Methodenartikel

Ein Funktionstest für Gap Junction-Prüfung; Elektroporation von adhärenten Zellen auf Indium-Zinn-Oxid

DOI:

10.3791/51710

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18. Oktober 2014

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1Department of Microbiology and Immunology and Department of Pathology, Queen's University, 2Ask Science Products Inc.

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Diese Präsentation demonstriert eine Methode, bei der die Elektroporation von adhärenten, kultivierten Zellen zur Untersuchung der interzellulären, junktionalen Kommunikation verwendet wird, während die Zellen auf einem Objektträger wachsen, der mit leitfähigem und transparentem Indium-Zinnoxid beschichtet ist.

Zusammenfassung

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Bei dieser Technik werden Zellen auf einem Objektträger kultiviert, der teilweise mit Indium-Zinnoxid (ITO), einem transparenten, elektrisch leitfähigen Material, beschichtet ist. Eine Vielzahl von Molekülen, wie z.B. Peptide oder Oligonukleotide, können auf im Wesentlichen 100% der Zellen auf nicht-traumatische Weise eingeführt werden. Hier beschreiben wir, wie es zur Untersuchung der interzellulären, gap junctionalen Kommunikation verwendet werden kann. Luzifergelb dringt in die Zellen ein, wenn ein elektrischer Impuls, der auf die leitfähige Oberfläche angelegt wird, auf der sie wachsen, dazu führt, dass sich Poren durch die Zellmembran bilden. Das ist die Elektroporation. Zellen, die auf der nichtleitenden Glasoberfläche unmittelbar neben dem elektroporierten Bereich wachsen, nehmen Luzifergelb nicht durch Elektroporation auf, sondern erhalten den Fluoreszenzfarbstoff, da er über Gap Junctions, die sie mit den elektroporierten Zellen verbinden, zu ihnen geleitet wird. Die Ergebnisse des Transfers von Farbstoff von Zelle zu Zelle können mikroskopisch unter Fluoreszenzbeleuchtung beobachtet werden. Diese Technik ermöglicht eine präzise Quantifizierung der Gap-Junctional-Kommunikation. Darüber hinaus kann es für die Einführung von Peptiden oder anderen nicht permeierten Molekülen verwendet werden, und die Übertragung von kleinen elektroporierten Peptiden über Gap Junctions zur Hemmung des Signals in den benachbarten, nicht elektroporierten Zellen ist eine kraftvolle Demonstration der Signalhemmung.

Einleitung

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Das Anlegen von elektrischem Strom an eine Zelle die Bildung von Poren in der Zellmembran durch ein Verfahren, genannt Elektroporation. Die Poren ermöglichen den Durchgang von einer Vielzahl von nonpermeant Moleküle durch die Membran. Das elektrische Feld kann präzise gesteuert werden, so daß die gebildeten Poren sind sehr klein und schnell wieder zu schließen, mit minimaler Störung der Zellphysiologie. Interessanterweise können anhaftende Zellen auf einem Objektträger mit einer leitfähigen und transparenten Indium-Zinn-Oxid (ITO) beschichtet und in situ elektroporiert, die auf der Oberfläche, wo sie wachsen angebaut werden, ohne abgelöst zu Suspension elektroporiert werden. Zellen können sehr gut auf dieser Fläche wachsen und wie sie gebunden sind, und erweiterte detaillierte mikroskopische Beobachtung möglich ist. Mit dieser Technik können kleine Moleküle nonpermeant sofort und eingeführt werden, in im wesentlichen 100% der Zellen, die diese Technik besonders für Studien über die Aktivierung comp machtonents eines Weges folgenden Liganden Stimulation eines Rezeptors (Übersicht in 1).

Elektroporation wurde hauptsächlich für die Einführung von DNA (auch Elektrotransfektion) verwendet. Jedoch kann die Elektroporation in situ wertvoll für die Einführung einer großen Vielfalt von Molekülen, wie Peptiden 2-4, Oligonukleotide, wie Antisense-RNA, Doppelstrang-DNA-Decoy-Oligonukleotide zur Hemmung der Bindung von Transkriptionsfaktoren oder siRNA 3,5, 6, radioaktive Nukleotide 7-10, Proteine ​​11 12 oder 13 Pro-Drugs. Nach der Elektroporation können Zellen für biochemische Analysen lysiert oder fixiert und mit Antikörpern gefärbt.

Die leitfähige ITO-Beschichtung ist sehr dünn, 800-1,000Å, so dass das Zellwachstum wird durch die Höhendifferenz der beiden Oberflächen gestört, da die Zellen wachsen über die Kante der leitenden Beschichtung. Dies bietet den Vorteil, dass nicht-electroporated Zellen elektroporiert mit denen gezüchtet werden Seite an Seite, um als Kontrollen dienen. Der gleiche Ansatz kann für die Prüfung von Gap Junction, interzelluläre Kommunikation (GJIC) verwendet werden, wie im Video beschrieben.

Gap junctions sind Kanäle, welche die Innenräume von benachbarten Zellen 14. Gap Junction, spielt der interzellulären Kommunikation eine wichtige Rolle bei der Tumorentstehung und Metastasierung, während Onkogene wie Src unterdrücken GJIC 15,16. Zu prüfen GJIC einen fluoreszierenden Farbstoff, wie Lucifer Gelb (Ly) wird oft in kultivierte Zellen durch Mikroinjektion eingeführt oder kratzen Lade 17 und der Diffusion des Farbstoffs in die benachbarte Zellen mikroskopisch unter Fluoreszenzbeleuchtung beobachtet. Diese Techniken führen jedoch unweigerlich Zellschäden. Wir beschreiben nun ein Verfahren, bei dem Zellen auf einem Objektträger, der teilweise mit ITO beschichtet 18 gewachsen. Ein elektrischer Impuls wurde in Gegenwart von LY (oder anderen Farbstoffen) eingesetzt camit ihr Eindringen in die Zellen wachsen auf dem leitfähigen Teil des Schlittens, während die Farbstoffwanderung zu den benachbarten, nicht-elektroporierten Zellen wurde mikroskopisch durch Fluoreszenz-Beleuchtung beobachtet. Um störende empfindlichen Zellen, die dazu neigen, von der Monoschicht trennen zu vermeiden, um eine Anordnung entworfen, die nicht eine Elektrode erforderlich war oben auf die Zellen, um den elektrischen Strom 19 gelten platziert werden. Dieser Ansatz bietet die Möglichkeit, GJIC in einer großen Anzahl von Zellen zu quantifizieren, ohne nachweisbare Störungen der Zellstoffwechsel, da durch das Fehlen einer Wirkung auf die Länge der G1-Phase nach der Serumstimulation 12 angedeutet, Erhöhung des Niveaus der fos Protoonkogen Protein (Raptis, unveröffentlicht) oder zwei Kinasen mit zellulären Stress, der p38-Schwein oder JNK / SAPK-Kinase-1 verbunden. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung des Zusammenhangs zwischen den Ebenen der Onkogenexpression, Transformation und GJIC 18, sowie die Wirkung von Src und STAT3 auf GJIC in einer Vielzahl von Zelltypen, einschließlich Zellen aus Lungentumorproben 20-23 frisch kultiviert. Zusätzlich wird in situ Elektroporation mit dem beschriebenen Aufbau, der eine obere Elektrode wurde erfolgreich für den Nachweis der Gap-junction-Verschluss auf Adipozyten Differentiation eingesetzt fehlt, wobei die Zellanhaftung an das Substrat ist in diesem Stadium 19,24 verringert.

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Protokoll

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1. Ausplattieren der Zellen in der Elektroporation Chambers

  1. In einer Laminar-Flow-Haube, trypsinieren die Zellen unter Verwendung von sterilen Technik wie gewohnt.
    HINWEIS: Es ist sehr wichtig, um durch Zentrifugation beseitigt alle Spuren von Trypsin, weil sie verhindern Ausbreitung der Zellen auf dem Glas, damit die Bildung von adherens und Gap Junctions.
  2. Pipette 1 ml der Zellsuspension in sterilen Kammern Elektroporation mit dem in-situ-Elektroporator (Figur 1), und in ein 37 ° C, CO 2-Inkubator gestellt.
    HINWEIS: Die Zelladhäsion durch Plattieren auf Fibronektin, Kollagen, Poly-Lysin oder Zell-und Gewebekleber (siehe Materialien Table) verbessert werden.
  3. Wenn die Zellen eine konfluente Schicht gebildet sie sind bereit für GJIC Prüfung.

2. Verfahren der Elektroporation

Elektroporation für GJIC Prüfung kann außerhalb einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden,da es dauert nur ein paar Minuten. Wenn längere Inkubationszeiten für ein bestimmtes Experiment erforderlich ist, dann kann es vollständig in einem Abzug mit laminarer Strömung durchgeführt werden. In allen Fällen müssen die Kammern, in denen die Zellen gezüchtet steril sein.

  1. Bereiten Sie eine 5 mg / ml Lucifer gelb Lösung: 10 mg LY-Pulver (mit dem Elektroporator vorgesehen) in 2 ml calciumfreien Wachstumsmedium. Für Experimente, die längere Inkubationszeiten erfordert, Filter-Lösung sterilisieren und bei 4 o C
  2. Saugen Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen mit Calcium-freiem Medium, man aufpassen, nicht auf die Monoschicht zerkratzen oder trocknen die Zellen. Wenn die Zellen getrocknet haben sie meist dunkler Kerne und abholen LY ohne Elektroporation. Die Wirkung ist stärker ausgeprägt in der Mitte des Schiebers das mehr Luftzug (4F) ausgesetzt ist.
  3. Mit einer Eppendorf-Pipette pipettiert die Farbstofflösung auf die Zellen (400 ul für die ganze Kammer), am Rand der Kammer, being darauf, nicht die Zellschicht zu berühren.
  4. Legen Sie die Kammer, in der mit dem mitgelieferten Halter Elektroporator und wenden Sie einen Impuls von der entsprechenden Stärke (siehe Diskussion).
  5. Sorgfältig absaugen einige der LY-Lösung. Es kann ein zweites Mal für weniger wichtige Experimente verwendet werden.
  6. Zusatz von Calcium-freiem DMEM mit 10% dialysierten Serum.
  7. Die Zellen für 3-5 min im Brutschrank inkubieren, um die Farbstoffübertragung durch Gap Junctions ermöglichen.
    HINWEIS: Die Einbeziehung der dialysierten Serum an dieser Stelle hilft Porenverschluss.
  8. Mit Calcium-freiem DMEM für Live Cell Beobachtung waschen Sie die nicht rechtsfähige Farbstoff. Alternativ können die Zellen in diesem Stadium durch Zugabe von 4% Formaldehyd zu der gut fixiert werden kann, und dann mit PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung) gewaschen. In allen Fällen muss die Wasch alle Hintergrund zu entfernen.
    HINWEIS: In Vorversuchen die optimalen Bedingungen zu bestimmen, wenn die Spannung zu niedrig ist, dann ist es möglich, die Zellen zu gewinnen in der incubato zu lassenr für ein paar Minuten und elektroporieren derselben Folie ein zweites Mal, um in den Kosten der Folien zu speichern.

3. Die mikroskopische Untersuchung

  1. Beachten Sie die Zellen unter Fluoreszenzbeleuchtung mit einem inversen Mikroskop mit dem geeigneten Filter für die verwendeten Farbstoffs ausgestattet. Lucifer gelb, Anregung 423nm, 555nm Emissions, WBV Filter für eine Nikon IX70 Mikroskop.
  2. Beseitigen Meniskus Effekte, indem Sie ein Glas Deckglas auf der Oberseite des Kunststoff Nun, nach an die Spitze mit Flüssigkeit zu füllen, um die Zellmorphologie unter dem Phasenkontrast zu untersuchen. Für bessere Bilder kann das auch von der Folie abgenommen werden, und das Deckglas auf dem Rahmen angeordnet. Für feste Zellen, die gut mit Glycerin zur mikroskopischen Beobachtung gefüllt werden, während für lebende Zellen ist es mit Wachstumsmedium gefüllt werden.
    HINWEIS: Waschen und Fotografieren ist einfacher, wenn die Zellen mit Formaldehyd nach der Übertragung des Farbstoffes (Schritt 2.7 oben) festgelegt. Wenn die Zellen nichtt festgelegt ist, die Fluoreszenz von den Zellen innerhalb von etwa 60 min, je nach Zelltyp, die Spannung und den LY eingeführt, während in fixierten Zellen Fluoreszenz wird für mehrere Stunden beibehalten eliminiert. Allerdings verblasst oder Fluoreszenz verliert sich nach O / N Inkubation, auch in fixierten Zellen. Aus diesem Grund muss Fotografien bald nach der Elektroporation (Figur 2) entnommen werden.

4. Quantifizierung der interzellulären Kommunikation

  1. Fotografieren Sie die Zellen mit einem 20x-Objektiv unter Fluoreszenz-und Phasenkontrast (Abbildung 3).
  2. Identifizieren und markieren mit einem Sternchen die elektroporiert Zellen an der Grenze zu den nicht-elektroporiert Bereich (Abbildung 2, Pfeil, Elektroporation Flanke).
  3. Identifizieren und Markieren mit einem Punkt auf der fluoreszierenden Zellen nicht elektroporiert Seite, wo der Farbstoff durch Gap Junctions übertragen (3A und 3B).
  4. Teilen Sie die Gesamtzahl derfluoreszierenden Zellen auf der nicht elektroporiert Bereich durch die Anzahl der elektroporierten Zellen entlang der Kante (3A und 3B).
    HINWEIS: Der Transfer von mindestens 200 zusammenhängenden elektroporiert Grenzzellen für jedes Experiment berechnet. Die erhaltene Zahl ist der Wert GJIC.

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Ergebnisse

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Abbildung 2 zeigt Rattenleberzellen epithelialen T51B 22, mit LY elektroporiert und unter Fluoreszenz (Panel A und B) fotografiert oder Phasenkontrast-(C) Beleuchtung, nach Fixierung und Waschen. In Abbildung A ist die Kante des elektroporiert Bereich rot markiert. Die Steigung der Fluoreszenz rechts von der roten Linie zeigt Übertragung über Gap Junctions. In 3A und 3B ist die Quantifizierung von Gap Junction-Kommunikation gezeigt: Die Zellen auf den Rand de...

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Diskussion

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Kritische Schritte in dem Protokoll

Elektroporiert Material
Die Reinheit des Materials, elektroporiert werden, ist sehr wichtig. Wenn die Zellen sehr flach sind, müssen dann höhere Konzentrationen des Tracking-Farbstoff verwendet werden (bis zu 20 mg / ml für LY) und in solchen Fällen ist die Reinheit noch wichtiger als in Zellen, die mit einer kugelförmigen Form 1. Neben LY eine große Vielzahl von anderen Farbstoffen oder nonpermeant Moleküle eingesetzt wurd...

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Offenlegungen

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Der korrespondierende Autor ist der Erfinder eines Patents der Queen's University, das an Cell Projects Inc. lizenziert wurde. Das Unternehmen oder die Universität hatten keinen Einfluss auf den Inhalt der Arbeit.

Danksagungen

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Wir danken Lowell Cochran für die fachkundige Unterstützung bei der Videografie. Die finanzielle Unterstützung durch die Canadian Institutes of Health Research (CIHR), die Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), den Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), die Canadian Breast Cancer Research Alliance, die Ontario Centers of Excellence, die Breast Cancer Action Kingston und den Clare Nelson Belegacy Fund durch Zuschüsse an LR wird dankbar gewürdigt. SG erhielt ein NSERC-Stipendium. MG wurde durch ein Postdoktorandenstipendium des US Army Breast Cancer Program, des Ministeriums für Forschung und Innovation der Provinz Ontario und des Advisory Research Committee der Queen's University unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEMCellgro http://www.cellgro.com/50-013-PB
DMEM ohneCalcium-Hyklon (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com)SH30319-01
Spender-Kälberserum PAA: http://www.paa.com/Kat.# B15-008
Fötales RinderserumPAA: http://www.paa.com/Kat.# A15-751
ElektroporationsapparatCell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ACE-100
ChambersCell Projects Ltd UKACE-04-CC4-Wells
ChambersCell Projects Ltd UKACE-08-CC8-Wells
Lucifer Yellow CellProjects Ltd UKACE-25-LYHochreines
CelTakBD Biosciences354240Zell- und Gewebeklebstoff
FibronektinSigma AldrichF1141
KollagenBD Biosciences354236
Poly-LysinSigma AldrichP8920

Referenzen

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Gap Junction KommunikationLucifer Yellow TransferFluoreszenzmikroskopieZellmembranporenSignalinhibierungPeptideinf hrungquantitative Analyse

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