschritte in einem Protokoll, Anwendung von kleinen Molekülen ermöglicht, den Entwicklungsfruchtfliegenembryo. Das Verfahren vor, um die Details Dichtigkeit der Eierschale zu überwinden und gleichzeitig Embryo Lebensfähigkeit. Eierschale Permeabilisierung in einem breiten Spektrum von Entwicklungsstufen wird durch Anwendung eines zuvor beschriebenen d-Limonen Embryo Permeabilisierung Lösungsmittel (EPS 1) und durch Alterung Embryonen bei reduzierter Temperatur (18 ° C) vor der Behandlung erreicht. Darüber hinaus ist die Verwendung eines fernen Rot-Farbstoff (CY5) als Permeabilisierung Indikator beschrieben, die mit stromabwärts Verwendung von handelsüblichen roten und grünen Grippe kompatibel istorescent Farbstoffe in lebenden und fixierten Präparaten. Dieses Protokoll ist auf Studien mit bioaktiven Verbindungen zu Entwicklungsmechanismen für ein Studium an der Bewertung teratogene oder pharmakologische Aktivität von kleinen Molekülen uncharacterized richtet Sonde als auch.
Einleitung
Die Drosophila-Embryo weiterhin ein erstklassiges Modell für die Untersuchung grundlegender Mechanismen der Entwicklung 2 sein. Dieses leistungsstarke Modell wird durch eine breite Palette von molekulargenetischen Werkzeugen, die Manipulationen der wesentlichen jedem Gen zu jedem Zeitpunkt und in jeder sich entwickelnden Organ erlauben unterstützt. Die geringe Größe, die schnelle Entwicklung und umfangreiche Charakterisierung der Morphogenese des Drosophila-Embryos machen es zu einem Modell der Wahl für genetische Bildschirme, von denen viele grundlegende Entwicklungswege aufgedeckt 3,4. Zahlreiche Phänotypen in Drosophila-....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Vorbereitung von Fly Kulturen, Lösungen und Embryo Handhabung Devices
- Bereiten Sie einen Käfig Kultur von Drosophila. Zeigen 500 + Paarung fliegt von den gewünschten Stamm in einer Population Käfig mit einem 10 cm Trauben-Agar-Platte und einen Ort der Hefe-Paste ausgestattet. Pflegen Kultur in einem 25 ° C Luftfeuchtigkeit gesteuert Inkubator. Hinweis: Cage Kulturen erfordern ein oder zwei Tage, um konsistente Anlage Embryo Verlegemuster zu erhalten. Grape Platten mit Hefe-Paste werden, einmal morgens und einmal abends während Anlage geändert.
- Bereiten EPS. Warmen Lösungen von Tensiden (Cocamide DEA und ethoxylierter A....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Embryo Handhabungsvorrichtungen sind in Fig. 1 dargestellt, um bei der Visualisierung der "home-made"-Geräte für die Manipulation in den obigen Protokollen unterstützen. Ergebnisse in Abbildung 2 zu sehen veranschaulichen die Wirkung der robuste Aufzucht Embryonen bei 18 ° C auf ihrer Fähigkeit, durch EPS in späten Stadien der Entwicklung durchlässig gemacht werden. Dieser Zustand wird im Schritt 2.1 Protokoll angewendet. Wirksamkeit des CY5 Carbonsäurefarbstoff, um die versch.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Das oben beschriebene Verfahren beschreibt ein Mittel, um den Erhalt lebensfähiger Drosophila-Embryonen, die zugänglich zu kleines Molekül Behandlungen in einem breiten Entwicklungsbereich sind. Diese Methode stellt die neue und einfache Feststellung, dass das Altern Embryonen bei 18 ° C ermöglicht Permeabilisierung der späten Phase Embryonen mit der gleichen Wirksamkeit wie zuvor nur in frühen Embryonen gesehen. Darüber hinaus hat die Verwendung von fernen Rot Cy5 Carbonsäure als Indikator wirksamen Permeabili.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH/NIEHS R03ES021581 (verliehen an M.D.R.) und vom University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Fliegenkäfig | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | verlangt Sonderbestellung | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylierter Alkohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | fordert Sonderbestellung | http://www.stepan.com/ |
| d-Limonen (ultrahochreine Qualität) | Florida Chemical Co. | Sonderbestellung anfordern | http://www.floridachemical.com/ |
| Natriumhypochlorit | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS Pulver | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamin B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 Carbonsäure | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields und Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon Mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Membran für gelösten Sauerstoff (DO) | YSI# | 5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25 mm kreisförmiger No.1 Deckglas | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Trauben-Agar-Plattenmischung | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
Referenzen
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
- Jaeger, J., Manu,, Reinitz, J. Drosophila blastoderm patterning. Curr Opin Gene....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
