Dieser Artikel wird auf die Entwicklung von Polymer-beschichteten Oberflächen für die langfristige Ausrichtung, stabile Kultur der Stammzell abgeleitet humanen Hepatozyten.
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Methodenartikel
Stabilisierung Leberzell Phänotyp mit optimierten Surfaces
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Derzeit besteht eine der größten Einschränkungen in der Zellbiologie darin, den differenzierten Zellphänotyp beizubehalten. Biologische Matrices werden häufig für die Kultivierung und Erhaltung von primären und pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Hepatozyten verwendet. Biologische Matrices sind zwar nützlich, ermöglichen aber eine kurzfristige Kultivierung von Hepatozyten, was ihre breite Anwendung einschränkt. Wir haben versucht, die Einschränkungen mit einer synthetischen Polymerbeschichtung zu überwinden. Polymere stellen eine der breitesten Klassen von Biomaterialien dar und besitzen ein breites Spektrum an mechanischen, physikalischen und chemischen Eigenschaften, die je nach Einsatzzweck fein abgestimmt werden können. Wichtig ist, dass solche Materialien auf qualitätsgesicherte Standards skaliert werden können und eine Konsistenz von Charge zu Charge aufweisen. Dies ist unerlässlich, wenn Zellen für das Screening mit hohem Durchsatz in der pharmazeutischen Testindustrie oder für die zellbasierte Therapie expandiert werden sollen. Polyurethane (PUs) sind eine Gruppe von Materialien, die sich in der Zellkultur als vielversprechend erwiesen haben. Unsere jüngsten Fortschritte bei der Optimierung einer Polyurethan-beschichteten Oberfläche für die Langzeitkultur menschlicher Hepatozyten mit stabilem Phänotyp werden vorgestellt und diskutiert.
Einleitung
Biologische Materialien sind weit verbreitet bei der Aufrechterhaltung und Differenzierung von pluripotenten Stammzellen 1 verwendet. Und ermöglichen, enthalten diese biologischen Substraten oft eine Vielzahl von unbestimmten Komponenten. Matrigel ist eine häufig verwendete Substrat für die Stammzellkultur und Differenzierung. Leider beeinflusst die variable Zusammensetzung der Zellfunktion und Phänotyp. Obwohl eine Vielzahl von alternativen, definierten biologischen Matrices wurden verwendet, 2-7, ihre tierischen Ursprungs oder schlechte Skalierbarkeit macht sie ungeeignete Kandidaten für die industrielle Fertigung. Daher ist die Identifizierun....
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Protokoll
1. Synthese von PHNGAD (Poly [1,6-hexanodiol / Neopentylglykol / Di (ethylenglykol)--alt Adipinsäure] diol)
Schema 1: Synthese von PHNAGD Schematische Darstellung der Synthese von PHNAGD.. PHNAGD wurde durch Umsetzung von 1,6-Hexanodiol, Diethylenglykol, neoppentyl Glykol und Adipinsäure hergestellt. PHNAGD, Poly [1,6-hexanodiol / Neopentylglykol / Di (ethylenglykol)--alt Adipinsäure] diol.
- Anwenden der Wärmebehandlung auf die Monomeren, 1,6-Hexandiol, Di (ethylenglykol) ....
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Ergebnisse
Polymerlösungsmittel beeinflusst die Topographie des mit Polymer beschichteten Oberfläche
Polyurethan-134 wurde in Chloroform gelöst, entweder allein oder in Kombination mit Toluol oder Tetrahydrofuran oder Dichlormethan, und die Objektträger aus Glas mit den verschiedenen Formulierungen schleudert. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Rasterkraftmikroskopie (AFM) wurden zur Charakterisierung der physikalischen Eigenschaften der Polymerschichten (Abbildung 1).
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Diskussion
Viele der verwendeten Hepatozyten aus Stammzellen erzeugen aktuellen Methoden beruhen auf undefinierte Matrizen tierischen Ursprungs. Diese Substrate können kostspielig und sehr variabel sein und somit die Zellfunktion und der Stabilität, die ein großes Hindernis für Anwendung. Daher führten wir einen Bildschirm für synthetische Materialien, die die Kultur der Stammzell abgeleitet Hepatozyten zu unterstützen. Wir haben festgestellt, eine einfache Polyurethan (PU134) durch Polymerisation PHNGAD, MDI und ein Streckmittel,.......
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Offenlegungen
DCH ist CSO, Regisseur, Gründer und Gesellschafter der FibromEd Products Ltd MB und JPI sind Gründungsaktionäre in FibromEd Products Ltd
Danksagungen
DCH, MB und FK wurden von einem EPSRC Folgen auf Fonds unterstützt. BL-V und DS wurden jeweils durch MRC PhD student unterstützt. KC wurde durch Mittel aus dem UK Regenerative Medizin-Plattform unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Synthese, Aufbereitung, Beschichtung und Charakterisierung von polymerbeschichteten PU134-beschichteten Deckgläsern | |||
| Shaker | Edmun Bü hler | KS-15 | |
| Bestrahlungsgerät | CIS Biointernational | IBL 637 | |
| Spin Coater | Specialty Coating System | P-6708 | |
| Rasterelektronenmikroskop | Philips | XL30CPSEM | |
| Rasterkraftmikroskop | DimensionV Nanoskop, VEECO | ||
| p4-GLO CYP3A4 | Promega | V8902 | |
| UV-Lampe | ESCO | ||
| NanoScope Analysesoftware | VEECO | Version 1.20 | |
| Fluoreszenzmikroskop | Olympus | TH45200 | Volocity 4 Software verwenden |
| Gewebekulturplatten | Corning, Großbritannien | 3527 | |
| Objektträger | Wissenschaftlicher Laborbedarf | MIC3308 | |
| Diethylenglykol | Sigma– Aldrich | 93171 | |
| 1,6-Hexandiol | Sigma– Aldrich | 240117 | |
| Neopentylglykol | Sigma– Aldrich | 408255 | |
| Adipinsäure | Sigma– Aldrich | 9582 | |
| wasserfreies N,N-Dimethylformamid | Sigma– Aldrich | 227056 | |
| Diethylether | Sigma– Aldrich | 676845 | |
| Titan (IV)-butoxid | Sigma– Aldrich | 244112 | |
| 1,4-Butandiol | Sigma– Aldrich | 493732 | |
| Vakuumschrank | Thermoscientific | ||
| 4,4'-Methylenbis(phenylisocyanat) | Sigma– Aldrich | 101688 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma– Aldrich | 401757 | |
| Sputter-Coater | Bal-Tec SCD 050 | ||
| Inmunostaining | |||
| Phosphate buffer salz (-MgCl2, -CaCl2) | Gibco | 10010031 | Bei Raumtemperatur lagern |
| PBST, PBS bestehend aus 0,1% TWEEN 20 | Wissenschaftlicher Laborbedarf Ltd | EC607 | |
| Methanol | Scientific Laboratory Supplies Ltd | CHE5010 | |
| Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich, Großbritannien | A7906 | |
| MOWIOL 488 DAPI | Calbiochem | 475904 | Hergestellt aus Tris HCl und Glycerin gemäß den Anweisungen |
| Zellkultur und funktioneller Assay | |||
| CYP3A-Aktivität pGLO-Kit | Promega | V8902 | |
| Hepatozym | Gibco | 17705021 | |
| TryLE express | Life Technologies | 12604013 | |
Referenzen
- Zhou, W., et al. SUMOylation of HNF4α regulates protein stability and hepatocyte function. J Cell Sci. 125 (15), 3630-3635 (2012).
- Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and diffe....
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Nachdrucke und Genehmigungen
