Methodenartikel

In-situ-Nachweis autoreaktiver CD4-T-Zellen in Gehirn und Herz Mit Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II Dextramers

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DOI:

10.3791/51679

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1. August 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, University of Nebraska, Lincoln, 2Center for Biotechnology, University of Nebraska, Lincoln, 3Nebraska Center for Virology and School of Biological Sciences, University of Nebraska, Lincoln

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Protokoll zur selbst-reaktiven CD4-T-Zellen erkennen in Gehirn und Herz durch direkte Färbung mit Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II dextramers hat in diesem Bericht beschrieben. Für Analysen, ist eine zuverlässige Methode, um die Frequenzen von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen in situ aufzuzählen auch entwickelt.

Zusammenfassung

Dieser Bericht zeigt die Verwendung von Dextrameren der Klasse II des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) für den Nachweis von autoreaktiven CD4-T-Zellen in situ in Myelin-Proteolipid-Protein (PLP) 139-151-induzierter experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE) in SJL-Mäusen und kardialer Myosin-Schwerketten-α (Myhc) 334-352-induzierter experimenteller autoimmuner Myokarditis (EAM) in A/J-Mäusen. Es wurden zwei Sätze von Cocktails aus Dextramer-Reagenzien verwendet, bei denen Dextramer+-Zellen mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (LSCM) analysiert wurden: EAE, IAs/PLP 139-151 Dextramere (spezifisch)/anti-CD4 und IAs/Theiler's murine Enzephalomyelitis-Virus (TMEV) 70-86 Dextramere (Kontrolle)/anti-CD4; und EAM, IAk/Myhc 334-352 Dextramere/anti-CD4 und IAk/bovine Ribonuklease (RNase) 43-56 Dextramere (Kontrolle)/anti-CD4. Die LSCM-Analyse von Hirnschnitten von EAE-Mäusen zeigte das Vorhandensein von Zellen, die positiv auf CD4- und PLP 139-151-Dextramere waren, aber nicht auf TMEV 70-86-Dextramere, was darauf hindeutet, dass die mit PLP 139-151 Dextramere erhaltene Färbung spezifisch war. Ebenso zeigten Herzschnitte von EAM-Mäusen das Vorhandensein von Myhc 334-352, aber nicht wie erwartet RNase 43-56-dextramer+ Zellen. Darüber hinaus wurde eine umfassende Methode entwickelt, um die Häufigkeiten von antigenspezifischen CD4-T-Zellen in den "Z"-Serienbildern quantitativ zu analysieren.

Einleitung

Die Verwendung von Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Klasse II Tetramere zum Nachweis von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen war eine Herausforderung 1-7. Um die Nachweisempfindlichkeit von MHC-Klasse II Tetramere zu steigern, hat das Forschungsteam der nächsten Generation Tetramere, bezeichnet "dextramers" 8 erstellt. Dextramers enthalten Dextran-Backbones, in denen mehrere Streptavidin-Fluorophoreinheiten konjugiert sind, so dass mehrere Peptid-gebundenen, biotinylierten MHC-Monomere kann auf eine Dextranmolekül 9 befestigt werden. Somit können große Aggregate von MHC dextramers die mehrere MHC-Peptid-Komplexe enthalten, mit mehreren T-Zell-Rezeptoren (TCRs) interagieren.

Diese Gruppe zuletzt erzeugten dextramers für verschiedene Autoantigene und gezeigt, dass die Erfassungsempfindlichkeit der dextramers war ungefähr fünfmal mehr als 8 Tetramere. Die experimentellen Systemen gehören experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) mit Proteolipid-Protein (PLP) 139-151 in SJL-Mäusen induziert; EAE mit Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) 35-55 in C57BL / 6 Mäusen; und experimentellen autoimmunen Myokarditis (EAM) mit Herz Myosin-α (Myhc) 334-352 in A / J-Mäusen induziert. Diese Studie demonstriert die Verwendung von PLP 139-151 - 334-352 und Myhc dextramers um Antigen-spezifische CD4 + T-Zellen erkennen, in situ mit Spezifität durch die Entwicklung eines direkten Färbungsprotokoll, wodurch die Notwendigkeit, um die Signale unter Verwendung von Fluorophor-Antikörper verstärken eliminiert, eine Ansatz häufig mit der Verwendung von Tetrameren eingesetzt. Zusätzlich wurde ein umfassendes Verfahren zur Bewertung Gewebe auch entwickelt worden, um zuverlässig Aufzählung der Frequenzen von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen in situ 10. Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zellen in situ ermöglicht Abgrenzung von Ereignissen durch spezifische antigene Stimuli von den durch Bystander-Aktivierung verursacht. Ebenso ist die in situ-Technik auch provides Möglichkeiten, die Kinetik der Antigen-spezifischen T-Zell-Infiltration in den Zielorganen zu verfolgen.

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Protokoll

Ethikerklärung:

Alle Tier Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und von der Universität von Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE genehmigt.

1. Induktion von EAE

  1. Um EAE zu induzieren, bereiten das Peptid / komplettem Freund-Adjuvans (CFA) als Emulsion in 11 mit den folgenden Modifikationen: Schritt 1.1:. Vorbereitung PLP 139-151 in einer Konzentration von 1 mg / ml in 1 × phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Schritt 1.4:. verwenden 200 &mgr; l CFA-Emulsion, enthaltend 100 &mgr; g PLP 139-151 pro Tier Schritt 1.4.1: zehn Tiere zu immunisieren, bereiten 2 ml Emulsion durch Mischen von 1 ml PLP 139-151 (1 mg / ml in 1x . PBS) und ein gleiches Volumen von CFA Schritt 1.5: Injektion von 200 &mgr; l Emulsion in geteilten Dosen subkutan in den beiden Leistenbereichen (~ 75 &mgr; l jeweils) und Brustbeinregion (~ 50 &mgr; l) von fünf bis sechs Wochen alten FEMAle SJL / J-Mäusen. Die Schritte 1.7 und 1.8 gelten nicht für die Induktion von EAE.

2. Klinische Bewertung von EAE Mäusen und Ernte von Cerebrums

  1. Überwachen Sie die Tiere für Auftreten von klinischen Zeichen und erzielt das Krankheitsschwere täglich von 9. Tag nach der Immunisierung wie folgt: 0 - gesund; 1 - schlaffer Schwanz oder Hinterbein Schwäche aber nicht beides; 2 - schlaffer Schwanz und Hinterbein Schwäche; 3 - teilweise Lähmung der Hinterbeine; 4 - vollständige Lähmung der Hinterbeine; 5 - moribund oder tot 12.
  2. Euthanize die Mäuse, wenn sie eine neurologische Score von 3 oder 4 mit CO 2 zu erreichen. Um die Mäuse einschläfern, Pre-füllen die Euthanasie Kammer zunächst mit CO 2 durch Drehen der Regler der CO 2-Tank nicht mehr als 6 psi und damit die Tiere in der Kammer für ca. 5 min zu bleiben, um komplette Asphyxie zu erreichen. Weichen Sie die Tiere eingeschläfert in 70% Alkohol. Sofort legen die Tiere auf einem absorbierenden Kissen und mit einem Paar von sterilSteinpilze und Schere entlarven die Herzen durch einen Schnitt durch die Brusthöhle. Stechen Sie die richtigen Ohrmuscheln und Perfusion durch die Injektion von 10 ml kaltem 1x PBS in die linke Herzkammern der Herzen.
  3. Graben Sie den Schädel durch Kappen der Schädel im Kreis mit einem Paar gebogene Schere, und vorsichtig, drehen Sie die Schädelknochen mit einer Pinzette. Ernten Sie das Gehirn stumpf und mit einem sauberen Skalpell, separate Großhirn vom Kleinhirn. Legen Sie das Großhirn in ein Röhrchen mit kaltem 1x PBS und verlassen die Röhrchen auf Eis, bis die Verarbeitung.

3. In-situ-Färbung der Hirnschnitte mit MHC-Klasse-II-(IA n) / PLP 139-151 Dextramers

  1. Bereiten Sie 4% PBS-gepufferte niedrig schmelzenden Agarose, schmilzt durch Erhitzen bei 50 ° C und lassen Sie es in einem 40 ° C Wasserbad bis zur Verwendung.
  2. Legen Sie das Großhirn in einer Wegwerf tiefen Bodenform Histologie Kassette gehalten über Eis und gießen geschmolzene (40 ° C) Agarose. Unmittelbar, drücken Sie die Großhirn sanftmit einer Zange, um das Gewebe einzutauchen. Lassen Sie die Kassette auf Eis für 15-20 Minuten, bis die Erstarrung abgeschlossen ist.
  3. Füllen Sie die Badewanne mit Vibratoms gekühlt 1x PBS. Füllen Sie den Raum um Vibratoms Badewanne mit Eiswürfeln, die Temperatur des PBS zwischen 0 und 2 halten ° C. Fix eine saubere Rasierklinge in die Vibratom und den Blattwinkel bis 15 °.
  4. Platzierung von Gewebe in Vibratom. Schneiden Sie überschüssige Agarose von allen Seiten des eingebetteten Gewebe und die Bauchseite des Großhirns etwas aussetzen.
    1. Schmieren Vibratoms Gewebeblock mit Sekundenkleber und übertragen Sie die Agarose-eingebetteten Gewebe über die Klebefläche freigelegt, indem die Bauchfläche des Großhirns über den Kleber für Schnitte quer. Sie das Gewebe nicht bewegen, wenn das Gewebe über den Block gesetzt.
    2. Legen Sie die Vibratom Block mit der Agarose-eingebetteten Gewebe auf Eis, und damit der Leim für 15 Minuten trocknen.
  5. In der Zwischenzeit legen Sie das Gewebe chamMitglieder einer pro Vertiefung einer 24-Well-Platte. Füllen Sie die Vertiefungen der Gewebekammern mit 1 ml kaltem 1x PBS mit, und lassen Sie die Platte auf Eis.
    1. Die Gewebekammern vorbereiten durch das Anbringen einer dünnen Nylon Netz zum Schnitt-Ende einer 25 ml-Polypropylen-Pipette mit Superkleber; nach dem Abschneiden der überschüssigen, Gitter um die Pipette, schneiden die Pipette bis zu einer Länge von 1 cm aus dem Netz.
  6. Senken Sie die Vibratom Klinge auf das Niveau von der Oberseite des Gewebes; stellen Sie die Geschwindigkeit Vibratoms 0,22 mm / s einsetzen und schneiden mit einer Vorwärtsbewegung bis 200 um dicke Schnitte zu machen. Bringen Sie ein Gehirnschnitt pro auch mit einem weichen Pinsel Aquarell in die Gewebekammern in den Vertiefungen einer 24-Well-Platte gelegt. Halten Sie die Platte auf Eis, bis Schnitte vollständig Gewebeabbau zu verhindern. Hinweis: Befolgen Sie diese Schritte, um in insgesamt drei Abschnitte gepaart aus drei verschiedenen Regionen des Gehirns dorsalen zum ventralen Oberfläche (Abbildung 2) zu erhalten. Ein Abschnitt auswobei jedes Paar (insgesamt drei Abschnitte) in drei einzelnen Gewebekammern angeordnet sind, zum Färben mit spezifischen dextramers bezeichnet (IA e / PLP 139-151) und anti-CD4. Ebenso sind ein weiterer Satz von drei Abschnitten, die in drei einzelnen Gewebekammern angeordnet sind, zum Färben mit Steuer dextramers bezeichnet (IA e / TMEV 70-86) und anti-CD4.
  7. Übertragen Sie die drei Gewebekammern, die die für die Färbung mit spezifischen dextramers in drei Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit einer Kammer pro Vertiefung in bestimmten Abschnitten, die, 300 ul einer Cocktail enthält Allophycocyanin (APC)-konjugierte PLP 139-151 dextramers (2,5 ug / ml) und anti-CD4-Phycoerythrin (PE, 5 ug / ml) in Blockierungslösung (1 × PBS mit 2% normalem Ziegenserum) wurde vorher zugegeben. Die Vertiefungen mit einem Deckel.
  8. Ebenso übertragen die drei Kammern Gewebe, das die für die Färbung mit Steuer dextramers in drei Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit einer Kammer pro wir bezeichneten Abschnittell, in denen 300 &mgr; l eines Cocktails, enthaltend APC-konjugiertem TMEV 70-86 dextramers (2,5 ug / ml) und anti-CD4-PE (5 ug / ml) in Blocking-Lösung wurde vorher zugegeben. Die Vertiefungen mit einem Deckel. Hinweis: Lesen Sie Massilamany et al, 8 für die Zubereitung von dextramers und Dextranmoleküle vorzubereiten dextramers wurden freundlicherweise von Immudex, Kopenhagen, Dänemark, zur Verfügung gestellt..
  9. Beschriften Sie die Brunnen, und wickeln Sie die Platte mit Aluminiumfolie und legen Sie die Platte auf einem Schaukel Plattform, um sanfte Drehungen 1,5 Stunden im Dunkeln bei RT eingestellt.
  10. Nach der Inkubationszeit, waschen Gewebeschnitte auf dem Schaukel Plattform, durch die Gewebekammern Übertragung zu einem frischen und mit 1 ml kaltem 1x PBS, und vermeiden Sie Dribbling den Inhalt eines gut in die andere. Waschen dreimal wiederholt, so dass mindestens 10 min pro Waschgang. Sicherzustellen, dass die Gewebeschnitte nicht getrocknet, wie sie an den Seiten der Kammer Stick.
  11. Befestigen Sie die Teile durch die Übertragung der Gewebe chamMitglieder in eine frische und in 24-Well-Platte mit 1 ml 4% gefiltert PBS-gepufferte Paraformaldehyd (pH 7,4) auf einem Schaukel Plattform für 2 Stunden mit sanften Drehungen.
  12. Waschen dreimal wiederholt, wie in Schritt 3.10.
  13. Legen Sie die markierten und fixierten Abschnitte auf einer sauberen Objektträger mit einem Aquarell weichen Bürste. Wischen Sie überschüssiges Wasser ohne Berührung der Abschnitt, und montieren Sie den Abschnitt mit Montage Medium. Deckel mit einem mikroskopischen Deckglas und lassen Sie die Folien bei RT O / N in den dunklen Raum trocknen.
  14. Bewahren Sie die Folien in einer lichtdichten Folie Aufbewahrungsbox bei 4 ° C

4. Induktion von EAM und Sammlung der Herzen

  1. EAM induzieren, wie in Referenz 11 beschrieben.
  2. Euthanize die Mäuse am Tag 21 nach der Immunisierung mit Reinraum mit CO 2-Gasflasche ausgestattet, und genießen Sie die Tiere in 70% Alkohol. Sofort legen die Tiere auf einer saugfähigen Unterlage und mit Hilfe einer Pinzette und Schere das Herz aussetzens durch einen Schnitt durch die Brusthöhle. Stechen Sie die richtigen Ohrmuscheln und Perfusion durch die Injektion von 10 ml kaltem 1x PBS in die linke Herzkammern der Herzen. Sammeln Sie die Herzen und in Röhrchen mit kaltem 1x PBS.

5. In-situ-Färbung von Herz-Abschnitte mit MHC-Klasse-II-(IA k) / Myhc 334-352 Dextramers

  1. Bereiten Sie 4% PBS-gepufferte niedrig schmelz Agarose, schmilzt durch Erhitzen bei 50 ° C und lassen Sie es in einem 40   ° C Wasserbad bis zur Verwendung.
  2. Legen Sie die Herzen in einer Wegwerf tiefen Bodenform Histologie Kassette auf Eis gehalten, und gießen geschmolzene Agarose bei 40 ° C bis die Gewebe vollständig untergetaucht, wie in Schritt 3.2 beschrieben.
  3. Folgen Sie Schritt 3.3.
  4. Schneiden Sie überschüssige Agarose von allen Seiten des eingebetteten Gewebe leicht und setzen die Basis des Herzens. Schmieren Vibratoms Gewebeblock mit Sekundenkleber und übertragen Sie die Agarose-eingebetteten Gewebe über die Klebefläche, indem die freigelegte Oberfläche desHerz über den Leim. Sie das Gewebe nicht bewegen, wenn das Gewebe über den Block gesetzt.
    1. Legen Sie die Vibratom Block mit der Agarose-eingebetteten Gewebe auf Eis, und damit der Leim für 15 Minuten trocknen.
  5. Folgen Sie den Schritten 3.5 und 3.6.
  6. Übertragen Sie die Herzen Abschnitte mit einem Aquarell weichen Bürste in die Gewebekammern in den Vertiefungen einer 24-Well-Platte gelegt. Halten Sie die Platte auf Eis, bis Schnitte ist komplett um den Abbau des Gewebes zu verhindern. Hinweis: Befolgen Sie diese Schritte, um insgesamt zu erhalten, gepaart acht Abschnitte von der Spitze zur Basis des Herzens (Abbildung 2). Legen Sie alle Teile in Gewebekammern, die Zuweisung von bis zu 3 Abschnitte pro Kammer. Ein Abschnitt von jedem Paar (insgesamt acht Bereiche) zum Färben mit spezifischen dextramers (IA k / Myhc 334-352) und anti-CD4 bezeichnet. Ebenso wird ein anderer Satz von acht Abschnitten Färbung mit Steuer dextramers (IA k / RNase 43-56) und anti-CD4 bezeichnet.
  7. Übertragen Sie diedrei Gewebekammern mit den zur Färbung mit spezifischen dextramers in drei Vertiefungen in einer Platte mit 24 Vertiefungen mit einer Kammer pro Vertiefung in bestimmten Abschnitten, die 300 &mgr; l eines Cocktails, enthaltend APC-konjugiertem Myhc 334-352 dextramers (2,5 ug / ml) und Anti-CD4-PE (5 ug / ml) in Blocking-Lösung wurde vorher zugegeben. Die Vertiefungen mit einem Deckel.
    1. Ebenso übertragen die drei Kammern Gewebe, das die für die Färbung mit Steuer dextramers in drei Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit einer Kammer je gut bezeichneten Abschnitte, in denen 300 ul einer Cocktail enthält APC-konjugierte RNase 43-56 dextramers (2,5 ug / ml) und anti-CD4-PE (5 ug / ml) in Blocking-Lösung wurde vorher zugegeben. Die Vertiefungen mit einem Deckel.
  8. Beschriften Sie die Brunnen, und wickeln Sie die Platte mit Aluminiumfolie und legen Sie die Platte auf einem Schaukel Plattform, um sanfte Drehungen 1,5 Stunden im Dunkeln bei RT eingestellt.
  9. Folgen Sie den Schritten, 3,10-3,11
  10. Wiederholen Sie den Wasch thrEis, wie in Schritt 3.10.
  11. Legen Sie die markierten und fixierten Abschnitte (bis zu drei Abschnitte / Folie) auf einem sauberen Objektträger mit einem Aquarell weichen Bürste. Wischen Sie überschüssiges Wasser ohne Berührung der Abschnitte, und montieren Sie die Abschnitte mit Montage Medium. Deckel mit einem mikroskopischen Deckglas und lassen Sie die Folien bei RT O / N in den dunklen Raum trocknen.
  12. Bewahren Sie die Folien in einer lichtdichten Folie Aufbewahrungsbox bei 4 ° C.

6. Analyse Dextramer + (dext +) CD4 + T-Zellen durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskop (LSCM) (die für beide Gehirn und Herz Sektionen)

  1. Verwenden Sie Nikon Eclipse-A1-90i konfokalen Mikroskop-System für die routinemäßige Scannen und Erfassen von Bildern. Zum Starten klicken Sie auf Öffnen der NIS-Elements AR-Software (Version 4.13).
    1. Wählen Sie "TRITC" und "Cy5"-Kanäle von der Platte. Die Anregungs-/ Emissionswellenlängen jeweils für TRITC-und Cy5-Kanäle, 561,5 nm / 553-618 nm und 640,7 nm / 663-738 nm standardmäßig angezeigt.
    2. Weisen Sie die Falsch "grün" und "rot" für das TRITC (CD4-PE) und Cy5 (dextramer-APC)-Kanäle auf.
    3. Legen Sie die Folie, um auf dem Mikroskoptisch untersucht werden und sich manuell unter 100-facher Vergrößerung. Stellen Sie die "HV" auf 110 und Offset auf "0". Klicken Sie auf "Focus" und stellen Sie die "Spannung" um die Laser zu optimieren.
    4. Klicken Sie auf "Focus"; Scannen Sie den Abschnitt von oben nach unten, und stellen Sie die "Z"-Ebene für die Bildaufnahme. Klicken Sie auf "CH-Serie" und das Bild nacheinander zu erwerben. Identifizieren dext + CD4 + T-Zellen erscheinen als gelbe punktförmige Zellen auf Co-Lokalisation der Signale sowohl von der rot (dextramers) und Grün (CD4)-Kanäle generiert.
  2. Verwenden Olympus-BX60 FV500 Konfokalmikroskop für die einfache quantitative Aufzählung von dext + CD4 + T-Zellen. Um zu beginnenKlicken offen, der FluoView-Software (Version 4.3).
    1. Wählen Sie die Farbstoffe "Cy3" und "Cy5" aus dem Drop-Down-Menü, und klicken Sie auf "Übernehmen", um die jeweiligen Laser laden. Hinweis: Die Anregung / Emissionswellenlängen für Cy3 (543 nm / pseudocolored "grün"; CD4-PE) und Cy5 (633 nm / pseudocolored "rot", dextramer-APC)-Kanäle.
    2. Legen Sie die Folie, um auf dem Objektträger untersucht werden, und konzentrieren es manuell unter geringer Vergrößerung (4x oder 10x). Klicken Sie auf "Focus", während die Cy3-Laser ist, und konzentrieren den Entzündungsherd.
    3. Ändern Sie das Ziel, 100-facher Vergrößerung. Stellen Sie die Dateigröße auf "512/512" aus dem Dropdown-Menü aus. Klicken Sie auf "Focus" und passen Sie die Werte für "PMT", "Gain" und "Offset"-Parameter, um die Laser für Cy3 und Cy5 separat zu optimieren.
    4. Klicken Sie auf "Z-Stufe", und klicken Sie dann auf "Focus", während sowohl die Laser auf. Setdie Dicke der "Z-Stufe", indem Sie auf die "up" und "down" Pfeile. Stellen Sie die "Z"-Intervall auf 2 um.
    5. Klicken Sie auf "Stop", und wählen Sie "Seq123". Klicken Sie dann auf "XYZ" und starten Sie den Erwerb "Z"-Serie Bilder für den ausgewählten Bereich innerhalb der Entzündungsherd. Speichern Sie die "Z Serienbilder" als AVI-Dateien. Um die Bilddateien zu speichern, wählen Sie das Bild aus der "Z Serienbild", und speichern Sie dann als "tiff"-Format.
  3. Untersuchen drei gekoppelten Abschnitte aus dem Großhirn, wo ein Satz von drei Abschnitten mit IA s / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 und der andere Satz aus drei Abschnitten mit IA s / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 ausführen gefärbten quantitative Analyse.
    1. Auf ähnliche Weise analysieren acht gepaarten Abschnitte für Herz, in dem wurde ein Satz von acht Abschnitten mit IA k / Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 und ein anderes an sich gefärbtt aus acht Abschnitten mit RNase 43-56 dextramers/anti-CD4.
  4. Untersuchen Sie 10 bis 15 pro Abschnitt Entzündungsherde in Gehirn-, und in jedem der Schwerpunkte erwerben einen Satz von 15 bis 25 Serienbilder nacheinander.
    1. Untersuchen insgesamt 20 Entzündungsherde aus allen acht Abschnitten des Herzens und von jedem Fokus nacheinander erwerben 10 bis 15 Serienbilder. Nehmen Sie die "Z" Serien Bilder durch Scannen der Dias in einem "Horizontal-Vertikal-up-Horizontal-Vertikal-down"-Bewegung, so dass die Wiederholung der "Z"-Serie in der gleichen Fokus wird vermieden.
    2. Nachdem Serienbilder "Z" werden erfasst, benennen Sie die Dateien durch die Identifizierung der Foliennummern, Namen der Abschnitte, und die Anzahl der "Z" Serienbilder gemacht.
      1. Verwenden Sie "ImageJ"-Software, um dext + CD4 +-T-Zellen zu zählen im Verhältnis zu der Gesamtzahl der CD4 + T-Zellen. Wählen Sie die "Art des Gegen 'in' ImageJ, überprüfen &# 8216, alle zeigen "und anfangen zu zählen, indem Sie auf die Mitte jeder Zelle und zählt weiter in verschiedenen 'Z' serielle Bilder mithilfe Seiten Pfeilen. Nachdem wir all die CD4 T-Zellen zu zählen, wählen Sie eine andere Art von Zähler und zählen die CD4 +-T-Zellen dext. Klicken Sie auf die Registerkarte Ergebnisse, um die Gesamtzahl der Zellen mit den zwei verschiedenen Zählern gezählt zu bekommen.
      2. Um die Gesamtzahl zu erhalten, fügen Sie die Anzahl der Zellen in allen 'Z' seriellen Bilder, die alle drei Gehirnschnitten oder alle acht Abschnitte Herzen.

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Ergebnisse

In diesem Bericht, in-situ-Detektion von Antigen-spezifischen, autoreaktive CD4-T-Zellen durch direkte Färbung mit MHC-Klasse-II dextramers beschrieben. Frisch geschnittene Hirnschnitte wurden von EAE-Mäusen gewonnen und mit Cocktails enthalten PLP 139-151 (spezifischen) oder TMEV 70-86 (Kontrolle) dextramers und anti-CD4 gefärbt. Die Top-Platten in Abbildung 1 zeigt LSCM Analyse von Hirnschnitten mit PLP 139-151 dextramers (rot) und CD4-Antikörper (grün), wobei die Doppel-positiven Zellen ersc...

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Diskussion

Im Gegensatz zu MHC-Klasse-I-Tetrameren, die Verwendung von MHC-Klasse-II-Tetramere für Routine-Anwendungen weiterhin eine Herausforderung sein, vor allem um die Vorläuferfrequenzen niedriger Affinität autoreaktiven CD4-T-Zellen, was zum Teil auf ihre Aktivierung Abhängigkeit 6,15-17 aufzuzählen. Kürzlich wurde dieses Problem durch die nächste Generation von Tetrameren, genannt umgangen "dextramers" uns erlaubt, Antigen-spezifische CD4 + T-Zellen für eine Vielzahl von Autoantigenen, wie PLP 139-151,...

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Offenlegungen

Keine Interessenkonflikte erklärt wurden.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der American Heart Association und der Kinder-Kardiomyopathie Foundation (SDG2462390204001) und den National Institutes of Health (HL114669) unterstützt. CM ist ein Empfänger eines Postdoc-Forschungsstipendium Stipendium der Stiftung Myokarditis, NJ ausgezeichnet.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CFASigma Aldrich, St. Louis, MO5881Geschäft in 4 ° C
MTB  H37Rv Extrakt Difco Laboratories, Detroit, MI231141Store in 4 ° C
PTList Biologicals Laboratories, Campbell, CA181Geschäft in 4 ° C
1x PBS Corning, Manassas, VA21-040-CVGeschäft in 4 ° C
Weibliche A/J-Mäuse Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME646
Weibliche SJL/J-MäuseJackson Laboratories, Bar Harbor, ME686
Leur-lok steril 1 ml SyrringeBD, Franklin Lakes, NJ309628
Leur-lok steril 3 ml SyrringeBD, Franklin Lakes, NJ309657
Sterile Nadel, 18 GBD, Franklin Lakes, NJ305195
Sterile Nadel, 27 1/2 GBD, Franklin Lakes, NJ305109
3-Wege-Hahn Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OHMX5311L
Kerlix Mullbinderollen Covidien, Mansfield, MA6720
KimwipesKimberly-Clark Professional, Roswell, GA34155
Agarose, niedriger Schmelzpunkt, analytische QualitätPromega Corporation, Madison, WIV2111
Immunopure normales ZiegenserumThermo Scientific, Waltham, MA31873Lagern bei -20 ° C
Anti-Maus-CD4, konjugiert mit PE-FarbstoffeBioscience, San Diego, CA 12004185Laden Sie in 4 ° C
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences, Hatfield, PA19202Laden bei 4 ° C
Faramount Wässriges EindeckmediumDako, Carpinteria, CA10073021
Konisches Röhrchen (15 ml)BD Biosciences, San Jose, CA352099
Konisches Röhrchen (50 ml)BD Biosciences, San Jose, CA352070
24-Well-Gewebekulturplatten mit flachem BodenBD Biosciences, San Jose, CA356775
Aquarell #2 PinselCharles Leonard, Inc. Hauppauge, NY73502
Einfache Objektträger, Größe: 3" x 1" x 1,2 mmFisher Scientific, Pittsburgh, PA1255010
Premium Deckglas, 22 x 22-1Fisher Scientific, Pittsburgh, PA12548B
Einweg-Histologiekassetten mit tiefer BasisLaborprodukt, Rochester, NYM-475-10
Loctite SekundenkleberHenkel Corporation, Westlake, OH1471879
RasierklingenGillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)Neopeptide, Cambridge, MAStore at 4 ° C
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF)Neopeptid, Cambridge, MABei 4 ° lagern; C
MHC Klasse II/IAs PLP 139-151 oder TMEV 70-86 Dextramer, konjugiert mit APC-Farbstoff4 ° lagern; C
MHC Klasse II/IAk Myhc 334-352 oder  oder RNase 40-56 Dextramer, konjugiert mit APC-Farbstoff4 ° C
Dextran konjugiertes SA-APCImmundex, Kopenhagen, DemarkStore at 4 ° C
Sterile chirurgische Scheren und PinzettenINOX tool Corporation
MikroofenGE Healthcare, Pittsuburgh, PA
Leica VT 1200 VibratomeLeica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL
Olympus BX 60  Konfokales Laserscanning-MikroskopOlympus America, Inc. Center Valley, PA
Nikon A1-Eclipse 90i KonfokalmikroskopNikon Inc. Melville, NY
Bei Bei

Referenzen

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