Diese Studie stellt eine detaillierte experimentelle Verfahren zur Looping Dynamik der Doppelstrang-DNA mit Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) zu messen. Das Protokoll beschreibt auch, wie die Looping-Wahrscheinlichkeitsdichte genannt J-Faktor zu extrahieren.
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Methodenartikel
Studieren von DNA-Looping von Einzelmolekül-FRET
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Biegen der Doppelstrang-DNA (dsDNA) mit vielen wichtigen biologischen Prozessen wie der DNA-Protein-DNA-Erkennung und Verpackung in Nukleosomen verbunden. Thermodynamik der dsDNA Biege wurde durch eine Methode namens Cyclisierung, die auf DNA-Ligase kovalent zu verbinden setzt kurz klebrigen Enden eines dsDNA sucht. Allerdings kann Ligationseffizienz durch viele Faktoren, die nicht verwandt sind dsDNA Looping, wie die DNA-Struktur rund um die klebrigen Enden verbunden, und Ligase betroffen sein können auch die scheinbare Schleifenrate beeinflussen durch Mechanismen wie unspezifische Bindung. Hier zeigen wir, wie man dsDNA Looping Kinetik ohne Ligase durch Erfassen transienter DNA-Schleifenbildung durch FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) zu messen. dsDNA-Moleküle werden mit einem einfachen PCR-basiertes Protokoll mit einem FRET-Paar und einem Biotin-Linker konstruiert. Die Schleifenwahrscheinlichkeitsdichte als die J-Faktor bekannt ist, aus dem Looping Rate und der Kühlrate zwischen zwei abschaltung extrahiertted klebrigen Enden. Durch das Testen zwei dsDNAs mit verschiedenen intrinsischen Krümmungen zeigen wir, dass die J-Faktor ist sensibel für die Eigenform der dsDNA.
Einleitung
Das Verständnis der mechanischen Eigenschaften von dsDNA ist von grundlegender Bedeutung in der Grundlagenwissenschaften und technische Anwendungen. Die Struktur der dsDNA ist komplizierter als eine gerade, weil spiralförmigen Leiter Rolle, Neige-und Verdrehungswinkel zwischen aufeinanderfolgenden Basenpaare mit der Sequenz variieren. Temperaturschwankungen können dazu führen, dsDNA zu unterschiedlichen Modi Konformationsfluktuationen wie Biegen, Verdrehen und Strecken unterzogen werden. Übergänge wie Schmelzen und Knicken kann auch unter extremen Bedingungen auftreten.
Unter dieser Bewegungen hat dsDNA Biege die auffälligste biologische ....
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Protokoll
1. DsDNA Probenvorbereitung
- Gestalten Sie global gekrümmt DNAs durch Wiederholung eines 10-mer-Sequenz. Zum Beispiel 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) 7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 'ist ein 186-bp-DNA gekrümmten wobei X eine Zufalls zusätzlichen Basis und der flankierenden Sequenz die sich wiederholende 10-mer-Sequenz Adaptersequenzen.
HINWEIS:. In diesem Beispiel wurden zwei 10-mere mit gegenüberliegenden Präferenzen Nukleosom Bildung auf der Grundlage einer großen Nukleosom Belegung Studie von Kaplan et al 15 gewählt. Da die Schrauben Wiederholung der ds....
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Ergebnisse
DNA-Moleküle für die Untersuchung verwendet Schleifen bestehen aus einem Duplexregion der variablen Sequenz und Länge und einzelsträngige Überhänge, welche komplementär zueinander sind. Die Überhänge, die 7-Basis lang sind, können miteinander zu glühen, um die Loop-Zustand zu erfassen. Jeder Überstand enthält entweder Cy3 oder Cy5, die in dem DNA-Rückgrat durch Amiditchemie verbunden ist. Die Cy5-Überhang ist auch mit Biotin-TEG (15-Atom-Tetra-Ethylen-Glykol-Abstandshalter) für die Oberflächen Immobilisierung (siehe
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Diskussion
Eine einfache Einzelmolekül-FRET-Assay, der auf Looping wurde verwendet, um die Kinetik der DNA von verschiedenen Eigenformen zu studieren. Gekrümmt DNAs können durch Wiederholen eines 10-mer-Sequenz in Phase mit dem Schrauben Zeitraum von 10,5 bp, hergestellt werden, und deren Krümmungen mit PAGE abgeschätzt werden. Diese dsDNAs werden mit klebrigen Enden entwickelt, um transienten Schleife Stabilisierung ermöglichen. Es extrahiert den Schlingengeschwindigkeit von der exponentiellen Anstieg in der Anzahl der Moleküle i.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Wir danken James Waters, Gable Wadsworth und Bo Broadwater für das Manuskript kritisch zu lesen. Wir danken auch vier anonymen Gutachtern für die Bereitstellung von nützlichen Kommentare. Wir danken für die finanzielle Unterstützung von Georgia Institute of Technology, der Burroughs Wellcome Fund Career Award in der Scientific-Schnittstelle, und dem Studenten-Forschungsnetzwerk Zuschuss von NSF Physik lebender Systeme.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Small DNA FRAG Extract Kit-100PR | VWR | 97060-558 | |
| Acrylamid 40% Lösung 500 ml | VWR | 97064-522 | |
| Bis-Acrylamid 2% (w/v) Lösung 500 ml | VWR | 97063-948 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1.000 bp | Fermentas | SM0241 | |
| Mini Vertical PAGE System | VWR | 89032-300 | |
| Spritzenvorsatzfilter 0,2 μ m CS50 | VWR | A2666 | |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813-1G | Triplett-Quencher |
| Protocatechuinsäure (PCA) | Sigma-Aldrich | 08992-50MG | Sauerstofffängersystem |
| Protocatechuat 3,4-Dioxygenase (PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | Sauerstofffängersystem |
| mPEG-Silan, MW 2.000 1 g | Laysan Bio | MPEG-SIL-2000-1g | |
| Biotin-PEG-Silan, MW 3.400 | Laysan Bio | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| Avidin, NeutrAvidin Biotin-bindendes Protein | Invitrogen | A2666 | |
| Phusion Hot Start High-Fidelity DNA-Polymerase | New England Biolabs | F-540L | |
| Gel/PCR DNA-Fragmente Extraktionskit | IBI Scientific | IB47020 | |
| Premium Objektträger aus Normalglas | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| VWR Mikro-Deckglas, rechteckig, Nr. 1 | VWR | 48404-456 | |
| Fisher Scientific Isotemp 1006S Umlaufkühler/Heizung | Fisher Scientific | Temperaturregelung | |
| Objektiv Kühlkragen | Bioptechs | 150303 | Temperaturregelung |
| KMI53 Biologisch Mikrometer Messtisch | Semprex | KMI53 | |
| High Performance DPSS Laser 532 nm 50 mW | Edmund Optik | NT66-968 | Cy3 Anregung |
| CUBE Faser Pigtailed 640 nm, 30 mW, Faser, FC/APC Steckverbinder | Coherent | 1139604 | Cy5 Anregung |
| 650 nm BrightLine Dichroitischer Strahlteiler | Semrock | FF650-Di01-25x36 | dichroitisch |
| spaltendLaserMUX Beam Combiner, reflektiert 514,5, 532 & 543,5 nm Laser, 25 mm | Semrock | LM01-552-25 | Kombination dichroitischer |
| Brightline Fluoreszenzfilter 593/40 | Semrock | FF01-593/40-25 | Cy3 Emissionsfilter |
| 635 nm EdgeBasic LWP Langpassfilter, 25 mm | Semrock | BLP01-635R-25 | Cy5 Emissionsfilter |
| EMCCD iXon+ | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| IX51 inverser Mikroskoprahmen | Olympus | ||
| Objektiv UApo N 100X/1.49 Öl TIRF | Olympus | ||
| Immersionsöl Typ-F für die Fluoreszenzmikroskopie | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| 2 mm Durchmesser 45° Stablinse Aluminium beschichtet | Edmund Optics | 54-092 | Miniaturspiegel |
| 1/4" Verfahrweg Einachsiger Translationstisch | Thorlabs | MS-1 | Translation von Miniaturspiegel |
| & Oslash; 1" achromatisches Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm | Thorlabs | AC254-200-A | Fokussierobjektiv Einstellbarer |
| mechanischer Schlitz | Thorlabs | VA100 | |
| Dielektrischer Spiegel | Thorlabs | BB1-E02 | |
| & Oslash; 1" Achromatisches Doublet, f = 100 mm | Thorlabs | AC254-100-A | Relaisobjektiv |
| Objektivhalterung für Ø 1" Optik | Thorlabs | LMR1 | |
| dichroitische Filterhalterung | Thorlabs | FFM1 | |
| Würfelplattform mit festem Käfig | Thorlabs | B3C | |
| Kinematische Halterung für Ø 1" Optik | Thorlabs | KM100 | |
| N-BK7 Plankonvexe Linse, Ø 1", f = 40 mm | Thorlabs | LA1422-A | Kollimationslinse |
| N-BK7 Plankonvexe Linse, & Oslash; 6,0 mm, f = 15 mm | Thorlabs | LA1222-A | Teleskopobjektiv |
| N-BK7 Plankonvexe Linse, Ø 6,0 mm, f = 150 mm | Thorlabs | LA1433-A | Teleskopobjektiv |
Referenzen
- Garcia, H. G., et al. Biological consequences of tightly bent DNA: The other life of a macromolecular celebrity. Biopolymers. 85, 115-130 (2007).
- Wiggins, P. A., et al. High flexibility of DNA on short length scales prob....
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Nachdrucke und Genehmigungen
