Zelloberflächenmarker vermittelte Reinigung von iPS-Zellen aus einer Zwischen Reprogrammierbare Maus-Modell

Summary

Embryonale Fibroblasten der Maus können durch die erzwungene Expression der Transkriptionsfaktoren Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc mit geringer Effizienz in induzierte pluripotente Stammzellen reprogrammiert werden. Die seltenen Zwischenprodukte der Reprogrammierungsreaktion sind FACS-isoliert durch Markierung mit Antikörpern gegen die Zelloberflächenhersteller Thy-1.2, Ssea-1 und Epcam.

Abstract

Reife Zellen können in einen pluripotenten Zustand umprogrammiert werden. Diese sogenannten induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) sind in der Lage, alle Zelltypen des Körpers hervorzubringen und haben daher ein enormes Potenzial für Anwendungen in der regenerativen Medizin. Traditionell werden iPS-Zellen durch virale Einführung der Transkriptionsfaktoren Oct-4, Klf-4, Sox-2 und c-Myc (OKSM) in Fibroblasten erzeugt. Die Reprogrammierung ist jedoch ein ineffizienter Prozess, da nur 0,1-1% der Zellen in einen pluripotenten Zustand zurückkehren, was es schwierig macht, den Reprogrammierungsmechanismus zu untersuchen. Eine bewährte Methode, die es ermöglicht hat, den Reprogrammierungsprozess zu untersuchen, besteht darin, die seltenen Zwischenprodukte der Reaktion von der refraktären Massenpopulation zu trennen. Im Fall von embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus haben wir und andere bereits gezeigt, dass reprogrammierende Zellen eine deutliche Reihe von Veränderungen im Expressionsprofil von Zelloberflächenmarkern durchlaufen, die für die Trennung dieser Zellen verwendet werden können. In den frühen Stadien der OKSM-Expression verlieren die erfolgreich reprogrammierenden Zellen den Fibroblasten-Identitätsmarker Thy-1.2 und regulieren den Pluripotenz-assoziierten Marker Ssea-1 hoch. Der endgültige Übergang einer Untergruppe von Ssea-1-positiven Zellen in den pluripotenten Zustand wird durch die Expression von Epcam in den späten Stadien der Reprogrammierung markiert. Hier geben wir eine detaillierte Beschreibung der Methodik, die verwendet wird, um Reprogrammierungs-Zwischenprodukte aus Kulturen von Reprogrammierungs-MEFs zu isolieren. Um die experimentelle Reproduzierbarkeit zu erhöhen, verwenden wir einen reprogrammierbaren Mausstamm, der so konstruiert wurde, dass er einen transkriptionellen Transaktivator (m2rtTA) unter Kontrolle des Rosa26-Locus und OKSM unter Kontrolle eines Doxycyclin-responsiven Promotors exprimiert. Zellen, die aus diesen Mäusen isoliert wurden, sind isogen und exprimieren OKSM homogen nach Zugabe von Doxycyclin. Wir beschreiben detailliert die Etablierung der reprogrammierbaren Mäuse, die Derivation von MEFs und die anschließende Isolierung von Zwischenprodukten während der Reprogrammierung in iPS-Zellen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS).

Introduction

Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) von der inneren Zellmasse des Blastozysten Embryonen ¹ abgeleitet. Unter geeigneten Kulturbedingungen sie selbst zu erneuern und bleiben pluripotent. Im Jahr 2006 Yamanaka und Kollegen gezeigt, dass reife Zellen kann durch Zwangs Expression des Transkriptions in sogenannte induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) umprogrammiert werden Faktoren Oct-4, Klf-4, Sox-2, c-Myc (OKSM) ^2. iPS-Zellen, wie ES-Zellen, die zu allen Zelltypen des Körpers geben kann, jedoch sind sie frei von den ethischen Einschränkungen rund um die Erzeugung von ES-Zellen ^3. Außerdem iPS-Zellen tragen das Versprechen der personalisierten regenerativen Medizin und halten ein enormes Potenzial für Anwendungen wie Krankheitsmodelle und in vitro Wirkstoff-Screening ^4,5. Um zum Umprogrammieren Technologie, um dieses Potenzial zu erfüllen, der grundlegende Mechanismus der Kern Neuprogrammierung muss vollständig verstanden werden. Die Bemühungen um die Neuprogrammierung pat sezierenHWAY durch die Tatsache, dass nur eine sehr kleine Anzahl von Zellen umzuprogrammieren (0,1-1%) behindert. Umprogrammierung erfolgreich Fibroblasten wurde berichtet, dass eine deutliche Reihe von Veranstaltungen, darunter eine epitheliale mesenchymale Übergang ^6-10, und in der letzten Phase der Reprogrammierung, die Aktivierung des endogenen Kern Pluripotenz Netzwerk ^11-14 zu unterziehen. Wir und andere ^12,13,15-17 haben kürzlich eine Reihe von Zelloberflächenmarkern, die für die Trennung von seltenen Zwischenprodukte aus dem feuerfesten Massenpopulation ermöglicht identifiziert. Reprogrammierung embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) unterzogen werden Veränderungen in der Expression von Thy-1.2, Ssea1 und EpCAM (unter anderem) in der 2-wöchigen Umprogrammierung ^15. Früh während Umprogrammierung eine Teilmenge von MEFs nach unten regulieren die Expression von Fibroblasten-Identitätsmarker (Thy-1.2) und starten Sie dann die Pluripotenz-assoziierten Marker ^SSEA-1-12 abzugeben. Während der letzten Phase der Reprogrammierung Ssea1-positiven Zellen reACTIVaß endogenen Pluripotenz-Gene wie Oct-4 ^10-13,15. Dieser letzte Übergang ist an der Zelloberfläche durch eine nachweisbare Expression von EpCAM (siehe Abbildung 1) oder in einem späteren Stadium PECAM ¹⁵ gekennzeichnet. Kürzlich, O'Malley et al. Berichteten über die Verwendung von CD44 und ICAM-1 als Alternative oder Ergänzung zu Thy-1.2 und SSEA-1 zur Identifizierung von Umprogrammierung Zwischenprodukte. Wir haben bereits FACS extrahiert Umprogrammierung Zwischenprodukte von Tag 0, Tag 3, Tag 6, Tag 9 und Tag 12 Umprogrammierung Kulturen, als auch von etablierten iPS-Zelllinien auf der Grundlage dieser Zelloberflächenmarker ^15,18. Für die unten beschriebene Umprogrammierung System und Bedingungen haben wir auf Einzelzellebene, dass, obwohl die Bevölkerung sind ruhig homogen, es gibt eine gewisse Heterogenität in den identifizierten Zwischen Populationen gezeigt. Es ist zu beachten, dass nur eine Untergruppe von Zellen innerhalb dieser Populationen kann in die jeweils nächste STA Fortschrittge der Umprogrammierung und führen zu iPS-Zellkolonien an verschiedenen Wirkungsgrade, die zuvor ausgiebig ^15,19 geprägt haben. Darüber hinaus wird die Neuprogrammierung Effizienz dieser Populationen sowie auf die Re-Beschichtung und Kulturbedingungen ab. Experimentelle Reproduzierbarkeit zu erhöhen verwenden wir eine wiederprogrammierbare Mausstamm, die konstruiert wurde, um einen Transkriptions Transaktivator (m2rtTA) unter der Kontrolle des Rosa26 Locus und einer polycistronischen OKSM Kassette unter der Kontrolle eines Doxycyclin ansprechenden Promotor ^20,21 auszudrücken. Unter Verwendung dieses Maus-Modell umgeht die unerwünschten Nebenwirkungen der traditionellen viralen Methoden der iPS Zellbildung, dh, einer heterogenen Ausgangspopulation mit Zelle zu Zelle Schwankungen in der Anzahl und Lage der Integrationsstellen von viralen Inserts. Zwei transgene Mausstämme (OKSM, m2rtTA), als Gründer homozygote Tiere am Jackson Laboratory zur Verfügung haben, um das zu schaffen reprogra überquert werdenmmable Maus-Modell (siehe Abbildung 2). In dieser Handschrift beschreiben wir im Detail, wie MEFs ableiten, iPS-Zellen zu generieren, und isolieren die Umprogrammierung Zwischenprodukte in den verschiedenen Stadien des Umwandlungsprozesses durch FACS.

Protocol

1. Geräteeinstellungen / Reagenz-Vorbereitung / Genotypisierung

1. Bereiten iPS-Zellmedium: Nachtrag 500 ml Knockout DMEM-Medium mit 75 ml fetales Rinderserum (FBS), 5 ml L-Glutamin, 5 ml Nicht-essentielle Aminosäuren, 500 ul β-Mercaptoethanol, 5 x 10 ⁵ Einheiten Leukämie-hemmenden Faktor ( LIF). Bitte beachten Sie Materialliste für die Produktinformationen und Kaufhinweise für Reagenzien im Rahmen dieser Handschrift verwendet.
2. Bereiten MEF Medium: Nachtrag 500 ml DMEM-Medium mit 50 ml FBS, 5 ml L-Glutamin, 5 ml Nicht-essentielle Aminosäuren, 5 ml Natrium Pyruvat, 500 ul β-Mercaptoethanol.
3. Bereiten Gefriermedium: Für 10 ml, kombinieren 9 ml FBS mit 1 ml DMSO.
4. Vorbereitung Gelatine beschichteten Schalen In 3-5 ml 0,1% Schweine-Gelatine-Lösung in eine T75-Flasche, Inkubieren bei Raumtemperatur für mindestens 10 min und saugen unmittelbar vor Gebrauch.
5. Bereiten FACS Markierungsmedium: Für 10 ml, 9,9 ml kombinieren PBS mit 0,1 ml FBS.
6. Ausführeneine PCR zur Genotypisierung Rosa26 m2rtTA locus: Führen Reaktionen mit Taq-DNA-Polymerase gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie eine modifizierte MgCl ₂ -Konzentration von 3,5 mm und die folgenden 3 Primer: oIMR8052: 5 'GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC 3', oIMR8545: 5'AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT 3 ', oIMR8546: 5' GGA GCG GGA GAA GAT ATG ATG 3 '. Zyklusbedingungen: 94 ° C für 3 min; 35 Zyklen (94 ° C für 30 sec, 65 ° C für 1 min, 72 ° C für 1 min); 72 ° C für 2 min; halten bei 12 ° C. Erwartete Produktgröße: 650 bp für Wildtyp-Allel und 340 bp für die mutierte Allel.
7. Führen Sie eine Genotypisierung PCR für die Kollagen-StemCa / OKSM Ort: Führen Reaktionen mit Taq DNA Polymerase, wie pro Anweisungen. Verwenden Sie eine modifizierte MgCl ₂ -Konzentration von 2,5 mm und die folgenden 3 Primer: col / FRT-B: 5 'CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3', col / frtA1: 5 'GCACAGCATTGCGGACATGC 3', col / frtC1: 5 'GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 '. Zyklusbedingungen: 95 ° C für 1 min: 2 Zyklen (94 ° C für 30 sec, 70 ° C für 45 sec), 6 Zyklen (94 ° C für 30 sec, 68 ° C für 45 sec) und 30 Zyklen von (94 ° C für 20 sec, 60 ° C für 1 min); 72 ° C für 5 min; halten bei 12 ° C. Erwartete Produktgröße: 331 bp für Wildtyp-Allel und 551 bp für mutierte Allel.
8. Führen Sie alle Schritte Zentrifugation bei 400 g für 3 min bei 4 ° C.

2. Erzeugung von embryonalen Maus-Fibroblasten

1. Führen Sie eine Zeitüberschreitung Paarung zwischen einem Tier der OKSM Stamm mit einem Mitglied des anderen Geschlechts des m2rtTA Belastung. Ernte Embryonen embryonale Tag 13.5 durch Keulung, die Mutter und das Entfernen des Uterushorn. Vor dem Entfernen des Uterushorns, sprühen die Bauchregion mit einer 80% igen Ethanollösung, um eine mikrobielle Kontamination zu vermeiden.
2. Übertragen des Uterushorns in eine 10 cm-Gewebekulturschale mit 10 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Verwendung sterilisiert chirurgischer Qualität Schere, um die Uterushorn in Stücke geschnitten, die einen Embryo (siehe 3A, B).
3. Verwenden Sie ein Dissektionsmikroskop (idealerweise innerhalb einer Gewebekultur Haube platziert) und sterilisiert Pinzette vorsichtig die Gebärmutterhülle und die extraembryonalen Membranen jedem Embryo umgibt. Übertragen Sie jede Embryo zu einem separaten 10-cm-Schale mit 10 ml PBS.
4. Gehen Sie durch das Embryonen Kopf, Gliedmaßen, Schwanz und inneren Organen (Herz, Leber, Darm etc.) mit der Pinzette zu entfernen (siehe Abbildung 3C). Übertragen Kopf des Embryos in ein 1,5-ml-Röhrchen und frieren unten, damit es für die Genotypisierung verwendet werden, wenn nötig.
5. Transfer des Embryos Oberkörper in ein leeres 10cm Platte und mit zwei chirurgische Messer, um den Embryo für 2 min Blatt vor den Mund. Gib 200 ul Trypsin / EDTA-Lösung auf die Oberseite des zerkleinerten Embryo und Inkubation für 3-5 min bei RT. Weiter Hacken für weitere 2 min, 2 ml MEF Medien in aktivieren Trypsin, und dann in einem 15-ml-Tube übertragen.
6. Verwenden Sie ein 1.000 ul Pipette, um das Gewebe durch vorsichtiges Pipettieren weiter mechanisch zu trennen. Transfer zu einem Gelatine beschichtete 10 cm Schüssel und fügen Sie eine zusätzliche 10 ml MEF-Medien. Hinweis: Beide normoxischen und hypoxischen Inkubatoren für die Kultur verwendet werden, beziehen sich auf Diskussion für weitere Informationen.
7. Nach 24-48 Stunden sollte die Platte dicht mit MEFs abgedeckt werden.
8. Alternativ können die Zellen dann weiter vermehrt oder eingefroren werden nach unten. Für das Einfrieren von Zellen, entfernen Sie den Kulturmedien, spülen Sie die Schale mit 10 ml PBS, um Spuren von Medien und Overlay mit 3 ml Trypsin / EDTA-Lösung zu entfernen. Inkubation für 3-5 min bei 37 ° C, Inaktivierung von Trypsin-Verdau durch Zugabe von 5 ml MEF Medien und in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Spin-Down und das Pellet in 3 ml Einfrieren Medien. Transfer zum 3 Kryoröhrchen und frieren in einer Zelle Gefrierbehälter.

3. Reprogrammierung von MEFs

ove_content "> Hinweis: Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 200 g für 5 min bei 4 ° C und verwenden Sie normoxic Gewebekultur-Inkubatoren für eine Neuprogrammierung Es kann von Vorteil sein, ableiten und erweitern MEFs unter hypoxischen Bedingungen (5% Sauerstoff, siehe Diskussion für weitere Informationen. ).

1. Tauen schnell einen niedrigen Durchgang Kryoröhrchen (P0-P1, 2-3 Mio Zellen) in einem Wasserbad (37 ° C) und den Inhalt zu übertragen in eine Röhre mit 10 ml vorgewärmten MEF Medien. Pellet-Zellen resuspendieren in 12 ml frischem MEF Medien, übertragen in eine Gelatine beschichtete T75 Kulturgefäß und lassen Zellen für 24-48 Stunden, bevor Sie fortfahren erholen. Hinweis: MEFs kann auch direkt nach der Ableitung verwendet werden.
2. Nach der Entfernung des Kulturmediums, Waschen mit PBS und MEFs cellularize durch Überlagerung mit einer Trypsin / EDTA-Lösung (3 ml für 3-5 min bei 37 ° C). Quench Trypsin durch Zugabe von 5 ml MEF Medien und weiteren distanzieren Zellen durch vorsichtiges Mischen mit einer 10 ml Pipette. Bestimmen die Zellzahlen mit einer Zählkammer.
3. Für reprogrammierung Experimenten Saatgut MEFs auf mit Gelatine beschichteten T75-Kolben mit Dichten von 6,7 x 10 ³ Zellen / cm ² (~ 0,5 Mio Zellen pro Kolben) in iPSC Medien, enthaltend 2 ug / ml Doxycyclin. Siehe Tabelle 1 bezüglich der Aussaat Empfehlungen auf rund 2 Mio Umprogrammierung Zwischenprodukte für jeden Zeitpunkt zu erhalten. Anmerkung: Die Neuprogrammierung beginnt mit der Zugabe von Doxycyclin (2 ug / ml) ergänztem Medium
4. Für die ersten 6 Tage ersetzen Medien jeden zweiten Tag mit frischen Doxycyclin ergänzt iPSC Medien (12 ml Medium pro T75-Flasche). Über diesen Punkt hinaus zu verlängern Medien täglich, wenn es hohen Zellzahlen. Verdoppeln Sie die Lautstärke, wenn Kultur Medien Änderungen können nur jeden zweiten Tag durchgeführt werden.
5. Ernte Umprogrammierung Zwischenprodukte bei den erforderlichen Zeitpunkten (Vorschlag: Tag 3, 6, 9, 12) durch Entfernen Medien, Spülen mit geeigneten Volumen PBS (10 ml für eine T75-Flasche) und Überlagerung mit Trypsin-EDTA-Lösung (3 ml für eine T75-Kolben). Bebrütenfür 3-5 min bei 37 ° C und Abschrecken durch Zugabe von 5 ml iPSC Medien gefolgt von vorsichtiges Pipettieren.
6. Zählen Zellsuspension mit einem Hämozytometer (siehe oben), ein Pellet durch Zentrifugation absaugen Überstand und Zellen in 10 ml PBS, um alle Spuren von Trypsin zu entfernen. Pellet-Zellen wieder absaugen Überstand und fahren Sie mit Schritt 4.1, um die Neuprogrammierung Zwischenprodukte zu isolieren. Hinweis: Zellen, die eine Umprogrammierung können kryokonserviert und für die FACS-Isolierung aufgetaut zu einem späteren Zeitpunkt sein.
7. Vollständig neu programmiert iPS-Kulturen zu schaffen, wachsen Zellen im DOX frei iPSC Medien für weitere 4-7 Tage. Hinweis: Erfolgreich Umprogrammierung Kulturen wird eine große Anzahl von Kolonien, die von Tag 12 enthalten (siehe Abbildung 4). Während dieser Zeit werden abweichende iPS-Zellen, die noch OKSM Ausdruck erfordern verschwinden.
8. Zunächst Saatgut bestrahlten MEFs bei einer Dichte von 15 x 10 ³ Zellen / cm ^2: Alternativ kann die verbleibenden vollständig reprogrammiert iPS Kulturen ausbreiten in 12 ml iPSC Medien auf einen mit Gelatine beschichteten T75-Kolben einen Tag oder 6 Stunden vor den Experimenten.
9. Als nächstes cellularize iPS Zellkulturen durch Entfernen von Medien, Spülen der T75-Kolben mit 10 ml PBS, Überschichten mit 3 ml Trypsin-EDTA-Lösung und Inkubation für 3-5 min bei 37 ° C aufweist. Stillen Trypsin durch Zugabe von 5 ml iPSC Medien, gefolgt von leichtem Mischen, Transfer zu einem 15 ml konischen Röhrchen, Spin-down und dann in 10 ml iPS Medien suspendiert.
10. Übertragen 500 ul dieser Zellsuspension auf den bestrahlten MEFs (T75-Kolben) und ermöglichen die Kulturen für 4-5 Tage wachsen. Hinweis: Gegründet iPS Kulturen kryokonserviert oder für Experimente genutzt werden. Klonalen Zelllinien können durch Aufnehmen einzelner iPSC Kolonien unter einem Binokular ²² abgeleitet werden.
11. Cryo bewahren konfluenten iPSC Kulturen wie in 2.8 für MEFs beschrieben.

4. Antikörpermarkierung

1. Resuspendieren Zellpellets der Reprogrammierung Kulturen, wie in Abschnitt 3 hergestellt, inFACS Etikettenmedium mit Antikörpern ergänzt (anti-Thy-1.2 pacific blue 1: 400, anti-SSEA-1-Biotin-1: 400 und anti-EpCAM Fitc 1: 400). Verwenden Sie 200 ul ergänzt Markierungsmischung pro 5 Millionen Zellen und Inkubation auf Eis.
2. Nach 10 Minuten vorsichtig auf die Tube, um die Zellen für weitere 10 min auf Eis inkubiert und erneut zu suspendieren. 10 ml kaltem PBS pro Röhrchen und Spin-Down.
3. Für jedes Röhrchen zu färbenden vorzubereiten 200 ul Etikettenmedium mit 1 ul Streptavidin-PeCy7 (1: 200) ergänzt werden, je 5 Millionen Zellen. Wenn Zellen wurden pelletiert, der Überstand vorsichtig absaugen und resuspendieren in einem geeigneten Volumen von Etikettenmedium mit Streptavidin-PeCy7 ergänzt.
4. Halten Zellen auf Eis für 10 min, tippen, um wieder zu suspendieren, Inkubation für weitere 10 min auf Eis, 10 ml kaltem PBS pro Röhrchen, Spin-down und saugen Stand.
5. Resuspendieren Zellpellets in Etikettenmedium mit Propidiumiodid (PI) (2 ug / ml) ergänzt war, bei etwa 1 x 10 ⁷ Zellen / ml. Zellklumpen zu entfernen, indem die Suspension durch ein 70 um Sieb. Transferzellen zu einem geeigneten FACS-Röhrchen und halten sie auf dem Eis.
6. Bereiten getrennte Proben mit einzelnen Antikörper (anti-Thy-1.2, Anti-SSea-1 und anti-EpCAM). HINWEIS: Diese sind erforderlich, um die Farbkompensation in den drei Kanälen in der Analyse verwendet werden, vornehmen. Darüber hinaus werden nicht-markierten Zellen benötigt, um Spannungen und Toren für die Sortierung eingestellt. Idealer iPS-Zellen sind für die Entschädigung verwendet: Aktien von 0,5-1 x 10 ⁶ iPS-Zellen an bestrahlten MEFs gehalten werden in Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff gelagert. Die Anwesenheit von MEF ist unerlässlich, um ein Signal in der Thy-1.2 Kanal.
7. Tauwetter ein Kryoröhrchen von iPS-Zellen wie für MEFs (Abschnitt 3) beschrieben. Nach der Zentrifugation wird Zellen in 800 ul Markierungspuffer und 200 ul dieser Probe zur Seite, als dem unmarkierten Steuerung eingestellt.
8. Verwenden Sie die restlichen Zellen als Entschädigung Kontrollen. Kluft zwischen Zellen drei 15-ml-Röhrchen und fügen Antikörperwie folgt: Pacific Blue Entschädigung Kontrolle: 0,5 ul der Anti-Thy-1.2 Pacific Blue-Antikörper. Fitc Ausgleichsrohr: add 0,5 ul des anti-EpCAM-Antikörper Fitc. Pe-Cy7 Kompensationssteuerung: 0,5 ul der Anti SSea-1-Biotin-Antikörper.
9. Halten Zell-Antikörperproben auf Eis für 10 min, mischen, indem Sie und Inkubation für 10 min auf Eis.
10. Wasch Proben mit 10 ml kaltem PBS, um ungebundene Antikörper zu entfernen, drehen Zellen nach unten und saugen Sie den Überstand. Resuspendieren Zellpellets in 200 ul FACS-Markierungsmittel.
11. Für anti-SSEA-1-Biotin markierten Proben, fügen Sie ein Streptavidin-Konjugat PeCy7 (1 ul pro 200 ul Zellen). Label-Zellen wie für primäre Antikörper (SSEA-1-Biotin) beschrieben.
12. Geben Sie alle Proben, einschließlich der unmarkierten Kontrolle durch eine 70 um Sieb und fügen PI (2 pg / ml). Übertragen Zellen FACS-Röhrchen und auf Eis zu halten, bis sie benötigt.

5. FACS Isolierung von Zwischenprodukten

Hinweis:Zellen werden unter Verwendung eines Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer mit 405 nm, 488 nm und 560 nm Anregungslaser und einer 100 um Düsen sortiert.

1. Eingerichtet Spannungen für vorne und Seitenstreuung, so dass die Zellpopulation richtig sichtbar wird. Ziehung einer Gate um die Zellen, wie in 5A gezeigt, um Verschmutzungen auszuschließen. Hinweis: Der korrekte Aufbau von Spannungen auf der Zellsortierer kann komplex sein und erfordert einen erfahrenen FACS-Operator.
2. Verwendung Vorwärtsstreuung (FSC) Höhe gegen die FSC-Bereich, um Aggregate (5B) auszuschließen.
3. Visualisieren Sie die PI-Kanal im Vergleich zu FSC Tor in auf den negativen PI lebenden Zellen (5C).
4. Verwenden Sie die nicht-markierten Zellen, um die Spannungen für die Fluoreszenzkanäle von PB, Fitc / GFP, Pe-Cy7 einzustellen. Idealer positionieren Zellpopulation an dem unteren Ende des jeweiligen Kanals.
5. Eingestellt Gates mit dem unmarkierten Kontrollzellen, wie in 6A, B sub Fraktion der Umprogrammierung gezeigt Kultnahmen in Tag 3, 6 und 9 Populationen: SSea-1 / Thy-1.2 +-Zellen; SSea-1 / Thy-1.2-Zellen; und die Neuprogrammierung Zwischenprodukte SSEA-1 + / Thy-1.2-Zellen.
6. Weiter unterteilen den Tag 9 SSEA-1 + / Thy-1.2-Fraktion mit der Pe-Cy7 gegen Fitc Blot; ziehen Toren um SSE-a1 + / EpCAM + Zellen und die SSEA-1 + / Epcam- Zellen. Eingestellt Gates mit dem unmarkierten Kontrollzellen, wie in 6C, D dargestellt.
7. Vor dem Sortieren die gewünschten Subpopulationen (siehe Abbildung 7 für repräsentative FACS-Profile für MEFs, Tag 3 / Tag 6 / Tag 9 / Tag 12 Kulturen und iPS-Zellen) prefill geeignete Sammelrohre mit iPS-Zellmedien (1-2 ml).
8. Führen FACS-Sortierung nach Hersteller-Protokoll.
9. Nach FACS Isolierung einreichen Zellen, molekulare Profilierung (RNA / Protein-Extraktion, Chromatinimmunpräzipitation, DNA-Analyse Methylom etc.). Alternativ können die verschiedenen Zellfraktionen kultiviert werden.

Results

Nach der Präparation, Zerlegung und Galvanisieren eines E13.5 Mausembryo wird ein 10 cm Schüssel erwartet Konfluenz in ca. 1 bis 2 Tagen erreichen. In diesem Stadium ist es normal, dass die Kultur einige anhaftenden Gewebestücke, die nicht richtig zellularen wurden enthalten. Diese werden nach der Passage verschwinden.

Nach Doxycyclin Induktion, Neuprogrammierung MEFs unterziehen deutliche morphologische Veränderungen. Um Tag 6, sollte früh Kolonie artigen Flecken beginnen zu entstehen (4C). Diese werden weiter an Größe bei weiterer Kultur wachsen (siehe Abbildung 4D, E). Eine gute Anpassung Experiment ist in> 500 Kolonien pro T75, die zunächst mit 5 x 10 ⁵ Zellen (4E) ausgesät wurde führen. Gegründet iPS Kulturen besitzen charakteristische Kuppel geformt Kolonien und sollte vor allem frei von differenzierten Zellen (4F) sein. Gelegentlich zusätzlichen Passagieren von iPS cultures erforderlich, um undifferenzierte / teilweise neu programmiert Zellen zu entfernen; eine konfluente Kolben von Zellen bei einem Verhältnis von 1:10 auf einer Feeder-Schicht von bestrahlten MEFs aufgeteilt werden.

Wie oben erwähnt, sind morphologischen und molekularen Veränderungen während der Umprogrammierung durch Änderungen in den FACS Profile für Thy-1.2, SSEA-1 und schließlich EpCAM (siehe 7A-F) reflektiert. Wie bereits berichtet, ^12,15, während MEFs sind überwiegend positiv für Thy-1.2 und negativ für die anderen Markern, Tag 3 Kulturen schauen schon deutlich anders. Ein großer Teil der Zellen begonnen haben, nach unten zu regulieren die Expression von Thy-1.2 und eine sehr kleine Teilmenge dieser Thy-1.2-negativen Zellen haben sich positiv für SSea-1, dem eigentlichen Umprogrammierung Zwischenprodukt für diesem Zeitpunkt. Die Anzahl der Zwischenprodukte, die Neuprogrammierung von Tag extrahiert werden können 3 Kulturen ist sehr unberechenbar wie der Prozentsatz der SSEA-1 + / Thy-1.2-liegt üblicherweise in einem Bereich zwischen 1-10% viablE-Zellen. An den Tagen 6 und 9 ein erhöhter Prozentsatz von SSEA-1 +-Zellen, in der Regel deutlich über 10% festgestellt werden. Um Tag 12 eine Teilmenge von SSea-1-positiven Zellen nachgewiesen werden kann, die auch beschriften positiv für EpCAM. Tag 12 Kulturen, wie Tag 3 Kulturen, stellt einen Engpass bei der Reinigung von Zwischenprodukten, als der Prozentsatz von SSEA-1.2 + / EpCAM + Zellen ist variabel und liegt in der Regel im Bereich von nur 2-4% aller lebenden Zellen. Die erwartete Anzahl der Reprogrammierung Zwischenprodukte in Tabelle 1 dargestellt dient nur als grobe Annäherung. Gegründet bona fide iPS-Zellkulturen für SSea-1 und EpCAM stark positiv sein.

Abbildung 1. Oberflächenmarker Änderungen während der Umprogrammierung Weg: Die Herunterregulierung von Fibroblasten Identitätsmarker Thy-1.2 wird durch Hochregulation der gefolgtSSea-1. Der Übergang von einer Teilmenge von SSea-1-positiven Zellen zu einer pluripotenten Zustand wird durch Übernahme von EpCAM um Tag 12 angedeutet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Schematische Darstellung der wiederprogrammierbaren Mausmodell. M2rtTA Ausdruck ist unter der Kontrolle des ubiquitär aktiven Rosa26 Locus in Gegenwart von Doxycyclin (DOX) die m2rtTA Protein bindet an ein Tetracyclin abhängigen Promotor (tetOP) an der Collagen 1a1 (COL1A1) locus, was zur Expression des Faktor vier Kassetten. Zwei bicistronischen Kassetten werden durch eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) verbunden ist. Offene Leserahmen für Oct-4 / Klf-4 und Sox-2 / c-Myc sind fu durch selbstspalt F2A und E2A-Sequenzen sed sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Embryo Dissektion: (A) Transfer Uterushorn in eine 10 cm-Schale mit 10 ml PBS und (B) gefüllt in Stücke, die einen Embryo zu schneiden. (C) Mit einer Pinzette befreien die Embryonen von zusätzlichen embryonalem Gewebe und entfernen Sie den Kopf, Gliedmaßen, Schwanz und der inneren Organe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 4. Morphologische Veränderungen während der Umprogrammierung. Colony-Patches wie offensichtlich in den Kulturen von Tag 6 ab. Bona-fide-iPS-Zellen werden von einem gewölbten förmige Morphologie gekennzeichnet. (A) Tag 0 / MEFs, (B) Tag 3, (C) Tag 6, (D) Tag 9, (E) Tag 12, (F), iPS-Zellkultur. Maßstab:. 200 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5. Grund FACS-Setup. (A) ausschließen Trümmer mit Side Scatter gegen Forward Scatter-Blot-Gebiet. (B)Aggregate aus Nicht-Trümmer auszuschließen durch Gating auf Einzelzellpopulation mit Forward Scatter Bereich gegenüber Forward Scatter Hohe Blot. (C) ausschließen toten Zellen von der Einzelzellpopulation durch Gating auf PI niedrigen Veranstaltungen mit PI-Kanal im Vergleich Forward Scatter Bereich abklopfen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6. Gating. (A, B) Mit den unmarkierten Kontrollzellen bis Tore-Set für Thy-1.2 + /-1-Zellen SSea, Thy-1.2-/ SSea-1-Zellen und Thy-1.2-/ SSea-1 + Zellen. (C) Verwenden Sie die nicht-markierten Kontrollzellen, um Tore für EpCAM positiven und EpCAM-negativen Zellen gesetzt. (D) SSEA-1 + / Thy-1.2-Zellen können getrennt werdenin eine EpCAM positiven und negativen in eine EpCAM Bevölkerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 7. Thy-1.2-1 gegenüber SSea FACS-Blots in verschiedenen Stadien der Umprogrammierung. (A) Tag 0 / MEFs, (B) Tag 3, (C) Tag 6, (D) Tag 9, (E)-Tag 12, (F) iPS Zellkultur.

Tabelle 1. Empfohlene Aussaatdichte, Anzahl Kolben und die erwarteten Ergebnisse für P1 MEFs eines Embryos heterozygot für OKSM und m2rtTA. Bitte klicken here, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tag	Anzahl der T75-Kolben ausgesät am Tag 0	Gesamtzahl der Ssea1 +-Zellen nach FACS	Gesamtzahl der Ssea1 + / EpCAM + Zellen nach FACS
3	8	2 Millionen
6	4	2 Millionen
9	4	2 Millionen
12	10	10 Millionen	2 Millionen

Discussion

Um erfolgreich zu reprogrammieren MEFs in iPS-Zellen und Reprogrammierung Zwischenprodukte bei hohen Menge zu reinigen ist es wichtig, sich bewusst von Faktoren, die einen Einfluss auf die Gesamteffizienz haben. Insbesondere die Reihe der FBS verwendet, um iPS-Medien ergänzen können einen nachteiligen Effekt haben. Im Allgemeinen wurden positive Erfahrungen mit embryonalen Stammzellen (ES) Zell qualifizierte FBS aber Chargenprüfung von Seren aus einer Vielzahl von Anbietern könnte eine billigere Alternative zu identifizieren gemacht.

Ein weiterer Faktor, der Auswirkungen auf die Umprogrammierung Effizienz ist der Genotyp des MEFs ^15,20. Obwohl MEFs von Mäusen, die heterozygot (Het) für sowohl die OKSM und m2rtTA Locus keine Umprogrammierung homozygousity an einem oder beiden Loci führt zu einer höheren Effizienz Umprogrammierung abgeleitet. Tatsächlich MEFs von den Nachkommen von OKSM und m2rtTA Kreuze abgeleiteten zeigen einen Anstieg der Neuprogrammierung Effizienz in der folgenden Reihenfolge (OKSM / m2rtTA): het / het Tabelle 1 angegeben sind het / het Tiere). In den seltenen Fällen eine männliche Homo / homo Tier festgestellt, kann ein Harem Paarung mit mehreren Weibchen m2rtTA eingerichtet werden. Alle Nachkommen dieser Kreuzungen wird het werden / homo für die OKSM / m2rtTA Loci auf. Darüber hinaus ist die schnelle Genotypisierung von Würfen empfohlen, da größere Würfe bei Verwendung jüngere Mäuse zur Züchtung (6-15 Wochen alt) erhalten.

Darüber hinaus ist die Verwendung von niedrigen Passage MEFs für Reprogrammierung unterstrichen ^23. Wenn MEFs wurden in einer Gewebekultur-Inkubator normoxic abgeleitet und erweitert empfehlen wir dringend, nur diese Zellen bis zu Durchgang 2. Allerdings, wenn der Experimentator hat Zugang zu einem niedrigen Sauerstoff Inkubator (5% Sauerstoff) für die Ableitung und Erweiterung des MEF, Durchgang Zahlen so hoch wie 3 noch gut ²³ Ergebnisse ergeben.

Bei Begegnungen der Experimentator Probleme mit Umprogrammierung verbunden sind, Wie beschrieben sind die wahrscheinlichsten Erklärungen hohe Zahl von Passagen zum Zeitpunkt des DOX hinaus falschen Genotyp der Mäuse oder die Verwendung von FBS, die nicht förderlich für IPS Zellgeneration. In seltenen Fällen haben wir festgestellt, dass MEFs waren nicht in der Lage, selbst unter idealen Bedingungen neu zu programmieren. In diesen Fällen wurde eine spontane de novo Deletion innerhalb des offenen Leserahmen m2rtTA als der eigentliche Grund identifiziert.

Diese Methodik wurde erfolgreich angepasst, um SSea-1 + Zwischenprodukte über magnetische Zelltrennung (MACS) zu extrahieren. Es gibt einen klaren Zeitvorteil bei Verwendung von MACS jedoch die SSea-1 + Zellpopulationen 'Reinheit wird auf 80-90%, statt mehr als 95%, die abhängig von der Art des Experiments werden die Zellen könnten Pose bestimmt reduziert ein Problem. Somit besteht eine Möglichkeit, MACS verwenden, um für SSEA-1 +-Zellen, gefolgt von FACS, um die Reinheit und / oder eine Fraktion davon in SSEA-1 + / EpCAM + und SSEA-1 + / Epcam- Zellen erhöhen bereichern.

"> Während die iPS-Zellen von der skizzierten Protokoll und Maus-Modell produziert haben gezeigt worden, um pluripotent und effektiv dazu beitragen, allen Geweben von chimären Tiere ^15,20, eine reduzierte Kapazität von Embryonen ausschließlich aus diesen iPS-Zellen über tetraploiden Komplementierung zusammen produzieren ist ²⁴ gezeigt. Aberrant Methylierungsmuster in der Dlk-Dio3 Gencluster wurden als Ursache ²⁴ identifiziert. jedoch Zugabe von Ascorbinsäure in einer Konzentration von 50 ug / ml in den Medien während der Umprogrammierung tetraploiden Komplementierung zuständigen iPS ²⁴ zu erzeugen. Bitte wählen Sie aus dieser Sorte umprogrammieren zu deutlich niedrigeren Frequenz im Vergleich darauf hingewiesen werden, dass eine alternative reprogrammierbare Mausmodell entwickelt, um die Neuprogrammierung Faktoren an einer anderen Stöchiometrie ausdrücken kann tetraploiden zuständigen iPS-Zellen auch in Abwesenheit von Ascorbinsäure Behandlung ²⁵ zu produzieren. jedoch in unseren Händen Zellen der hierin verwendete Mausmodusl.

Die in dieser Handschrift beschriebene Methode ermöglicht die Trennung der Reprogrammierung Zwischenprodukte aus der feuerfesten Masse der Bevölkerung und sollten als wertvolles Werkzeug, um zu sezieren und zu verstehen, die Reprogrammierung, die Beseitigung der bisherigen Einschränkungen der mit unfraktioniertem Bevölkerung, um eine für die Profilerstellung (zB zu sehen ist, hohe Signal Lärm von den feuerfesten Zellen). Die hierin beschriebenen Antikörper-Kombination erlaubt die Isolierung von Zwischenprodukten aus Mauszellen mit hoher Reinheit, jedoch ist es möglich, dass zusätzliche Zelloberflächenmarker in der Zukunft, mit denen Zwischenprodukte mit noch höherer Reinheit zu erhalten, wird freigelegt. Bitte beachten Sie, dass SSea-1-Expression ist nicht ein Kennzeichen der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen und als solcher diesem Protokoll kann nicht auf die Neuprogrammierung Zellen menschlichen Ursprungs verwendet werden. Abschließend kann Umprogrammierung Zwischen einmal mit der beschriebenen Methode isoliert für molekulare Analysen einschließlich der Expression Profilin verwendet werdeng, Chromatinimmunpräzipitation, Methylom Analyse und Protein-Assays.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Maus CD90.2 (Thy1.2) Pazifisches Blau	eBiowissenschaften	48-0902-82
Anti-Mensch/Maus SSEA-1 Biotin	eBiowissenschaften	13-8813
Streptavidin PE-Cy 7	eBiowissenschaften	25-4317-82
Anti-Maus CD326 (Epcam) Fitc	eBiowissenschaften	48-5791-82
Natriumpyruvat	Life Technologies	11360-070
MEM-nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA)	Life Technologies	11140-050
Embryonale Stammzellen qualifiziertes fötales Kälberserum (FBS)	Life Technologies
Trypsin-EDTA (0,25%)	Life Technologies	25200-056
GlutaMAX	Life Technologies	35050-070
β-Mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023;
DMSO (Dimethylsulfoxid)	Sigma-Aldrich	D8418
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140
Propidiumiodid-Lösung (PI)	Sigma-Aldrich	P4864-10ML
Gelatine aus Schweinehaut	Sigma-Aldrich	G1890
Doxycyclin-Hyclat	Sigma-Aldrich	33429-100MG-R
Leukämie-Hemmfaktor (LIF)	Millipore	ESG1107
DMEM mit hohem Glukosespiegel	Life Technologies	11960-044
DPBS (Dulbecco-Phosphatpuffer-Kochsalzlösung)	Life Technologies	14190-144;
KnockOut DMEM	Life Technologies	10829-018
Bestrahlte MEFs	Life Technologies	Nr. S1520-100
75 cm2 Gewebekulturkolben	Corning/BD Bioscience
15-ml-Zentrifugenröhrchen	Corning/BD Bioscience
50-ml-Zentrifugenröhrchen	Corning/BD Bioscience
Einweg-OP-Klingen	Clifford Hallam	SM0501
Kryo-Fläschchen	Corning/BD Bioscience
70 µ m Zell-Sieb	BD Bioscience	352340
Taq-DNA-Polymerase	Life Technologies	10342-020