Wir beschreiben hier die Methode der faserbasierten konfokalen Fluoreszenzmikroskopie (FCFM) Bildgebung, die einen innovativen Modus zum Verständnis physiologischer Phänomene auf zellulärer und subzellulärer Ebene bei tierischen Probanden bietet.
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Methodenartikel
Chemotherapie-induzierte vaskuläre Toxizität - Echtzeit-
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Bestimmte Arten von Chemotherapien können akute Gefäßveränderungen, die in langfristigen Bedingungen, die den Patienten zu einem erhöhten Risiko von vaskulären Erkrankungen begünstigen können, fortschreiten kann auszuüben. Doch wenn auch der Befestigungs klinische Beweise, gibt es einen Mangel an klaren Studien des vaskulären Toxizität und daher der Ätiologie einer heterogenen Gruppe von Gefäß / kardiovaskulären Störungen noch aufgeklärt werden. Darüber hinaus kann der Mechanismus, der vaskulären Toxizität zugrunde liegen vollständig unterscheiden sich von den Grundsätzen der Chemotherapie-induzierter Kardiotoxizität, die in Beziehung steht zu Myozyten Verletzungen zu lenken. Wir haben eine Echtzeit eingerichtet, in vivo molekularen Bildgebung Plattform, um die mögliche akute vaskuläre Toxizität von Antikrebstherapien zu bewerten.
Wir haben eine Plattform für in vivo, hochauflösende molekulare Bildgebung bei Mäusen, die für die Visualisierung Gefäßsystem im geschlossenen Organe und Referenz blo eingestelltod Gefäße innerhalb derselben Personen während jedes einzelnen dienen als seine eigene Kontrolle. Wände der Blutgefäße wurden nach Doxorubicin Verwaltung beeinträchtigt, was einen einzigartigen Mechanismus von vaskulären Toxizität, die der frühes Ereignis in der Endorgane Verletzung sein kann. Hierbei wird das Verfahren zum fibered konfokale Fluoreszenzmikroskopie (FCFM) basierend Abbildungs beschrieben, die einen innovativen Modus bietet den physiologischen Phänomenen auf zellulärer und subzellulärer in Tier Themen zu verstehen.
Einleitung
Klinische Daten zeigen, dass verschiedene Klassen von Chemotherapien zu entlocken eine Vielzahl von Gefäßerkrankungen von Raynaud-Phänomen, Bluthochdruck, myocardialinfarction, zerebrovaskuläre Angriff und Lebervenen occlusivedisease 1,2 manifestiert. "'Unbeabsichtigter' anti-angiogenen Drogen" ist ein recht neuer Begriff, der herkömmliche Chemotherapeutika, die als mögliche Angiogenese-Inhibitoren wirken beschreibt, obwohl sie ursprünglich nicht für diesen Zweck entwickelt, aber 3-5 entwickelt, um Tumorzellen zu eliminieren durch Auferlegung so wenig "Sicherheiten Schaden "zu normalen Zellen wie möglich 3. Mehrere Chemotherapien wurden als vasculo-Giftstoffe angedeutet worden, wie in klinischen Studien mit Serum-Biomarkern beobachtet. Unter diesen sind Alkylierungsmittel (wie Cyclophosphamid), Platin-Verbindungen (wie Cisplatin) und Anthrazyklinen 1,2,5-7.
Akute kardiovaskulären Komplikationen können als resul auftretent von vaskulären Toxizität durch Chemotherapie. Sie können in chronischen Erkrankungen wie Arteriosklerose und machen erhöhtes Risiko für Spät vaskulären Morbidität Fortschritt. Trotz Montage klinische Beweise, gibt es einen Mangel an bezeichneten Studien, in der der Mechanismus der Gefäß Toxizität und daher ist eine weitere Erläuterung der genaue Pathogenese sie anrichten gerechtfertigt.
Eine große Herausforderung bei der Aufdeckung des Mechanismus der Chemotherapie-induzierter vaskulärer Toxizität ergibt sich aus der Komplexität der Untersuchung von Gefäßfunktion in vivo. Wir beschreiben hier eine Plattform für hochauflösende in vivo molekulare Bildgebung bei Mäusen, die den Blutfluss und Schiffe Eigenschaften erfassen können. Diese Plattform erleichtert den Nachweis der direkten Behandlung induzierten vaskulären Wirkungen: in Echtzeit, sowie die folgenden sie über eine Zeitdauer, innerhalb der gleichen Individuen.
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Protokoll
Ethics Statement: Alle Experimente wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. Tierpflege war gemäß gültiger Richtlinien. ICR weibliche Mäuse (7-8 Wochen alt, 25 bis 30 g) wurden in Klimaanlage, Licht gesteuert Tiereinrichtungen des Sackler Fakultät für Medizin in Tel-Aviv Universität untergebracht. Am Begriff wurden die Tiere mit Narkosedosis euthanasiert.
1. Fibred konfokale Fluoreszenzmikroskopie (FCFM) Kalibrierung
- Schalten Sie das Gerät EIN.
- Schließen Sie die Mikrosonde (mini0 / 30).
- Kalibrieren der Vorrichtung nach den Anweisungen des Herstellers.
2. Mäuse Vorbereitung für Imaging
- Anesthetize durch eine subkutane Injektion von sowohl Ketaset (100 mg / kg) und XYL-M2 (6 mg / kg). Überprüfen Sie die Betäubung durch Teilnahmslosigkeit bis Fuß-Prise.
- Inzision der Haut unter der Leiste, um zeigen die Oberschenkel arteriellen Gefäße. Halten Sie die Inzisionsstelle feucht mit Kochsalzlösung nach Einschnitt.
- Heizen Sie den Schwanz durch die Verwendung eines Beutels (oder einen Handschuh) mit warmem Wasser (nicht zu heiß zum Anfassen) für ca. 30 sec gefüllt. Vorbereiten eines intravenösen (IV) Shunt zur Verabreichung von FITC-Dextran (ein Kontrastmittel) und entweder Kochsalzlösung oder chemotherapeutisches Mittel, durch Einführen einer Nadel (30 G, 1/2 Zoll) in die Schwanzvene und Anbringen einer 1 ml Spritze, um es . Achten Sie darauf, die Ader ist durch die Injektion von Kochsalzlösung auf.
Hinweis: eine IV-Verabreichung von FITC-Dextran (mit hohem Molekulargewicht; 100 & mgr; l; 10 mg / ml; 2.000 kDa) erleichtert die Visualisierung des Oberschenkel Mikrovaskulatur von FCFM. Doxorubicin (100 ul, 8 mg / kg Adriamycin) oder Kochsalzlösung wird ebenfalls später verabreicht werden IV in die vorgewärmte Schwanzvene. - Bewegen Sie die Maus supinely auf einer Polystyrol-Bühne. Sichern Sie die Maus auf dem Pad und zu pflegen, die mithilfe von chirurgischen Klebeband.
Anmerkung: (1) Mikrosonde (mini0 / 30): Die Fasern versehenen Konfokalmikroskop in dieser Studie verwendet wird, aus zwei Einheiten zusammengesetzt ist. (2) Laserscaneinheit (LSU-488; 488 nm Wellenlänge).
- Führen Sie alle Zeit-Runden-Analysen unter Verwendung der LSU 488 nm Wellenlängen-Laser.
HINWEIS: Das Hauptgerät Detektor die gefiltert (500 bis 650 nm) emittierte Fluoreszenz. Die aufgenommenen Bilder werden anschließend wieder aufgebaut und mit einer Geschwindigkeit von 12 Bildern / s angezeigt. - Trennen Sie vorsichtig die Spritze von der Nadel und fügen Sie eine neue Spritze mit FITC-Dextran. Verwalten (IV) 100 ul FITC-Dextran.
- Verschieben Sie die Mikrosonde (mini0 / 30) an eine geeignete Sichtfeld und fixiert es, nach Anpassung an die z-Achse, um das entsprechende Bild zu erhalten. Warten Sie auf das Anfangssignal zu verblassen, bis eine klare und fokussierte Signal visible.
- Nehmen Sie eine Grundlinie Blutfluss für kurze Stabilisierungsphase (~ 30 sec). Schließen Sie dann auf die Nadel eine andere Spritze, die entweder Doxorubicin oder Kochsalzlösung. IV verwalten 100 ul Doxorubicin oder Kochsalzlösung.
- Überwachung der Strömung des eingespritzten FITC-Dextran kontinuierlich für 20 min. Auf der FCFM-zugehörige Software, verwenden Sie die Schaltfläche Durchmesser am oberen Lineal, um die Blutgefäße zu messen und kategorisieren sie als kleine (<15 um) oder große (> 15 um).
- Euthanize das Tier mit Narkosedosis.
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Ergebnisse
In-vivo-Bildgebung bei kontinuierlichen Echtzeit-
Die bildgebende Vorrichtung verwendet, hier ist ein hochauflösendes, fibered konfokalen Mikroskop, mit einer Sonde, die Visualisierung des Gefäßsystems und ihre Reaktion auf verschiedene Stimuli, wie Chemotherapie ermöglicht. Dieses Verfahren ist minimal-invasiv, da, obwohl es Bildgebung der tiefen Gefäße oder Organe zu erleichtern, einen kleinen Einschnitt für die Sonde erfordert. Die Sondenbündel bestehen aus Zehntausenden von Fasern,...
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Diskussion
Auswerten Chemotherapie-induzierter vaskulärer Toxizität stellt aufgrund der Schwierigkeit bei der Visualisierung der Dynamik der Vaskulatur in Antwort auf Stimuli in Echtzeit. Zahlreiche klinische Studien haben impliziert, dass mehrere Chemotherapien verursachen direkte Gefäßverletzung, aber der Mechanismus und Besonderheiten dieser Toxizität ist noch nicht geklärt. Wir haben eine Echtzeit für die Bewertung der potentiellen Gefäß Toxizität der Chemotherapie in Mäusen, umfassend von gefaserten konfokale Fluoreszenzmikro...
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Allgemeinanästhesie | Fort Dodge Animal Health, IA, USA und Biove Laboratories, Frankreich | 100 mg/kg Ketaset und 6 mg/kg XYL-M2 | |
| Enthaarungscreme (Veet) | ReckittBenckiser, Bristol, UK | ||
| 30 G, 1/2 Zoll Nadel an 1 ml Spritze | |||
| befestigt FITC Dextran (10 mg/ml; MW 2.000 kDa) | Sigma | FD2000S | 100 μ l Volumen |
| Doxorubicin | Teva, Israel | 8 mg/kg, Adriamycin | |
| Paclitaxel | Taro, Israel | 1,2 mg/kg, Medexel | |
| Kochsalzlösung |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
