Neue Generationen von Funktionstests, wie Gamma-Interferon (IFN-γ) ELISpot, die Zytokin-Produktion zu erkennen an der Einzelzellebene und bieten sowohl quantitative und qualitative Charakterisierung der T-Zell-Reaktionen können zum Zell-vermittelten Immunantworten gegen Varicella-Zoster-gerichtet zu bewerten Virus (VZV).
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Methodenartikel
Entwicklung eines IFN-γ ELISPOT-Assay zu beurteilen, Varicella-Zoster-Virus-spezifische Zellvermittelte Immunität nach Nabelschnurblut-Transplantation
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Varizella-Zoster-Virus (VZV) ist eine bedeutende Ursache für Morbidität und Mortalität nach Nabelschnurblut-Transplantation (UCBT). Aus diesem Grund wird antiherpetischen Prophylaxe systematisch pädiatrischen UCBT Empfänger verwaltet zu Komplikationen mit VZV-Infektion zu verhindern, aber es gibt keine starken, evidenzbasierten Konsens darüber, dass die optimale Dauer definiert. Da T-Zell-vermittelte Immunität ist für die Kontrolle der VZV-Infektion, die Beurteilung der Rekonstitution von VZV-spezifischen T-Zellreaktionen nach UCBT könnten Hinweise, ob Prophylaxe sollte beibehalten werden oder abgebrochen werden können. Zu diesem Zweck wurde eine VZV-spezifischen Interferon-gamma (IFN-γ), Enzyme-linked immunospot (ELISPOT)-Assay entwickelt, um die IFN-γ-Produktion durch T-Lymphozyten als Antwort auf in vitro-Stimulation mit bestrahlten lebenden abgeschwächten VZV-Vakzine kennzeichnen. Dieser Test bietet eine schnelle, reproduzierbare und empfindliche Messung der VZV-spezifischen cell-vermittelte Immunität für die Überwachung der Wiederherstellung der VZV-spezifischen Immunität in einer klinischen Umgebung und die Bewertung der Immunantwort gegen VZV-Antigene.
Einleitung
Zuerst im Jahr 1989 durchgeführt wird, UCBT zunehmend als Teil der Behandlung von verschiedenen Tumor nichtneoplastische und Blutkrankheiten bei Kindern von 1 verwendet. VZV ist ein zytopathischen menschlichen Alphaherpesvirus, das zwei verschiedene Krankheiten, Varizellen (nach der Primärinfektion) und Herpes zoster (nach Reaktivierung) verursacht. Nach der Primärinfektion, bleibt VZV während der gesamten Lebensdauer des Host innerhalb sensorischen Nerven der Hinterwurzelganglien geschützt. Eine der bedrohlichsten Infektions Komplikationen nach UCBT mit VZV 4.2 verbunden. In unserem Klinikum, in Ermangelung von VZV-Prophylaxe, die kumulative In....
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Protokoll
Das Forschungsprotokoll wurde von der Ethik Institutional Review Board von CHU Sainte-Justine in Montreal, Quebec, Kanada, wo die Studie durchgeführt wurde genehmigt. Informierte Zustimmung wurde gesucht und von allen Studienteilnehmern, deren Eltern oder Erziehungsberechtigten erhalten. Alle Verfahren durchgeführt an den Tagen 1 und 2 müssen unter sterilen Bedingungen (dh unter einem Abzug mit laminarer Strömung) durchgeführt werden. Standard-Sicherheitsvorkehrungen im Umgang mit menschlichem Blut sollte unbedingt beachtet werden.
1. Beschichtung der Platten
- Permeabilisieren Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen an ....
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Ergebnisse
Die IFN-γ ELISPOT-Protokoll oben beschrieben entwickelt wurde und in unserem Labor optimiert, um das Ausmaß und die Qualität der zellvermittelten Immunreaktionen gegen VZV 4 gerichtet messen. Verschiedenen Quellen der VZV-Antigen zur Stimulation Schritt verwendet werden. Dazu gehören: a) im Handel erhältlich Waschmittel inaktiviert Auszüge aus VZV-infizierten Vero-Zellen 18; b) Pools von überlappenden synthetischen Peptiden, die aus spezifischen VZV kodierten Proteine, einschließlich IE63 15
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Diskussion
Modifikationen und Fehlerbehebung: IFN-γ ELISPOT-Tests wurden verwendet, um die zellvermittelte Immunantwort gegen eine Vielzahl von mikrobiellen Krankheitserregern, einschließlich der menschlichen Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1), 24,25, Hepatitis-C-Virus (HCV) 26 gerichtet zu untersuchen, 27, 28,29 und Mycobacterium tuberculosis, um nur einige zu nennen. Hier beschrieben wir die Entwicklung eines IFN-γ ELISPOT-Assay auf zelluläre Immunität gegen zu messen, mit der Hoffnung a.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Danksagungen
Die Autoren möchten die Studienteilnehmer und ihre Eltern zu danken. Wir möchten auch Dr. Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Kanada) für den Zugang zu seiner ELISpot-Leser, Dr. Lubo Alexandrov für die statistische Analyse danken und Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois und Martine Caty für technische Experten Unterstützung. Unterstützt durch Zuschüsse aus le Fonds d'Opération pour les Projets de recherche et d'Clinique EVAlution des Technologien (CHU Sainte-Justine) an HS und PO, von la Fondation Centre de Cancérologie Charles-Bruneau, und von der Leukemia & Lymphoma Society of Kanada. ISF wurde von Stipendien von la Fondation CHU Sainte-Justine ....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Leucocep-Röhrchen | VWR | 89048-936/89048-932 | je nach Blutvolumen können 12-ml- oder 50-ml-Röhrchen verwendet werden. |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Vor Licht schützen. |
| Benzonase-Nuklease | Novagen | 70746-3 | Bei -20 °C halten. |
| MultiScreenHTS-IP Filterplatte | Millipore | MSIPS4W10 | Steril mit einer Porengröße von 0,45 μm. |
| Maus Anti-Human-IFN-& Gamma-Capture-Antikörper | BD Biosciences | 551221 | NIB42-Klon. |
| Pepmix VZV IE63 | JPT Peptide Technologies | PM-VZV-IE63 | Lösen Sie den Inhalt eines Fläschchens in 40 μ auf; l des DMSO. Innerhalb von 6 Monaten verbrauchen. |
| Biotin-konjugierter anti-IFN-& gamma; monoklonaler Antikörper | BD Biosciences | 554550 | 4SB3 Klon. |
| Streptavidin, konjugiert mit alkalischer Phosphatase | Bio-Rad Life Science | 170-3554 | Verdünnt für die Anwendung am selben Tag. |
| BCIP/NBT | Bio-Rad Life Science | 170-6432 | Vor Licht schützen. |
Referenzen
- Ballen, K. K., et al. Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond. Blood. 122 (4), 491-498 (2013).
- Vandenbosch, K., et al. Varicella-zoster virus disease is more frequent after cord blood than ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
