Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

Summary

Kortikaler Netzwerke werden von einem kleinen, aber vielfältige Reihe von hemmenden Inter gesteuert. Funktionelle Untersuchung von Inter erfordert daher gezielte Aufnahme und strenge Identifizierung. Hier beschrieben wird, ist ein kombinierter Ansatz, der Ganzzellableitungen von einzelnen oder synaptisch gekoppelten Paare von Neuronen mit intrazelluläre Markierung, Post-hoc-morphologische und immunzytochemische Analyse.

Abstract

GABAergen inhibitorischen Inter spielen eine zentrale Rolle in neuronalen Schaltkreisen des Gehirns. Inter umfassen eine kleine Teilmenge der neuronalen Population (10-20%), zeigen aber eine hohe physiologische, morphologische und neurochemische Heterogenität, was ihre vielfältigen Funktionen. Daher Untersuchung von Inter bietet wichtige Einblicke in die Organisationsprinzipien und Funktion neuronaler Schaltkreise. Dies erfordert jedoch einen integrierten physiologischen und neuroanatomische Ansatz für die Auswahl und Identifizierung der einzelnen Interntypen. Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen von akuten Hirnschnitten von transgenen Tieren exprimieren fluoreszierende Proteine ​​unter den Promotoren von Internspezifische Marker, ein effizientes Verfahren zur gezielten elektrophysiologisch zu charakterisieren intrinsischen und synaptischen Eigenschaften bestimmter Interntypen. Verbindung mit intrazellulären Farbstoff Kennzeichnung kann dieser Ansatz mit post-hoc mo verlängertrphological und immunzytochemische Analyse zur systematischen Identifizierung von aufgezeichneten Neuronen. Diese Verfahren können angepaßt werden, um eine breite Palette von wissenschaftlichen Fragen zu funktionellen Eigenschaften der verschiedenen Arten von kortikalen Neuronen entsprechen.

Introduction

Hippocampus neuronale Schaltkreise sind seit langem Gegenstand intensiver Kontrolle, sowohl in Bezug auf die Anatomie und Physiologie, die aufgrund ihrer wesentlichen Rolle bei Lernen und Gedächtnis sowie räumliche Navigation bei Mensch und Nager. Ebenso die prominenten, aber einfache laminare Organisation des Hippocampus macht diese Region zu einem beliebten Thema der Studien zu strukturellen und funktionellen Eigenschaften der kortikalen Netzwerke.

Hippocampus-Schaltungen sind von exzitatorischen Hauptzellen (> 80%) und einer kleineren (10-20%), aber sehr unterschiedliche Gruppe von hemmenden Inter ^1-3 besteht. Interfrei γ-Aminobuttersäure (GABA) aus ihrer Axonterminalen, die bei schnellen ionotropen GABA _A-Rezeptoren wirkt (GABA _A Rs) und langsamen metabo _{GABA-B-Rezeptoren} (GABA _B Rs) ^4. Diese inhibitorischen Mechanismen entgegenzuwirken Anregung und regulieren deren Erregbarkeit der Hauptzellen und damit dieir Timing und Muster der Entladung. GABA von Inter freigegeben wirkt jedoch nicht nur von den Hauptzellen, sondern auch auf die Inter sich ^5,6. Pre-und postsynaptischen Rezeptoren vermitteln Feedback-Regulation und hemmenden Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Arten von Interneuron. Diese hemmenden Mechanismen im Intern Netzwerke sind vermutlich zentral für die Erzeugung und Gestaltung der Bevölkerung Aktivitätsmustern, insbesondere Schwingungen zu sein bei verschiedenen Frequenzen ^7.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufzeichnung ist eine gut etablierte Methode für die Prüfung der Eigenschaften und der synaptischen Interaktion von Neuronen. Aufgrund der hohen Vielfalt Interntypen, die Untersuchung von hemmenden Inter erfordert jedoch strenge Identifizierung der Zellen aufgenommen. Wie Hippocampus Interntypen werden durch verschiedene morphologische Merkmale und neurochemische Marker Ausdruck, kombiniert anatomischen und immunzytochemische e gekennzeichnetxamination kann ein Mittel, um präzise Intern Identität ^6,8,9 zu bestimmen.

In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir einen experimentellen Ansatz, in der Ganzzell Patch-Clamp-Aufnahmen von einzelnen Neuronen oder synaptisch gekoppelten Paare werden mit intrazelluläre Markierung kombiniert, gefolgt von Post-hoc-morphologische und immunzytochemische Analyse, so dass für die Charakterisierung von langsam GABA _B Rezeptor-vermittelte hemmende Wirkung in Inter identifiziert. Als ein Beispiel, konzentrieren wir uns auf eine wichtige Art der Intern, einer Untergruppe der so genannten "Korbzellen" (BC), die die Soma und proximalen Dendriten der postsynaptischen Zielinnerviert und wird von einem "schnellen Spick" (FS) gekennzeichnet entladen Muster, ein Axon dicht auf den Zellkörperschicht, und die Expression des Calcium-bindende Protein Parvalbumin (PV) ^10,11. Diese Inter anzuzeigen große postsynaptischen inhibitorischen Ströme, sowie prominente vorgesynaptischen Modulation der synaptischen Ausgang in Reaktion auf GABA _{B-Aktivierung} R ^12. Die Kombination der hier beschriebenen Techniken können ebenso gut eingesetzt werden, um intrinsische oder synaptischen Mechanismen in einer Vielfalt von anderen identifizierten Neuron Typen zu untersuchen.

Protocol

Ethikerklärung: Alle Verfahren und Tier Wartung wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts durchgeführt, die deutsche Tierschutzgesetz hat der Europäische Rat die Richtlinie 86/609 / EWG über den Schutz von Tieren und Richtlinien von den lokalen Behörden (Berlin, T-0215/11 )

1. Herstellung der Akute-Hippocampus

1. Nehmen Sie ein transgenes Ratten (17 bis 24 Tage alt), die Leuchtstoff Venus / YFP Protein unter der VGAT Promotor, der die Mehrheit der kortikalen inhibitorischen Inter ¹³ Etiketten zum Ausdruck. Enthaupten die Ratte. Rasch zerlegen Gehirn (<40 sec) in semifrozen, carbogenated (95% O _2/5% CO ₂₎ auf Basis Saccharose künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF Saccharose, 1A).
2. Bewerten Sie die sezierten Rattenhirn für Venus / YFP Fluoreszenz mit einer 505 nm LED-Lampe und Emissionsfilter 515, auf einer Schutzbrille angebracht.
3. Entfernen Sie die Front Drittel des Kortex und Cerebellum; dann trennen die Halbkugeln, die alle mit einem Skalpell. Entfernen Sie die Rückenfläche des Kortex um eine flache Oberfläche, um das Gehirn zu kleben nach unten zu schaffen, wie zuvor beschrieben ^14.
4. Geschnitten Querschnitt (300 um) des Hippocampus auf einer Vibratom sollten die Halbkugeln mit semifrozen umgeben sein, carbogenated Saccharose-ACSF (1B) ^14. Entfernen Sie zusätzliche Regionen rostral Kortex, Mittelhirn und Hirnstamm. Übertragen Sie jede Scheibe zu einem untergetauchten Haltekammer, die Saccharose-ACSF, die carbogenated und erwärmt auf 35 ° C.
5. Lassen Sie die Scheiben bei 35 ° C für 30 min von der Zeit der letzten Scheibe in die erwärmte ACSF erholen. Tun Sie dies, um Stoffwechselprozesse zu aktivieren und erleichtern die Wiederverschließen geschnitten neuronale Prozesse. Dann übertragen auf Raumtemperatur für die Lagerung (Abbildung 1c).

2. Herstellung und Abfüllung von Aufnahme-Pipetten

1. Pull Patchpipetten von Glaskapillaren, so dass eine Pipette Widerstand von 2-4 MOhm wird erreicht, wenn mit filtriert gefüllt (Spritzenfilter, Porengröße: 0,2 um) die intrazelluläre Lösung, die 0,1% Biocytin (für intrazelluläre Markierung). Halten Sie die intrazelluläre Lösung auf Eis gekühlt, um den Abbau seiner Bestandteile zu verhindern.
2. Füllen Patch-Pipetten zur Identifizierung von postsynaptischen Ströme mit einer Lösung, die eine physiologisch relevante niedrigen Cl ^- Konzentration (E _{R (Cl)} = -61 mV, siehe Lösung Liste).
3. Für gepaarte Aufnahmen auf der präsynaptischen Rezeptor-vermittelten Reaktionen zu identifizieren, füllen Patch-Pipetten mit intrazellulären Lösung mit niedrigen Ca2 ^{+-Pufferkapazität,} um Interferenzen mit Transmitterfreisetzung präsynaptisch zu verhindern, sowie 4-fach höhere Cl ^- Konzentration (E _{R (Cl)} = -20 mV) zur Verbesserung der Signal-zu-Rauschen der beobachteten IPSCs ⁵ was eine genaue Beurteilung der pharmakologischen bzw.onsiveness. Beachten Sie, dass Änderung Cl ^- Konzentration IPSC-Kinetik ¹⁵ ändern.

3. Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahme von FS-ins

1. Carbogenate ACSF und Futtermittel durch das Perfusionssystem zu der Aufzeichnungskammer, mittels einer Schlauchpumpe (der auch entfernt von der Aufzeichnungs ACSF Kammer über eine Saugleitung, Figur 2A). Schalten Sie alle Geräte auf dem Setup in der Vorbereitung für die Aufnahme.
2. Übertragen einer Scheibe auf die Aufnahme Kammer und halten Sie ihn mit einem Platin-Ring mit einzelnen Fasern aus Seide bespannt. Positionieren Sie die Scheibe, so dass die Schicht (str.) Pyramidale der CA1 läuft vertikal durch das Sichtfeld, die den Zugang mit 2 Pipetten sowohl auf die str. radiatum und str. Oriens gleichzeitig (2C und 4A).
3. Legen Sie die Kammer in das Setup und starten Perfusion carbogenated und erwärmt (32-34 ° C) Aufnahme einesCSF bei einer Flußrate von 5-10 ml / min.
4. Beurteilen Scheibenqualität unter IR-DIC-Optik mit 40x Objektivvergrößerung und visualisieren mit einer CCD-Kamera auf einem Display angezeigt. Annehmen gutes Stück Qualität, wenn eine große Anzahl von runden, mäßig gegen CA1-Pyramidenzellen (CA1 PC) in str gesehen werden. pyramidale in einer Tiefe von 20-30 um unter einer glatten und leicht Kraterlandschaft (Abbildung 2C). Schlechte Qualität Scheiben enthalten eine große Zahl von sehr kontrast, geschrumpft oder geschwollene Zellen, mit einer unebenen Oberfläche Scheibe.
5. Identifizieren mutmaßlichen FS Inter unter Epifluoreszenz Beleuchtung wie die Venus auszudrücken / YFP (2B), mit großen multipolaren Somata in oder in der Nähe des str. pyramidale. Markieren Sie die Zellen einigermaßen tief in die Scheibe (50-100 um, 2C), um eine bessere Erhaltung ihrer morphologischen Integrität.
6. Montieren Sie den Aufnahme-Elektrode in der Pipette Halter auf der heads; dann Apply ein geringer positiver Druck (20-30 mbar) durch die Schlauchleitung. Senken der Pipette auf die Oberfläche der Scheibe, leicht zu dem Zentrum des Neurons ausgewählt versetzt.
7. Erhalten whole-cell-Konfiguration wie zuvor beschrieben, und ^14,16 siehe auch Bilder in 2D und 2E:
   1. Zielen auf eine Zelle: Erhöhen Sie den Druck auf 70-80 mbar und schnell senken Sie die Pipette durch die Scheibe, gerade über die Soma der ausgewählten Zelle (Abbildung 2D, oben).
   2. Nähern Sie sich dem Zell: Drücken Sie die Pipette gegen die Zellmembran erzeugen eine "Delle" auf sie (2D, oben). Führen Sie diesen Schritt schnell, um Biocytin Kennzeichnung von Nachbarzellen zu verhindern.
   3. Erstellen Sie eine Giga-Ohm-Siegel: Lassen Sie den Druck und gleichzeitig gelten eine 20 mV Spannungsbefehl mit der Pipette. Ein Giga-Ohm-Dichtung (1-50 GOhm; 2D, unten und 2E Mitte) typicVerbündeten entwickelt sich schnell. Einmal versiegelt, gelten die zu erwartende Ruhemembranpotential (typischerweise zwischen -70 und -60 mV) als Spannungsbefehl.
   4. Durchbrechen Sie den Patch: Einmal versiegelt, reißen die Membran-Patch mit einem kurzen Impuls von Unterdruck; wodurch die Gesamtzellkonfiguration (2E, unten) erreicht wird.
8. Ausgleich Ganzzellkapazität und Serienwiderstand (R _S). R _s ist normalerweise 5-20 MOhm und stabil für bis zu 120 min. Aufzugeben, wenn Zellen Membranpotential (V _M) auf Durchbruch ist mehr als -50 mV depolarisiert; R _S anfänglich größer als 30 MOhm; oder R _S um mehr als 20% im Verlauf der Aufzeichnung.
9. Identifizieren FS-Ins durch ihre Reaktion (im Current-Clamp-Modus) zu einer Familie von Hyperstromimpulse depolarisierende (-250 bis +250 pA, 2F, oben). FS-Ins haben relativ Verzehr V _M (typischerweise -50 to -60 mV), kurze Membranzeitkonstante (<20 ms) und auf einem 500 pA depolarisierende Strominjektion mit einem Zug von Aktionspotentialen (APs) bei Frequenzen> 100 Hz ¹¹ (2F, unten), die deutlich sind von denen in CA1 PCs (2F, Mitte).

4. Extrazelluläre Elektrostimulation GABA _B R-vermittelte Antworten Evoke

1. Um synaptisch hervorgerufenen Reaktionen zu beobachten, positionieren Sie eine extrazelluläre Stimulationselektrode (eine Patch-Pipette mit 2 M NaCl gefüllt; Widerstand: 0,1-0,3 MQ) in der Scheibe an der Grenze von str. radiatum und str. lacunosum-moleculare. Positionieren Sie die Elektrode 200-300 um lateral der Soma der direkten elektrischen Stimulation der Zelle zu verhindern und zu minimieren Stimulation Artefakten (3A).
2. Nachdem der Stimulationselektrode angeordnet ist, zu erhalten, Ganzzell-Aufzeichnungdie gewählte Zelle und Beurteilung der physiologischen Phänotyp in Current-Clamp-Modus, wie in Abschnitt 3.9 (3B).
3. Mit dem Neuron in Voltage-Clamp (V _M -65 mV) aufgezeichnet, liefern elektrische Stimulation der präsynaptischen Axone bei 50 V (~ 500 uA wirksame Reiz) alle 20 sec, das eine isolierte Konstantspannungs Stimulator. Benutzen Reize (100 us Dauer, 3C, oben) zu GABA _B R vermittelten IPSCs beobachten und zu verschachteln mit Zügen von mehreren Stimuli (bei ​​200 Hz) zu mehr Transmitterfreisetzung zu produzieren.
4. Bad gelten ionotropen Glutamat-Rezeptor-Antagonisten (AMPA-Rezeptor: DNQX [10 uM]; NMDA-Rezeptor: D-AP5 [50 uM]), um die isolierte monosynaptische IPSC (3C, in der Mitte oben) zu offenbaren. Ferner isolieren die _{GABA-vermittelte} Ik R unter Anwendung eines GABA _A R Blocker (gabazine [10 uM], 3C Mitte lower).
5. Bestätigen Sie die resultierende langsam Auswärtsstrom (3C niedriger, erweitert) als GABA _B durch die anschließende Anwendung von CGP-55845 [5 uM] (3C unteren, grau unterlegt) R-vermittelten

5. Gekoppelte Aufnahmen von Synaptisch Gekoppelt FS-IN und CA1-PCs

1. Beurteilen GABA _B R-vermittelten präsynaptischen Steuerung inhibitorische synaptische Übertragung bei gleichzeitiger Aufnahme zwischen synaptisch-gekoppelt und PC Paaren durchgeführt, wie unten beschrieben.
2. Zuerst stellen Sie eine Ganzzell Aufnahme einer präsynaptischen Intern (wie in Abschnitt 3) und bestätigen Sie den FS-Phänotyp (4A).
3. Dann patchen eine benachbarte CA1 PC (20-100 um Abstand, 4A) und gelten kurze überschwelligen depolarisierende Strompulse (1 ms Dauer, 1-5 nA Amplitude) mit der präsynaptischen IN (in Current-Clamp-Modus gehalten werden), um APs zu entlocken. Wenn einem synaptischen Connection vorhanden ist, APs in der IN-Ergebnis in IPSCs in der CA1-PC, der Spannung-Klammer gehalten (Ausgleich R _S bis etwa 80%).
4. Wenn nötig, füllen Sie eine neue Aufnahme-Elektrode und Datensatz aus weiter CA1-PCs, bis eine Verbindung gefunden.
5. Sobald eine Verbindung hergestellt ist, entlocken Paare von APs in der präsynaptischen FS-IN, sowohl die synaptische einheitliche Reaktion und das dynamische Verhalten zu beurteilen. Verwenden Sie einen typischen gepaart Puls-Protokoll von 2 depolarisierende Stimuli mit einer 50 ms-Intervall (4B).
6. Steuer sammeln Spuren im Ausgangsbedingungen. Dann gelten die selektiven GABA _B-Agonisten Baclofen R (10 uM), um die Perfusion von ACSF aktiviert somit GABA _B Rs, gefolgt von der Antagonist CGP-55845 (5 uM), um vollständig blockieren die Rezeptor vermittelten Wirkungen. Sammeln ~ 50 Spuren im stationären Zustand jedes Medikament Zustand (4B und C).
7. Sobald die Aufnahme abgeschlossen ist, dichten die somatischen Membran durch die Bildung eines outside-out-Patch: Ziehen Sie langsam die Pipette aus dem Zellkörper in V-Klemme und wie die R _S steigt, verringern Sie die V bis -40 mV _M. Tun dies, um die Bildung der Outside-out-Patches zu erleichtern; entfernen Sie dann die Pipette aus dem Bad.

6. Analyse der elektrophysiologischen Eigenschaften

1. HINWEIS: Eine Vielzahl von verschiedenen Software-Pakete sind für den Erwerb von elektrophysiologischen Daten verfügbar. Hier WinWCP, ein Windows-Programm in der freien Software-Paket Strathclyde Elektrophysiologie verwendet, die Aufzeichnung von bis zu 16 Analogeingangskanäle und Ausgangs von 10 digitalen Signalen ermöglicht.
2. Tiefpassfilter alle Daten bei 5-10 kHz und Probe bei 20 kHz.
3. Analyse physiologischer Daten mit einer Offline-Analyse-Suite.
   HINWEIS: Stimfit, ein Open-Source-Software-Paket, das eine Python-Shell wird in diesem Fall verwendet wird, beinhaltet; aber andere Alternativen können leicht stattdessen verwendet werden.
   1. Analysieren Passivmembran pigenschaften der aufgezeichneten Neuronen, in Stromzange erworben, von Ruhemembranpotential.
   2. Messung der mittleren Ruhemembranpotential von der Grundlinie der aufgezeichneten Antworten von dem Beginn der Aufzeichnung.
   3. Berechnen Eingangswiderstand unter Verwendung des Ohmschen Gesetzes, aus der Spannung als Reaktion auf die kleinste Hyperpolarisierungsstromimpulse (≤ -50 pA). Zur Verbesserung der Signal-Rausch-Verhältnis, durchschnittlich mehrere Spuren. Hinweis: Unsere Beispiele sind in der Regel Durchschnittswerte von 10-50 einzelnen Sweeps.
4. Schätzen Sie die scheinbare Membran Zeit durch den Einbau einer monoexponentiellen Kurve, um den Zerfall der Antworten auf die kleinste Hyperpolarisation Stromimpulse konstant.
5. Analysieren Aktionspotential Wellenform Schwelle, Amplitude (Schwelle zur Spitze) und Dauer (Breite gemessen in halber Höhe) von Schwellenwert depolarisierende Stromimpulse ausgelöst bestimmen.
6. Analysieren GABA _B R vermittelten IPSCs von Voltage-Clamp-Aufnahmen. Filter zeichnet off-line zu500 Hz (Gauß-Filter) und bewertet die Spitzenamplitude und die Latenz des GABA _B R vermittelte Reaktion (im Mittelwerte von mindestens 10 Spuren).
7. Erkennen die Wirkung von GABA _B Rs auf der inhibitorischen Ausgang INs als eine Änderung der Spitzenamplitude des GABA _A R-vermittelten IPSCs zwischen Peak und der vorhergehenden Ausgangswert gemessen. Berechnen Sie die mittlere Amplitude von ≥50 Spuren für die Steuerperiode und der stationären aller pharmakologischen Epochen.

7. Visualisierung und Immunocytochemistry der FS-Ins

1. Nach den Aufnahmen, fixieren die Scheiben durch Eintauchen in 4% Paraformaldehyd mit 0,1 M Phosphatpuffer (PB, pH = 7,35) O / N bei 4 ° C.
2. Ggf. Scheiben kann PB für bis zu ca. 1 Woche vor der Verarbeitung übertragen und gespeichert werden.
3. Wasch Scheiben reichlich frische PB und anschließend in 0,025 M PB mit 0,9% NaCl (PBS, pH = 7,35).
4. Um nicht-spezifische Antikörper Bindung zu reduzieren, blockieren die Scheiben for 1 h bei RT in einer Lösung mit 10% normalem Ziegenserum (NGS), 0,3% Triton-X100 (ein Detergens, Membranen durchdringbar) und 0,05% NaN ₃ in PBS hergestellt.
5. Für PV Ausdruck kennzeichnen, verwendet eine Anti-PV monoklonalen Maus-Antikörpers in einer Lösung, die 5% NGS, 0,3% Triton-X100, 0,05% NaN ₃ in PBS verdünnt. Inkubieren Primärantikörper für 2-3 Tage bei 4 ° C ^12. Spülen Sie gründlich in PBS Scheiben.
6. Anwenden fluoreszierenden Anti-Maus-Sekundärantikörper (zB AlexaFluor-546.) Zusammen mit dem Biotin-Bindungsprotein Streptavidin, konjugiert an ein Fluorochrom (zB AlexaFluor-647); und Inkubation in einer Lösung, enthaltend 3% NGS, 0,1% Triton-X100, 0,05% NaN _3, verdünnt in PBS und Inkubation O / N bei 4 ° C ist.
7. Zügig spülen Scheiben 2-3 x mit PBS, gefolgt von 2-3 Spülungen in PB. Montieren Sie die Scheiben auf Glasobjektträger. Verwenden Sie ein 300 um Agar Abstandshalter an der Scheibe vor dem Kollaps zu verhindern. Deckglas Scheiben mit einer LeuchtstoffCent Montagemedium und Dichtung mit Nagellack.

8. Imaging und Rekonstruktion der Visualisierte FS-Ins

1. Visualisieren Sie die Scheiben mit einem konfokalen Mikroskop, mit dem Reporter aufgeregt fluorochome mit der entsprechenden Laserlinie (635 nm Diodenlaser für AlexaFluor-647; Helium-Neon-543 nm-546 für AlexaFluor Kennzeichnung für PV-und Argon 488 oder 515 nm für Venus / YFP).
2. Aufnehmen von Bildern an einer geeigneten Z-Auflösung (typischerweise 0,5-1 um Schritte mit einem 20x-Objektiv), um ein Z-Stapel von der ganzen Zelle zu erzeugen. Mehrere Stapel werden üblicherweise Bildes benötigt die gesamte Zelle, die digital off-line unter Verwendung Fiji / ImageJ Software (5A) genäht werden kann.
3. Rekonstruieren die Zelle aus dem Bildstapel genäht mit einem halbautomatischen Ablaufverfolgungsmethode (Simple Neuriten Tracer-Plugin in Fiji / ImageJ-Software-Paket ^17, Bild C).
4. Schließlich bewerten die PV-Immunreaktivität des interneuron mit einer hohen numerischen Apertur Objektivlinse (60X siliciumSion, NA = 1,3). Machen Sie Bilder des Soma, proximalen Dendriten und Axon proximalen oder alternativ von Axonterminalen wenn somatische Auswaschen der PV ist zu stark. Zellen werden als immunreaktiv für PV, wenn Immunmarkierung ist zu sehen, mit den Biocytin-markierten Strukturen (5B) auszurichten.

Results

Vorausgesetzt, dass Scheibenqualität ist spürbar gut, die Aufnahme von beiden CA1-PCs und FS-Ins können mit minimalen Schwierigkeiten erreicht werden. Die transgenen Rattenlinie, Venus / YFP unter der VGAT Promotor ¹³ nicht eindeutig identifizieren FS-Ins oder auch BC. Allerdings Aufnahmen von INS in und um str. pyramidale, wo die Dichte der FS-ins ist typischerweise hoch ^1, ergibt sich eine hohe Wahrscheinlichkeit der Auswahl FS-Ins (2B). FS-Ins durch ihre charakteristisc...

Discussion

Wir beschreiben eine Methode, die elektrophysiologische und neuroanatomische Techniken kombiniert, um funktionell zu charakterisieren morphologically- und neurochemisch identifizierten Neuronen in vitro; insbesondere die verschiedenen Arten von kortikalen inhibitorischen Ins. Schlüsselaspekte des Verfahrens sind: (1) Vorauswahl der potenziellen IEE; (2) die intrazelluläre Aufnahme und Neuron Visualisierung; und schließlich (3) morphologische und immunzytochemische Analyse von aufgezeichneten Ins. Obwohl diese Studie hat...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transgene vGAT-Venus-Ratten			siehe Uematsu , et al., 2008
Venus (515 nm) Brille	BLS Ltd., Ungarn
Dissektionswerkzeuge	d.h. FST		Zur Entfernung des Gehirns
Vibratome	Leica	VT1200S	Oder andere High-End-Vibratome mit minimaler vertikaler Oszillation
Kammern			Sonderanfertigung im Labor
Aufrechtes IR-DIC-Mikroskop	Olympus, Japan	BX50WI	Mit Mikromanipulator-System; i.d. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.
CCD-Kamera	Till Photonics	VX55
505 nm LED-System	Cairn Research	OptiLED-System	Oder Quecksilberlampe oder anderes LED-System i.e. CooLED.
Multiclamp 700B	Axon Instruments		alternativ 2x Axopatch 200B Verstärker
WinWCP-Erfassungssoftware	John Dempster, Strathclyde University		Jede qualitativ hochwertige Erfassungssoftware kann verwendet werden, d.h. EPHUS, pClamp, Igor usw.
Elektrodenabzieher	Sutter	P-97	Wird mit Box-Filament
Borosilikat-Pipettenglas	verwendet Hilgenberg, Deutschland	1405020	2 mm außen, 1 mm Innendurchmesser, kein Filament
Peristaltikpumpe	Gilson	Minipuls	Andere Pumpen oder Schwerkraftzufuhr könnten stattdessen verwendet werden
Digitales Thermometer			Maßgeschneidertes
digitales Manometer	Supertech, Ungarn
Isolierter Konstantspannungsstimulator	Digitimer Ltd.	DS-2A
Biocytin	Invitrogen	B1592	Auch bekannt als ε-Biotinoyl-L-Lysin
DL-AP5(V)-Dinatriumsalz	Abcam Biochemicals	ab120271
DNQX Dinatriumsalz	Abcam Biochemicals	ab120169	Alternativ NBQX oder CNQX
Gabazin (SR95531)	Abcam Biochemicals	ab120042	Alternativ Bicucullinmethiodid
R-Baclofen	Abcam Biochemicals	ab120325
CGP-55,845 Hydrochlorid	Tocris	1248
Streptavidin 647	Invitrogen	S32357
monoklonaler Anti-PV-Antikörper für die Maus	Swant, Schweiz	235	Arbeitskonzentration 1:5.000-1:10.000
Anti-Maus-Sekundärantikörper	Invitrogen	A11030	Bei Verwendung von Venus- oder GFP-Nagetieren ist die Verwendung eines Rotkanals (d.h. 546 nm) ratsam.
Normale Ziegenserum	Vektor Labs	S-1000
Mikroskopie-Objektträger			Jede hochwertige Marke
Glasdeckgläser			Normalerweise 22 x 22 mm
Agar-Abstandshalter			Agar-Block, geschnitten auf Vibratom auf 300 μ; m
Konfokales Laserscanning-Mikroskop	Olympus, Japan	Fluoview FV1000	Oder ein anderes vergleichbares System
Fidschi (Fidschi ist nur ImageJ)	http://fiji.sc/Fiji		Siehe Schindelin et al., 2012