Sammlung und Extraktion von DNA-Speichel für Next Generation Sequencing

Zusammenfassung

DNA-Extraktion aus Speichel kann eine leicht verfügbare Quelle für DNA mit hohem Molekulargewicht darstellen, mit wenig bis gar keiner Degradation/Fragmentierung. Dieses Protokoll bietet optimierte Parameter für die Speichelgewinnung/-lagerung und DNA-Extraktion, um von ausreichender Qualität und Quantität für nachgelagerte DNA-Assays mit hohen Qualitätsanforderungen zu sein.

Zusammenfassung

Die bevorzugte DNA-Quelle in der Humangenetik ist Blut oder aus Blut gewonnene Zelllinien, da diese Quellen große Mengen an hochwertiger DNA liefern. Die DNA-Extraktion aus Speichel kann jedoch qualitativ hochwertige DNA mit wenig bis gar keiner Degradation/Fragmentierung liefern, die für eine Vielzahl von DNA-Assays ohne die Kosten eines Phlebotomisten geeignet ist und sogar per Post erworben werden kann. Bisher wurden in der Literatur jedoch keine Speichel-DNA-Entnahme-/Extraktionsprotokolle für die Sequenzierung der nächsten Generation vorgestellt. Dieses Protokoll optimiert die Parameter der Speichelgewinnung/-lagerung und der DNA-Extraktion, um von ausreichender Qualität und Quantität für DNA-Assays mit den höchsten Standards zu sein, einschließlich Microarray-Genotypisierung und Next Generation Sequencing.

Einleitung

Erzielen hoher Qualität für die menschliche DNA genetische Studien ist wichtig, in der Krankheit Gen Entdeckungsprozess. Blut, obwohl erfordern ein invasives Verfahren und auch teurer als Speichelsammlung wird zum Erzeugen immortalisierter Zelllinien als eine unendliche Quelle von DNA oder iPSCs für funktionelle Studien bevorzugt, und manchmal Blut-DNA wird verwendet, wenn Zelllinien nicht vorhanden sind. , Blutgewinnung erfordert jedoch eine ausgebildete phlebotomist und Blut eine kürzere Halbwertszeit als Speichel ¹ hat. DNA aus Speichel ist weniger teuer und leichter zu erhalten, da sie gesammelt und durch die Mail ohne die Notwendigkeit für eine Blutentnahme, wodurch die Versuchsperson Bäder weit über den Einzugsbereich der Krankenhäuser und Laboratorien ^2. Studienaufnahme kann verbessert werden, wenn die Probanden die Möglichkeit zu geben eine Speichelprobe statt Blut ^{3, 4.} Können Bedenken hinsichtlich der Quantität und Qualität der DNA aus dem Speichel seine weit verbreitete uns eingeschränkt habenTrotz zahlreicher Studien neueren Studien, die die Eignung der gesamte Speichel, mit einem Durchschnitt von 4,3 x 10 ⁵ Zellen pro Milliliter, zum DNA-Test gegenüber den älteren Tupfern Verfahren, die signifikante Mengen an Speichel ^{2, 3, 4, 5} nicht erhalten hat ^{e, 6.} Während eine bescheidene Literatur existiert, die die Eignung der Gesamtspeichel abgeleiteten DNA für die Genotypisierung Anwendungen wie Microarray-basierte Methoden ^{8, 9, 10,} keine Studien haben untersucht, Next Generation Sequencing (NGS). Das Ziel für die Optimierung dieses ganze Speichel DNA Extraktionsprotokoll war es, Menge und Qualität für Anwendungen in der Genetik einer kosteneffektiven Weise, die leicht in Labore mit gemeinsamen Reagenzien und Verbrauchsmaterialien umgesetzt zu maximieren.

DNA-Extraktion aus Speichel erfordert mehrere Verfahren: 1) Sammlung und Lagerung, 2) Zell-Lyse, 3) RNase-Behandlung, 4) Proteinfällung, 5) Ethanol-Fällung, 6) DNA Rehydrierung. Die DNA-Stabilisierungspuffer-Lösung, beschriebenvorher ^2, Funktionen angemessen unverändert. Kein Versuch zur Optimierung der RNase-Behandlung und DNA Rehydratisierung Schritte wurde. Für jeden weiteren Schritt wurden mehrere Variablen, die Rendite auswirken könnten identifiziert. Jede Variable wurde einzeln manipuliert und Verbesserung der Ausbeute und Qualität wurde statistisch ausgewertet. Für Variablen, die gezeigt wurden, um die Ausbeute und / oder DNA-Qualität zu verbessern, wurden die optimalen Werte in der letzten Protokoll enthalten.

Protokoll

HINWEIS: Vor der Bereitstellung Speichelproben alle Probanden gaben Einwilligung gemäß den Richtlinien für die Behandlung von Menschen bei Nationwide Kinderkrankenhaus.

1. Speichelentnahme und Lagerung

1. Vor der Speichelentnahme, sicherzustellen, dass der Mund des Subjekts ist frei von Nahrung oder anderen Fremdstoffen, indem er das Thema spülen den Mund mit Wasser und die Vermeidung von Essen oder Trinken für 30 Minuten vor dem Sammeln der Probe.
2. Öffnen Sie ein 15 ml Zentrifugenröhrchen mit 2,5 ml DNA-Stabilisierungspuffer ² achten Sie darauf, berühren Sie nicht die Innenseite der Kappe oder ein Rohr, und haben das Thema spucken 2,5 ml Speichel in die Pufferlösung. Hinweis: Das Sammeln von mehr als 2,5 ml Speichel können Probenabbau von einem unzureichenden Verhältnis von DNA-Probe, um Stabilisierungspuffer führen. Sammeln zu wenig Speichel erwarteten Erträge aus dem Protokoll zu reduzieren. Um Sammelmengen auswerten, die Ziffern Steigungen auf der Seite von Ter Rohr.
3. Die Schutzkappe und mischen durch Umdrehen, bis die Mischung homogenisiert. Heftiges Schütteln ist nicht notwendig. Lagern Sie die Proben bei Raumtemperatur für die kurzzeitige Lagerung oder 4 ° C für die Langzeitlagerung (> 3 Monate).

2. Erste Vorbereitungen und Zell-Lyse

1. Vor Beginn der Extraktion, Hitze ein Wasserbad auf 37 ° C, und bereiten einem Eimer Eis. Drei 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen wird für jeden extrahierten Probe benötigt. Die drei Röhren wird verwendet, um die Zelle und Proteinpellet, die endgültige extrahiert gDNA und das Isopropanol und Ethanol-Überstände zu halten.
2. Abrufen Proben von Lagerung und Invertzucker Proben mehrmals dann Wirbel bei mittlerer Geschwindigkeit für 15 Sekunden.
3. Verzichten 2,5 ml Probe in ein sauberes 15 ml Zentrifugenröhrchen und 5 ml Zell-Lyse-Lösung. Die Probe 50-mal durch Inversion, und Inkubation bei RT für 30 min.

3. Entfernen RNA

1. Dann werden 40 ul RNase A Solution bei 100 mg / ml, und bei 37 ° C für 15 min.
2. Entfernen Sie die Probe aus dem 37 ° C warmen Wasserbad und kühlen auf Eis für 3 min.
   1. Nach der RNase A Inkubation wird die Temperatur des Wasserbades auf 65 ° C für die DNA Rehydratisierung Schritt des Protokolls.

4. Protein und Lipidentfernung

1. Dann werden 50 ul Proteinase K-Lösung bei 20 mg / ml, Mischung mehrfach durch Umdrehen und inkubiert bei Raumtemperatur für mindestens 30 min. Hinweis: Dies ist eine mögliche Pause Punkt für das Protokoll. Nach der Zugabe der Proteinase-K-Lösung, kann die Probe bei 4 ° C gelagert, bis die Extraktion abgeschlossen werden kann. Lagerung bei 4 ° C für bis zu 24 Stunden wurde nicht gezeigt, um eine signifikante Wirkung auf die Extraktionsausbeuten oder DNA-Qualität haben. Langfristige Lagerung in diesem Stadium noch nicht bewertet worden.
2. Fügen Sie 1,7 ml Protein Precipitation Lösung, Vortex kräftig für 20 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit und auf Eis für 10 min.
3. Nachdem die Proben auf Eis für 10 min, Zentrifuge für 10 min bei 3.000 × g und 4 ° C abgekühlt. Die gefällten Proteine ​​bilden muss eine enge Pellet, um fortzufahren. Wenn das Pellet ist nicht dicht oder die Lösung ist immer noch bewölkt, können die Proben auf Eis für 5 min mehr gekühlt werden und Zentrifugation wiederholt. Die Proben sind auf Eis gehalten werden, um eine enge Pellet gewährleisten.

5. Isolierung und Aufreinigung von gDNA

1. In einen sauberen 15 ml-Zentrifugenröhrchen, Pipetten 5 ml Isopropanol und 8 ul Glycogen reinen Lösung bei 20 mg / ml.
2. Gießen der Überstand, der gDNA aus Schritt 4.3 in das Rohr mit dem Isopropanol und Glykogen Lösung, wobei hinter dem ausgefällten Proteinpellet. Nachdem der Überstand wurde hinzugefügt, vorsichtig mischen die Probe 50-mal durch Umdrehen und Zentrifuge für 30 min bei 3.000 × g und 4 ° C liegt.
3. Gießen Sie den Überstand langsam in einen sauberen 15-ml-Tube. Nach Entfernen des Überstands, Zugabe von 1 ml 70% EthanolWaschen des Pellets langsam und sanft schaukel Bewegen des Ethanol über dem ausgefällten Pellet mehrmals. Bewahren Sie das Ethanol in die Röhre.
4. Nach der ersten Wäsche, Zentrifugieren Sie die Probe für 1 min bei 2.000 xg und 20 ° C. Dieser Zentrifugationsschritt kann entweder bei 4 ° C oder 20 ° C durchgeführt werden. Keine signifikante Wirkung der Temperatur für diesen Schritt hat sich gezeigt.
5. Nach der ersten Wäsche und Zentrifugation des Pellets, gießen Sie langsam den Ethanolwasch aus der Tube und entsorgen, dann eine zweite Wasch durch Wiederholen der Schritte 5.3 und 5.4.
6. Nach dem Entfernen des Überstands aus der zweiten Wasch Pellet an der Luft trocknen lassen für 15 Minuten.
   1. Wenn die Probe nicht vollständig getrocknet ist, an der Luft trocknen für weitere 15 min.

6. Rehydrierung von gDNA

1. Nachdem die Probe getrocknet werden 300 ul Tris-EDTA, das getrocknete Pellet gDNA rehydrieren.
2. Vortex die Probe für 5 Sekunden bei mittlerer Geschwindigkeit und in einen65 ° C heißen Wasserbad für 1 Stunde.
3. Entfernen Sie die Proben aus dem Wasserbad inkubiert und O / N bei RT.
   HINWEIS: Alle Produkte und Reagenzien sind in der Tabelle aufgeführten Materialien, sowie Tabelle 4.

Ergebnisse

Um die optimalen Parameter zu bestimmen für die DNA-Extraktion eine Reihe von gepaarten DNA-Extraktionen durchgeführt wurde. Eine einzelne Speichelprobe wurde aufgeteilt, und jede Portion mit einem von zwei möglichen Werten für eine bestimmte Variable getestet. Mindestens acht Wiederholungen jeder gepaarten Test durchgeführt (beispielsweise wurde ein einzelner Speichelprobe aliquotiert, um die Extraktion mit oder ohne anfängliche 50 ° C Inkubation Test). Gesamt-DNA-Ausbeute, die 260/280 Wert, desto 260/230 Wert...

Diskussion

Das vorliegende Verfahren ist eine optimierte DNA-Extraktionsprotokoll, die deutlich verbesserte Ausbeute von hochmolekularer DNA im Vergleich zu Standardmethoden, ohne dabei DNA-Qualität. Der entscheidende Schritt mit der größten Wirkung auf den Ertrag die meisten war Schritt 5.2, die eine längere Zentrifugation Schritt während Ethanol-Fällung als jeder veröffentlichten Protokoll hier, überprüft mit einer Ausnahme, die nicht weit verbreitet war ¹¹ umfasst. Keine Änderungen in der DNA-Qualität mit dieser läng...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
15 ml Zentrifugenröhrchen	Fisher	12-565-268
Zelllyselösung	Qiagen	158908
Proteinase K	Sigma	P6556
Proteinfällungslösung	Qiagen	158912
Isopropanol	Fisher	A416-4
Glykogen	EZ-BioResearch	S1003
70% Ethanol	Fisher	04-355-305
Tris-EDTA (TE)	Fisher	BP2473-1
NaCl	Fisher	AC194090010
Tris HCl	Fisher	BP1757-100
EDTA (0,5 M) Lösung	Fisher	03-500-506
Natriumdodecylsulfat	Fisher	BP166-100
Analoger Vortex-Mischer	Fisher	02-215-365
Zentrifuge 5810R	Eppendorf	5811 000.010