Es gibt einen erkennbaren Bedarf für verbesserte Informationen über molekulare Fahrer von Barrett-Ösophagus. Immunfluoreszenzfärbung ist eine nützliche Technik für das Verständnis der Wirkung von Zell-Signalisierung auf Zellmorphologie. Wir stellen eine einfache, effektive Protokoll für die Verwendung des Immunfluoreszenzfärbung auf therapeutische Behandlung im Barrett-Ösophagus-Zellen zu beurteilen.
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Methodenartikel
Eine Immunfluoreszenz-Verfahren zur Charakterisierung von Barrett-Ösophagus Cells
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Adenokarzinom des Ösophagus (EAC) hat eine Gesamtüberlebensrate von weniger als 17% und die Häufigkeit von EAC hat sich in den vergangenen zwei Jahrzehnten gestiegen. Einer der primären Risikofaktoren EAC Barrett-Ösophagus (BE), ein metaplastischen Veränderungen der normalen Plattenepithel Speiseröhre in Reaktion auf chronische Sodbrennen. Trotz der etablierten Verbindung zwischen EAC und BE, Abfrage der molekularen Ereignisse, insbesondere veränderte Signalwege unter Beteiligung Progression sein, EAC, werden kaum verstanden. Vieles davon ist aufgrund des Fehlens von geeigneten in vitro-Modelle zur Verfügung, um diese Krankheiten zu untersuchen. Kürzlich immortalisierenden Zelllinien sind im Handel erhältlich so dass für in vitro Untersuchungen von BE. Hier stellen wir ein Verfahren zur Immunfluoreszenzfärbung von immortalisierenden Zelllinien, so dass in-vitro-Charakterisierung von Zellsignalen und der Struktur nach der Belichtung, um therapeutische Verbindungen. Anwendung dieser Techniken wird help entwickeln Einblick in die Mechanismen sein, um EAC Progression beteiligt und bieten potenziellen Möglichkeiten für Behandlung und Vorbeugung von EAC.
Einleitung
Barrett-Ösophagus (BE) ist eine metaplastischen Veränderung der normalen Plattenepithel der Speiseröhre und Folge einer chronischen Exposition gegenüber den Mageninhalt von gastroösophagealen Reflux-Krankheit (GERD) 1 resultieren. BE wird gedacht, um ein Schutzmechanismus in Reaktion auf GERD sein, aber die Anwesenheit von BE verleiht ein erhöhtes Risiko für Speiseröhrenkrebs Adenokarzinom (EAC), eine Krankheit, die eine deutlich schlechte Überlebens 1 trägt. Aktuelle Schätzungen gehen davon aus, dass bis zu 5,6% der amerikanischen Bevölkerung haben sich jedoch als BE ist oft asymptomatisch, es wird vermutet, dass die Mehrheit der BE bleibt uner....
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Protokoll
1. Zell Line Maintenance
- Immortalisierte menschliche BE hochgradigen dysplastischen (CP-B,-C CP, CP-D) und metaplastischen (CP-A) Zelllinien durch stabile Transfektion von menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase (TERT) Protein 11.
- Aufrechtzuerhalten Zelllinien in Keratinozyten-Medium mit Rinderhypophysenextrakt (BPE), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 5% fötales Rinderserum (FBS), nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) ergänzt und Standard Gewebekulturbedingungen (37 ° C, 5% CO 2, 98% Luftfeuchtigkeit).
2. BE Zellüberzug
- Herstellung v....
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Ergebnisse
Ein Beispiel für die von der Anwendung der beschriebenen Verfahren erhaltenen Ergebnisse ist in den 1A-D veranschaulicht. Die Deckgläser mit CP-D-und CP-C BE Zellen wurden für 24 h mit 1 uM der Src-Familie-Inhibitor, SKI-606, oder Vehikel (DMSO) behandelt und gefärbt mit den oben beschriebenen Verfahren für die Adherens Junction und Wnt-Signalprotein, β -Catenin. Visualisierung von β-Catenin wurde durch Markierung mit einem Anti-Kaninchen-IgG zu einem grünen Fluorophor gekoppelt erreicht, während die Ke.......
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Diskussion
Wir haben ein Verfahren für die Anwendung der IF von BE-Zellen in Richtung der Aufklärung der physiologischen Wirkungen von zielgerichteten Therapien bei diesen Zellen beschrieben. Zwar haben wir die Verwendung dieser Verfahren zur BE-Zellen beschrieben, haben wir gefunden, daß diese Verfahren auch auf eine Vielzahl von verschiedenen Zelltypen 13,17,18. Ferner können diese Verfahren auf verschiedene Weise zu Färbung für bestimmte Ziele zu optimieren verändert werden.
Wir finden ei.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem St, Joseph-Stiftung (AJF, LJI) und American Lung Association, RG-224607-N (LJI) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| CP-A (Metaplastische Zelllinie) | ATCC | CRL-4027 | |
| CP-B (Hochwertige dysplastische Zelllinie) | ATCC | CRL-4028 | |
| CP-C (Hochwertige dysplastische Zelllinie) | ATCC | CRL-4029 | |
| CP-D (Hochwertige dysplastische Zelllinie) | ATCC | CRL-4030 | |
| Keratinozyten-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | |
| 0,25% Trypsin-EDTA (1x), Phenolrot | Life Technologies | 25200056 | |
| Fötales Rinderserum, qualifiziert, HI | Life Technologies | 10438026 | |
| PSN Antibiotikamischung | Life Technologies | 15640 | |
| PBS - Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Life Technologies | 10010049 | |
| Pro-long Gold Antifade Reagenz mit DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Rundes Deckglas 18 mm | Fisher Scientific | 15-183-86 | |
| β-Catenin Primärer Antikörper (Kaninchen) | Zellsignalisierung | 9562S | |
| Alexa Fluor 488 (Ziege Anti-Kaninchen) | Life Technologies | A11008 | |
| 10 cm TC-behandelte PS-Schale, steril | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 12-Well-TC-behandelte PS-Platte, steril | USA Scientific | 5666-5180 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ammoniumchlorid | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Rinderserumalbumin - Fraktion V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| SKI-606 (Bosutinib) | Selleck Chemicals | S1014 | |
| Quadratische Bioassay-Schale | Thermo Scientific | 240835 | |
| Parafilm | VWR | 82024-546 | |
| Einweg-Pasteurpipetten, Weißglas | VWR | 14672-380 | |
| Nexcelom Mini-Zellzähler | Nexcelom | ||
| Cellometer Zählkammern | Nexcelom | CHT4-SD100-014 | |
| Zeiss Apotome Mikroskop | Zeiss |
Referenzen
- Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis. Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).
- Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C.
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Nachdrucke und Genehmigungen
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