Dieses Video Artikel beschreibt ein in vitro-Mikroarray-basierte Methode, um die Gen-Targets und Bindungsstellen für Zweikomponentensystem Antwortregulatoren bestimmen.
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Methodenartikel
DNA-Affinitäts-gereinigten Chip (DAP-Chip)-Methode, um Gene für bakterielle Ziele fest, Zwei-Komponenten-Systeme Regulatory
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In-vivo-Methoden wie Chip-Chip sind etablierte Techniken zur globalen Zielgene für Transkriptionsfaktoren zu bestimmen. Von begrenztem Nutzen sind sie jedoch in der Erforschung bakteriellen Zwei-Komponenten-Regulationssysteme mit charakterisierter Aktivierungsbedingungen. Solche Systeme regulieren die Transkription nur, wenn in Gegenwart von eindeutigen Signalen aktiviert. Da diese Signale oft unbekannt sind, können in diesem Video-Artikel beschriebene in vitro-Mikroarray-basierten Verfahren verwendet werden, um Gen-Targets und Bindungsstellen für Antwortregulatoren zu bestimmen. Diese DNA-Affinitäts-gereinigten-Chip-Verfahren kann für jede gereinigte Regler in jedem Organismus mit einem sequenzierten Genom verwendet werden. Das Protokoll beinhaltet wodurch die gereinigte markierte Protein zu scher genomische DNA binden und Affinitätsreinigung des proteingebundenen DNA, gefolgt von der fluoreszierenden Markierung der DNA und Hybridisierung an eine individuelle Unterteilung Array. Vorhergehenden Schritte, die verwendet werden, um den Test zu optimieren Spezifikationen werden könnenc Regler werden ebenfalls beschrieben. Die von der Array-Daten-Analyse erzeugten Peaks werden verwendet, um Bindungsstelle Motive, die dann experimentell validiert werden vorherzusagen. Die Vorhersagen Motiv kann weiter verwendet werden, um Gen-Targets orthologer Antwortregulatoren in nahe verwandten Arten zu bestimmen. Wir zeigen die Anwendbarkeit dieser Methode durch Bestimmung der Gen-Targets und-Bindungsstelle Motive und damit die Vorhersage der Funktion für ein sigma54 abhängige Antwortregulator DVU3023 in der Umwelt Bakterium Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.
Einleitung
Die Fähigkeit der Bakterien zu überleben und zu gedeihen ist kritisch davon abhängig, wie gut sie in der Lage zu erkennen und zu reagieren, um Störungen in ihrer Umgebung sind, und diese wiederum ist abhängig von der Signalübertragungssysteme. Die Anzahl der Signalanlagen ein Bakterium kodiert wurde seine "mikrobielle IQ" bezeichnet und kann ein Hinweis sowohl Variabilität der seine Umwelt und seine Fähigkeit, mehrere Signale zu erfassen und eine Feinabstimmung seiner Antwort 1 sein. Zwei-Komponenten-Signalübertragungssystemen (ASR) sind die am weitesten verbreiteten Signalsysteme von Bakterien verwendet werden, und sie bestehen aus einem Histidin-Kinase (....
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Protokoll
Hinweis: Die unten Protokoll wird für die Bestimmung von Gen-Ziele der RR DVU3023 aus dem Bakterium Desulfovibrio vulgaris Hildenborough zugeschnitten. Es können zu jedem anderen Transkriptionsregulator von Interesse angepasst werden.
1. Clone und Entschlacken RR
- Klonen Sie die RR-Gen, insbesondere DVU3023, aus D. vulgaris Hilden in einem Escherichia coli-Expressionsvektor, so dass das Gen C-terminal His-markiert und Expression unter der Kontrolle eines T7-Promotors.
Hinweis: Mehrere Klonierungsverfahren kann verwendet werden und wird durch den Forscher bestimmt. Alternative Affinitäts-Tags kön....
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Ergebnisse
Das oben genannte Verfahren wurde angewendet, um die globalen Gen-Targets der RRS in der Modellsulfatreduzierenden Bakteriums Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 zu bestimmen. Dieser Organismus besitzt eine große Anzahl von FKS über 70 RRs dargestellt, was auf die Vielzahl von möglichen Signalen, die es erfaßt und darauf reagiert. In-vivo-Analysen der Funktionen dieser Signalanlagen schwer, da ihre Signale führen und somit ihre Aktivierungsbedingungen sind unbekannt. Hier wurde die DAP-Ch.......
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Diskussion
Die hier beschriebene DAP-Chip-Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um die Gen-Targets für mehrere RRS in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7, von denen eine hier als repräsentatives Ergebnis gezeigt zu bestimmen. Für RR DVU3023, die Wahl eines Kandidaten-Gen Ziel war einfach. DVU3025 ist unmittelbar stromabwärts von der RR-Gen und die RR-und Zielgene werden in mehreren Desulfovibrio-Arten konserviert sind, und zusätzlich eine vorhergesagte DVU3025 sigma54-abhängigen Promotor. Die EMSA b.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offen zu legen.
Danksagungen
Wir danken Amy Chen für ihre Hilfe bei der Vorbereitung der Videodreh und zur Demonstration der Technik. Diese Arbeit von ENIGMA durchgeführt: Ökosysteme und Netzwerke integriert mit Gene und molekulare Baugruppen (http://enigma.lbl.gov), ein Scientific Focus Area Programm am Lawrence Berkeley National Laboratory, wurde durch das Amt für Wissenschaft, Amt für Biologische und unterstützt Umweltforschung, des US Department of Energy unter Vertrag Nr. DE-AC02-05CH11231.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| HisTrapFF-Säule (Ni-Sepharose-Säule) | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | 17-5255-01 | |
| Akta-Explorer (FPLC-Instrument) | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | ||
| HiPrep 26/10 Entsalzungssäule | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | 17-5087-01 | |
| Qiaquick Gel-Extraktionskit | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 28704 | |
| Biotin-markierte Oligonukleotide | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| 6% Polyacrylamid-0,5x TBE vorgefertigtes Mini-DNA-Retardierungsgel | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | EC63652BOX | Alternativ können Sie Ihr eigenes Gel einschenken. |
| Nylonmembran | EMD Millipore, Billerica, MA, USA | INYC00010 | |
| Trans-Blot SD Halbtrockene elektrophoretische Transferzelle | Biorad, Hercules, CA, USA | 170-3940 | |
| Extra dickes Fleckpapier, 8 x 13,5 cm | Biorad, Hercules, CA, USA | 170-3967 | |
| UV-Vernetzer Modell XL-1000 | Fisher Scientific | 11-992-89 | |
| Nukleinsäure-Chemilumineszenz-Nachweiskit (Pierce) | Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA | 89880 | |
| Ni-NTA-Agaroseharz | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 30210 | |
| GenomePlex Amplifikationskit für das gesamte Genom (Fragmentierungspuffer, Bibliotheksvorbereitungspuffer, Bibliotheksstabilisierungslösung, Bibliotheksvorbereitungsenzym, 10x Amplifikations-Mastermix, WGA-Polymerase) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | WGA2-50RXN | |
| Nanodrop ND-1000 | Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA | Für die Quantifizierung von DNA | |
| Perfecta Sybr Green SuperMix, mit ROX | Quanta biosciences | 95055-500 | Jeder Sybr Green PCR-Mix kann verwendet werden |
| PlateMax Ultra klare Heißsiegelfolie für qPCR | Axygen | ||
| [header] | |||
| 96-Well-Clear-Low-Profile-PCR-Mikroplatte | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | PCR-96-LP-AB-C | |
| Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | 4376600 | Jedes real time PCR-System kann verwendet werden |
| Qiaquick PCR-Aufreinigungskit Qiagen | Inc, Valencia, CA, USA | 28104 | Jedes PCR-Aufreinigungskit kann verwendet werden |
| Cy3/Cy5-markierte Nonamer | Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA | N46-0001, N46-0002 | |
| Klenow-Polymerase 50.000 U/ml, 3'-5' Exo- | New England Biolabs, Ipswich, MA | M0212M | |
| Hybridisierungssystem | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | Dieses Unternehmen stellt keine Arrays oder verwandten Artikel mehr her, daher müssen alternative Quellen wie Agilent oder Affymetrix verwendet werden. |
| Individuell bedruckte Microarrays und Mischer | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
| Hybridisierungskit (2x Hybridisierungspuffer, Hybridisierungskomponente A, Alignment-Oligo) | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
| Waschpuffer Kit (10x Waschpuffer I, II, III, 1 M DTT) | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
| GenePix 4200A Microarray-Scanner | Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA | Dieses Modell wurde durch überlegene Modelle | |
| GenePix Pro Microarray-Software | Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA | ||
| Nimblescan v.2.4, ChIP-Chip-Analysesoftware | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A |
Referenzen
- Galperin, M. Y. Diversity of structure and function of response regulator output domains. Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).
- Casino, P., Rubio, V., Marina, A. The mechanism of signal transduction by two-component systems. Curr Opin Struct Biol.
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Nachdrucke und Genehmigungen
