Eine einfache Verhaltenstest zur Prüfung von Visual Function in<em&gt; Xenopus laevis</em

Zusammenfassung

Xenopus laevis Kaulquappen schwimmen lieber auf der weißen Seite einer schwarz / weißen Tank. Dieses Verhalten wird von ihrer Vision geleitet. Basierend auf diesem Verhalten stellen wir eine einfache Test, um die visuelle Funktion der Kaulquappen zu testen.

Zusammenfassung

Die Messung der visuellen Funktion in den Kaulquappen der Frösche, Xenopus laevis, ermöglicht Screening für Blindheit in lebenden Tieren. Der optokinetische Reaktion ist eine Vision-basierte, reflexive Verhalten, das in allen getesteten Wirbeltieren beobachtet worden ist. Tadpole Augen sind klein, so wurde der Schwanz Flip Antwort als alternative Maßnahme, die einen geschulten Techniker, um die subtile Antwort aufzeichnen erfordert verwendet. Wir haben eine alternative Verhalten Assay basiert auf der Tatsache, dass Kaulquappen lieber auf der weißen Seite eines Tanks schwimmen, wenn sie in einem Behälter mit sowohl Schwarz-Weiß-Seiten angeordnet. Die hier vorgestellte Test ist eine kostengünstige, einfache Alternative, die eine Antwort, die leicht gemessen wird erstellt. Der Aufbau besteht aus einem Stativ, Webcam und verschachtelte Prüfung Tanks, in den meisten Labors Xenopus leicht verfügbar. Dieser Artikel enthält einen Film, die das Verhalten von Kaulquappen, vor und nach dem Durchtrennen des Sehnervs. Um die Funktion von einem Auge zu testen, sind wir auch Vertretreter Ergebnisse einer Kaulquappe, in dem jedes Auge unterzog Netzhaut Axotomie an aufeinander folgenden Tagen. Zukünftige Studien könnten eine automatisierte Version dieses Tests für die Prüfung der Vision von vielen Kaulquappen auf einmal zu entwickeln.

Einleitung

Xenopus laevis wurden als Modellorganismus zur Augenbildung studieren verwendet. Die Augen entwickeln schnell wachsenden Zeit in weniger als einer Woche zum Testen Gene oder Wege, die einen Einfluss auf die visuelle Entwicklung und Funktion haben. Um visuelle Funktion zu testen, hat die optokinetischen und optomotorischen Reaktion im Zebrafisch und Xenopus Kaulquappen verwendet wurde, bzw. ^1,2. Da die Augen von Xenopus Kaulquappen sind relativ kleiner als Zebrafisch, dieser Test erfordert den Einsatz von Spezialgeräten und geschultes Personal, um die subtilen tail-Flip und Blickbewegungsverhalten in Xenopus zu erkennen. Ein robusteres Verhalten in Xenopus ist die Vorliebe für das Schwimmen in einem Tank mit einem weißen Hintergrund, die hier ³ beschrieben wird. Beim Platzieren einer Kaulquappe in einem halb schwarz / halb-weißen Tank, die Pre-metamorphen Kaulquappe schnell schwimmt auf der weißen Seite des Tanks. Bislang hatten wir diesen Test, um festzustellen, ob pluripotenten Zellen abgeleitetenAugen waren funktionellen ^4. Hier berichten wir über eine detaillierte Version dieses Assays, die verwendet werden können, um die visuelle Funktion premetamorphic Xenopus-Kaulquappen testen.

Dieser Test ist einfacher als der optomotorischen Reaktion Assay, da bedarf es nur einen montierten digitalen Camcorder, Digitalkamera-Software und Standard-Ausrüstung in den meisten Labors Xenopus gefunden. Darüber hinaus ist die aufgezeichnete Reaktion erfordert keine spezielle Ausbildung, um tally Ergebnisse. Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die gleiche Gruppe von Kaulquappen, mit Doppelnetzhaut Axotomie unterzogen, schwimmen zufällig um den Tank. Wir haben auch die Verhaltens Assay-Ergebnisse aus einer repräsentativen Kaulquappe, die zeigt, wie ein Auge für die visuelle Reaktion getestet werden. Ein Arbeitsblatt aufgenommen wurde, so daß während des Tests erworben Zahlen eingesetzt und ausgewertet werden. Dieses Arbeitsblatt kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob die getesteten Kaulquappen eine visuelle Antwort sein.

Protokoll

Tierpflege

Die Xenopus laevis Kaulquappen in dieser Studie verwendet wurden nach Verfahren, die von Upstate Medical University IACUC und dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt angebaut, aufgezogen und behandelt.

. Ein Pre-Verhalten Setup: Kaulquappen

1. Erhalten befruchteten Xenopus-Embryonen aus einer handelsüblichen Quelle oder in vitro zu befruchten Oozyten, wie oben beschrieben ^6.
2. Zeigen Blastula zu Neuralplatte Embryonen bei 18 ˚ C in 60 mm Petrischalen mit 0,1 X MMR [10 X Marc Geändert Ringer-(MMR)-Lösung Lager (10 mM MgCl _2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl _2, 50 mM HEPES; 1 M NaCl, eingestellt auf pH 7,5, autoklaviert und bei RT gelagert)] mit 50 ug / ml Gentamicin-Antibiotikum. Ändern 0,1 X MMR jeden Tag und entfernen Sie alle toten Embryonen.
3. Sobald die Embryonen erreichen Nieuwkoop und Faber Bühne ~ von 27. bis ^30. Juli, schalten thE Embryonen in 0,1 × MMR ohne Antibiotikum Darm Bakterienwachstum zu ermöglichen.
4. Wachsen die Kaulquappen, bis sie die Fütterungsstufe (Stufe 45) zu erreichen und sie in 100 mm Petrischalen mit 0,1 X MMR gefüllt. Füttere sie Brennnesselpulver Stand jeden zweiten Tag für eine Woche, die Änderung der MMR 0,1 X auf dem dazwischen Tag.
5. Nach einer Woche in der 100-mm-Petrischale, verschieben Tiere halben Liter Tanks mit Wasser gefüllt Frosch [0,5 g / L Instant Meer und 2 mM Dinatriumhydrogenphosphat (Na ₂ HPO _4: mw 141,96) pH 6,8]. Füttere sie, wie in Schritt 2.4, aber ändern Sie Wasser nur 2-3 mal pro Woche, wenn das Wasser trüb ist. Pflegen Sie die Tiere in einer 12-Stunden-Licht/12 dunklen Lichtzyklus mit die Lichter einschalten um 6 Uhr.
6. Legen Sie die Hälfte-Liter-Tank mit den Testpersonen auf einer weißen Fläche wie ein Labortisch Unterlage, mindestens 12 Stunden O / N, vor der Prüfung.
7. Test Kaulquappen in Stufen 45 bis 50, wie in Schritt 3 unten beschrieben.

. 2 Pre-Verhalten Setup: Equipment

1. Beiseite stellen einen Bereich der Labor-Test für das Verhalten. Es sollte in einer ruhigen, verkehrsarmen Bereich mit Standard-Leuchtstofflampen sein.
2. Vorbereitung der Testbehälter für die Tiere.
   Die verschachtelte, halb-Liter Testbehälter sind aus zwei Teilen: einem Innenbehälter, die das Wasser und Kaulquappen halten wird; und einen äußeren Tank mit dem visuellen Stimulus.
   1. Für den Innentank, machen Sie eine kleine Markierung auf den Außenecken mit einem Sharpie, 5 cm aus dem Boden; dies ist die Wasserleitung (1A, grün gestrichelte Linie).
   2. Auch für den inneren Tank, füllen die divets im Behälter (in den Ecken und der Mitte) mit einer inerten Verbindung, wie Sylgard Elastomer. HINWEIS: Die Kaulquappen werden in diesen Bereichen aufhalten, wenn sie nicht ausgefüllt
   3. Für den äußeren Behälter, Deckel genau eine Hälfte der Außenseite eines Tanks mit schwarzem Isolierband und die andere Hälfte mit dem weißen Papier 1B.
3. Legen Sie die Tanks auf dieImpfen Drehscheibe.
4. Setup die Webcam / Stativ, so dass es über den Testtanks. Einstellen der Kamera auf die Visualisierung der Testfläche zu ermöglichen, wie in Fig. 1C gezeigt.
5. Schließen Sie die Webcam an einen Computer mit Quicktime Player Software installiert ^5. Schalten Sie die Kamera ein. Im Quicktime Player unter Datei, wählen Sie "Neue Video-Aufnahme." Das Verhalten Test-Setup wird sofort auf dem Computer sichtbar sein.
6. Drape ein leichtes Baumwolltuch über die gesamte Setup auf externe Signale, die Kaulquappe Verhalten beeinflussen könnten zu reduzieren, als auch auf der Oberfläche des Wassers zu reduzieren reflektierte Licht.
7. Sicherzustellen, dass die Leuchtdichte unter dem Tuch Maßnahmen zwischen 35-50 cd / m ^2.

3. Verhalten Assay

1. Füllen Sie den Innentank zur Prüfung 5 cm Wassermarke in Schritt 1.2.1 mit Frosch Wasser.
2. Mit einem kleinen Netz, sanft bewegen, das Tier in die innere Prüfung Tank.
3. Offene QuickTime Software auf dem Computer und mit dem Außentank als Leitfaden, stellen Sie sicher, dass die Kamera in der Lage ist, zu visualisieren und notieren Sie den Testbereich.
4. Schreiben Sie die Tiernamen, Datum und Zeit auf ein Stück Papier und notieren mit der Kamera.
5. Die Testbehälter in den Außenbehälter mit der schwarzen Seite des Behälters nach rechts 2.
6. Starten Sie die Filmaufnahme unmittelbar nach der Anordnung der Tank und setzen Timer für 2 min.
7. Nach dem Signal, entfernen Sie die inneren Testtank, drehen Sie den Außentank 180 ° und legen Sie den inneren Testtank im Inneren des Außentanks. Starten Sie den Timer. Hinweis: die schwarze Seite sollte nun auf der anderen Seite sein.
8. Wiederholen Sie Schritt 3.7, acht weitere Male für insgesamt zehn Studien. Verwenden Sie Abbildung 2 als ein Führer, Abhaken jede Studie.
9. Wiederholen Sie den Test Verhalten an zwei verschiedenen Tagen.

4. Retinal Axotomie

1. Tier in den 0,02% Tricaine bis sie nicht mehr reagiert werdenzu einem Schwanz mit einer Prise Nr. 3 Pinzette.
2. Schmelze 1% Agarose in 0,1 × MMR und dann zu einer 60 mm Petrischale hinzuzufügen. Nach dem Abkühlen einen kleinen rechteckigen Divot in der Agarose und fügen die Kaulquappe zum Divot mit wenig Tricaine 0,02%, so dass das Tier ist teilweise in die Flüssigkeit eingetaucht.
3. Die Schale in einem 45 Grad-Winkel hinter dem dorsalen Bereich des Auges mit einer 25 G Nadel, während die Abstützung des Tieres gegen Zange an der gegenüberliegenden Seite.
4. Kümmert sich nicht um die Ader, die neben dem Sehnerv liegt schnippeln, zu erreichen sorgfältig in das Loch mit der Pinzette Nr. 5, schnipp den Sehnerv und drehen Sie sie aus dem Weg. Wenn es schwere Blutungen aufgrund versehentlich Kappen der Arterie, dann schnell zu platzieren, das Tier in 2% Tricaine zu einschläfern. ACHTUNG: 2% Tricaine Lösung kann Taubheitsgefühl in den Menschen verursachen. Diese Lösung sollte mit Handschuhen angefasst werden.
5. Um das Tier zu bergen nach der Operation, legen Tier in 100 mm Petrischale mit 0,7 X MMR und 50 ug / ml Gentamicin für 20 min. Next, Transfer Kaulquappe zum Frosch Rückgewinnungstank mit Wasser. Lassen Tier Rest O / N.
6. Am nächsten Morgen, testen Sie die visuelle Funktion wie oben beschrieben (Schritte von 3,1 bis 3,9).

5. Analysieren Ergebnisse

1. Nachdem die Studien abgeschlossen haben, messen Sie die Zeit, die der Kaulquappe bleibt auf der schwarzen Seite des Tanks.
   1. Manuell die Videos mit einer Software, die die Zeit anzeigt und ermöglicht häufigen Pausen. Schauen Sie sich die Video-Anzeigezeit. Notieren den Beginn der zwei-Minuten-Studie, die ist, wenn der Innentank erfolgreich verschachtelt innerhalb des Außenbehälters und wird im Hinblick auf die Kamera quadriert.
   2. Verwenden Sie die Position der Augen des Kaulquappe ist zu definieren, welche Seite des Tanks werden die Tiere schwimmen auf. Definieren Sie über Kreuzung von einer Seite des Tanks auf die andere nur dann, wenn beide Augen haben die schwarz / weiße Linie gekreuzt.
2. Notieren Sie sich den Anfang und das Ende jedes Intervalls (in sec), dass das Tier auf der schwarzen Seite verbringt. Pause und Wiederwickeln Sie das Video, um die Genauigkeit zu gewährleisten. Insgesamt sec die in jeder Studie.
3. Eingangs diese Zahlen in der beigefügten Verhalten Arbeitsblatt. Das Arbeitsblatt wird das Verhältnis der Zeit, dass das Tier auf der weißen Seite verbracht, indem die Zeit auf der schwarzen Seite des Tanks von der Gesamt 120 sec Versuch und Division durch die Gesamtzeit in Sekunden ausgegeben berechnen [(120 - Gesamtaufwand für Sekunden die schwarze Seite) / 120 sec]. Die Arbeitsblattdurchschnittswerte dieses Verhältnis über alle 10 Studien.
4. Verwenden Sie ein Student-T-Test, gepaart, two-tailed Verteilung zu bestimmen, ob die Prozesse zwischen den Tagen sind signifikant (P ≤ 0,05).

Ergebnisse

Frühere Berichte haben gezeigt, dass Xenopus Kaulquappen premetamorphic lieber auf der weißen Seite einer schwarz / weißen Tank schwimmen und nannte diesen Test, der Hintergrundfarbe Vorlieben Assay ³ Wir haben diesen Test, um die visuelle Funktion eines Augen von Kaulquappen in testen geändert weniger als eine Woche. Auf diese Weise kann die Augen für die histologische Untersuchung gesammelt werden.

Wir zeigen hier, wie die Reaktion durch visuelle Hinweise ist. In

Diskussion

Wir berichten hier über eine einfache Vision geführte Verhaltenstest, die leicht in weniger als einer Woche durch minimal geschulte Laborpersonal durchgeführt werden können. Während andere Tests erfordern spezielle Ausrüstung und Know-how in das Verhalten der Tiere, ermöglicht dieser Test ein Schnelltest der visuellen Funktion zu bestimmen. Ein anderer Verhaltenstest, der Visual Avoidance Assay wurde entwickelt, um zu bestimmen, wie Tectum trägt zur visuellen Wahrnehmung in Xenopus ^10. Dieser Assay m...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1/2 Gallone Flex-Tank mit Abdeckung	eNasco	SB19271M	Größe: 5-3/8" x 7" x 3-3/4"
Schwarzes Isolierband
Weißes Seidenpapier
Großer Impfplattenteller	VWR	50809-022	Größe: Durchmesser 114,3 x & nbsp; H 76,2 mm (4 1/2  x  3")
Durasorb Unterlage	VWR	82004-836	Größe: 43,2 x 60,1 cm (17 x 24")
Kimwipe	Krackeler Scientific, Inc.	1945-34155-CS
Standardstativ		Verschiedenes iSight
Kamera oder Webcam	Apple	M8817LL/A	Gut für größere Kaulquappen, aber kleine sind schwer zu sehen
Tragbarer Computer	Apple/PC	Verschiedenes	Wir haben ein 13" MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo mit MacOSX Lion 10.7.5
MiniDV Handycam Camcorder	SONY	DCR-HC42	verwendetVerbunden über Firewire mit dem Computer mit einem 6-adrigen und 4-adrigen alpha FireWire 400
Handycam-Station	SONY	DCRA-C121	Dies kann zum Verbinden von Firewire mit der Kamera verwendet werden
QuickTime Player Software	Quicktime	Version 10.1
26 G Nadel (5/8" Länge)	VWR	BD305115
Dumont #5 Pinzette	Fine Science Tools	11295-10
Einwegartikel
Gentamicinsulfat [50 mg/ml]	Fisher Scientific	17-528Z	Gelagert bei RT
Sylgard 184 Silikonelastomer	Fisher Scientific	NC9644388
Instant ocean	Doctors Foster and Smith	CD-116528	Stammlösung = 100 g/L gelagert bei RT
Natriumphosphat zweibasisch	Sigma Aldrich	S0876	Stammlösung = 0,4 M gelagert bei RT
In vitro befruchtete Embryonen	eNasco	LM00490MX	100 Embryonen/Einheit