DNA-Extraktion aus Speichel kann eine leicht verfügbare Quelle für DNA mit hohem Molekulargewicht darstellen, mit wenig bis gar keiner Degradation/Fragmentierung. Dieses Protokoll bietet optimierte Parameter für die Speichelgewinnung/-lagerung und DNA-Extraktion, um von ausreichender Qualität und Quantität für nachgelagerte DNA-Assays mit hohen Qualitätsanforderungen zu sein.
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Methodenartikel
Sammlung und Extraktion von DNA-Speichel für Next Generation Sequencing
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die bevorzugte DNA-Quelle in der Humangenetik ist Blut oder aus Blut gewonnene Zelllinien, da diese Quellen große Mengen an hochwertiger DNA liefern. Die DNA-Extraktion aus Speichel kann jedoch qualitativ hochwertige DNA mit wenig bis gar keiner Degradation/Fragmentierung liefern, die für eine Vielzahl von DNA-Assays ohne die Kosten eines Phlebotomisten geeignet ist und sogar per Post erworben werden kann. Bisher wurden in der Literatur jedoch keine Speichel-DNA-Entnahme-/Extraktionsprotokolle für die Sequenzierung der nächsten Generation vorgestellt. Dieses Protokoll optimiert die Parameter der Speichelgewinnung/-lagerung und der DNA-Extraktion, um von ausreichender Qualität und Quantität für DNA-Assays mit den höchsten Standards zu sein, einschließlich Microarray-Genotypisierung und Next Generation Sequencing.
Einleitung
Erzielen hoher Qualität für die menschliche DNA genetische Studien ist wichtig, in der Krankheit Gen Entdeckungsprozess. Blut, obwohl erfordern ein invasives Verfahren und auch teurer als Speichelsammlung wird zum Erzeugen immortalisierter Zelllinien als eine unendliche Quelle von DNA oder iPSCs für funktionelle Studien bevorzugt, und manchmal Blut-DNA wird verwendet, wenn Zelllinien nicht vorhanden sind. , Blutgewinnung erfordert jedoch eine ausgebildete phlebotomist und Blut eine kürzere Halbwertszeit als Speichel 1 hat. DNA aus Speichel ist weniger teuer und leichter zu erhalten, da sie gesammelt und durch die Mail ohne die Notwendigkeit für eine Bluten....
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Protokoll
HINWEIS: Vor der Bereitstellung Speichelproben alle Probanden gaben Einwilligung gemäß den Richtlinien für die Behandlung von Menschen bei Nationwide Kinderkrankenhaus.
1. Speichelentnahme und Lagerung
- Vor der Speichelentnahme, sicherzustellen, dass der Mund des Subjekts ist frei von Nahrung oder anderen Fremdstoffen, indem er das Thema spülen den Mund mit Wasser und die Vermeidung von Essen oder Trinken für 30 Minuten vor dem Sammeln der Probe.
- Öffnen Sie ein 15 ml Zentrifugenröhrchen mit 2,5 ml DNA-Stabilisierungspuffer 2 achten Sie darauf, berühren Sie nicht die Innenseite der Kappe oder ein Rohr, und haben das Thema spucken....
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Ergebnisse
Um die optimalen Parameter zu bestimmen für die DNA-Extraktion eine Reihe von gepaarten DNA-Extraktionen durchgeführt wurde. Eine einzelne Speichelprobe wurde aufgeteilt, und jede Portion mit einem von zwei möglichen Werten für eine bestimmte Variable getestet. Mindestens acht Wiederholungen jeder gepaarten Test durchgeführt (beispielsweise wurde ein einzelner Speichelprobe aliquotiert, um die Extraktion mit oder ohne anfängliche 50 ° C Inkubation Test). Gesamt-DNA-Ausbeute, die 260/280 Wert, desto 260/230 Wert.......
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Diskussion
Das vorliegende Verfahren ist eine optimierte DNA-Extraktionsprotokoll, die deutlich verbesserte Ausbeute von hochmolekularer DNA im Vergleich zu Standardmethoden, ohne dabei DNA-Qualität. Der entscheidende Schritt mit der größten Wirkung auf den Ertrag die meisten war Schritt 5.2, die eine längere Zentrifugation Schritt während Ethanol-Fällung als jeder veröffentlichten Protokoll hier, überprüft mit einer Ausnahme, die nicht weit verbreitet war 11 umfasst. Keine Änderungen in der DNA-Qualität mit dieser läng.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von einem National Institutes of Health R01 finanziert (DC009453 Unterstützung des CWB).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 15 ml Zentrifugenröhrchen | Fisher | 12-565-268 | |
| Zelllyselösung | Qiagen | 158908 | |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | |
| Proteinfällungslösung | Qiagen | 158912 | |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 | |
| Glykogen | EZ-BioResearch | S1003 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 | |
| NaCl | Fisher | AC194090010 | |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 | |
| EDTA (0,5 M) Lösung | Fisher | 03-500-506 | |
| Natriumdodecylsulfat | Fisher | BP166-100 | |
| Analoger Vortex-Mischer | Fisher | 02-215-365 | |
| Zentrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
Referenzen
- Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies. Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).
- Min, J. L., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
