Array Comparative Genomic Hybridization (Array-CGH) zum Nachweis von Genomic Copy Number Varianten

Summary

Array-CGH für den Nachweis von genomischer Kopienzahl-Varianten hat G-gebändert Karyotypanalyse ersetzt. Dieses Papier beschreibt die Technologie und ihre Anwendung in einem Diagnose-Service-Labor.

Abstract

Array CGH zum Nachweis genomischer Kopienzahlvarianten hat die G-Banden-Karyotyp-Analyse ersetzt. In diesem Beitrag wird die Technologie und ihre Anwendung in einem klinisch-diagnostischen Dienstleistungslabor beschrieben. DNA, die aus einer Patientenprobe (Blut, Speichel oder andere Gewebetypen) extrahiert wird, wird mit einem Fluorochrom (entweder Cyanin 5 oder Cyanin 3) markiert. Eine DNA-Referenzprobe wird mit dem entgegengesetzten Fluorochrom markiert. Es folgt ein Reinigungsschritt, um nicht eingebaute Nukleotide zu entfernen, bevor die markierten DNAs gemischt und in einem Hybridisierungspuffer resuspendiert und auf ein Array aus ~60.000 Oligonukleotidsonden aus Loci im gesamten Genom aufgebracht werden, mit hoher Sondendichte in klinisch wichtigen Bereichen. Nach der Hybridisierung werden die Arrays gewaschen, dann gescannt und die resultierenden Bilder analysiert, um die rote und grüne Fluoreszenz für jede Sonde zu messen. Software wird verwendet, um die Qualität jeder Sondenmessung zu bewerten, das Verhältnis von roter zu grüner Fluoreszenz zu berechnen und potenzielle Kopienzahlvarianten zu erkennen.

Introduction

Es ist seit vielen Jahren, dass Deletionen oder zusätzliche Kopien von Chromosomensegmente verursachen geistiger Behinderung, Dysmorphien und congentical Fehlbildungen bekannt, und in einigen Fällen dazu führen, genetische Syndrome ^1. Doch die einzige Technologie zur Verfügung, bis Mitte der 2000er Jahre für die genomweite Erfassung dieser Veränderungen war, G-gebändert Chromosomenanalyse, die eine Auflösung von rund 5-10MB hat, je nach Region und Art des Ungleichgewichts und welche nicht abnorme Chromosomen, wo Material wurde von einer Region aus einem anderen Chromosom mit der gleichen Bandenmuster ersetzt. Neben zytogenetischen Techniken wie Fluoreszenz....

Protocol

1. Kennzeichnung Reaktion

1. Vor, Pre-Aliquot Cyanin 3 und 5-markierten dUTPs, unmarkierten Nukleotiden und Zufallsprimer an den Hersteller empfohlenen Konzentrationen verwenden in 96-Well-Platten und bei -20 C einsatzbereit. Für die Zwecke dieses Protokolls Aliquot von 10,5 & mgr; l des geeigneten markiertem dUTP und 10,5 ul unmarkierter Nukleotide und Zufallsprimer in jede Vertiefung.
2. Auftauen ready-to-use Platte mit 96 Vertiefungen von Nukleotiden und Primern bei 4 ° C für etwa 1 Stunde, vor Licht geschützt.
3. Nach dem Auftauen Gleichgewicht dieser Platte bei Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten, vor Licht geschützt.
4. Äquilib....

Results

Jede Sonde auf einem Array hybridisiert wird als eine Mischung aus roten und grünen Fluorochrome visualisiert (siehe Abbildung 1). Das Verhältnis von rot nach grün fluoreszierenden Signals für jede Sonde wird vom Scanner quantifiziert und die zugehörige Software zeichnet diese als log2 Verhältnisse entsprechend ihrer genomischen Position und identifiziert Bereiche, die außerhalb voreingestellten Grenzen. Die resultierende Array Spuren ermöglichen Interpretation der Regionen als genomisch unsymmetrische .......

Discussion

Array-CGH wird ausgewogenen Umlagerungen oder Ploidie Anomalien wie Triploidie nicht erkennen. Ferner können geringe mosaic Ungleichgewichte nicht erkannt werden. Hat Array-CGH jedoch eine höhere Auflösung für CNV Erkennung als G-gebändert Chromosomenanalyse, die es in vielen Labors Zytogenetik ersetzt hat. Es ist daher der derzeitige Goldstandard für die genomweite CNV-Erkennung. Sie kann von der nächsten Generation Sequenziertechnologien in der Zukunft ersetzt werden, aber derzeit, ihre Kosten und die technischen Schw.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGH Microarray 8 x 60K	Agilent	G4126
Array CGH Waschpuffer	Agilent	5188-5226
Array CGH Hybridisierungspuffer	Agilent	5188-5380
Minelute Aufreinigungskit	Qiagen	28006
Array CGH Beschriftungskit	Enzo	ENZ-42672-0000