Methodenartikel

Modellierung Astrozytom Pathogenese In-vitro- Und In Vivo Verwenden kortikale Astrozyten oder neuralen Stammzellen aus dem Bedingten, gentechnisch veränderte Mäuse

DOI:

10.3791/51763

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12. August 2014

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1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program, University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology, Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center, University of North Carolina School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Phänotypische Wildtyp-Astrozyten und neurale Stammzellen, die von Mäusen entnommen wurden, die mit floxierten, bedingten onkogenen Allelen gezüchtet und über virale Cre-vermittelte Rekombination transformiert wurden, können zur Modellierung der Astrozytom-Pathogenese in vitro und in vivo durch orthotope Injektion von transformierten Zellen in Gehirne von syngenen, immunkompetenten Wurfgeschwistern verwendet werden.

Zusammenfassung

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Aktuelle Astrozytommodelle sind begrenzt in ihrer Fähigkeit, die Rolle onkogener Mutationen in bestimmten Gehirnzelltypen während der Krankheitspathogenese und ihren Nutzen für die präklinische Arzneimittelentwicklung zu definieren. Um ein besseres Modellsystem für diese Anwendungen zu entwerfen, wurden phänotypisch wildtypische kortikale Astrozyten und neurale Stammzellen (NSC) von bedingten, gentechnisch veränderten Mäusen (GEM) geerntet und in Kultur gezüchtet. Die genetische Rekombination wurde in vitro mittels adenoviraler Cre-vermittelter Rekombination induziert, was zur Expression mutierter Onkogene und zur Deletion von Tumorsuppressorgenen führte. Die phänotypischen Konsequenzen dieser Mutationen wurden durch Messung von Proliferation, Transformation und Wirkstoffansprechen in vitro definiert. Orthotope Allotransplantatmodelle, bei denen transformierte Zellen stereotaktisch in das Gehirn von immunkompetenten, syngenen Wurfgeschwistern injiziert werden, wurden entwickelt, um die Rolle onkogener Mutationen und des Zelltyps bei der Tumorentstehung in vivo zu definieren. Im Gegensatz zu den meisten etablierten Xenotransplantaten aus humanen Glioblastom-Zelllinien führte die Injektion von transformierten kortikalen Astrozyten in die Gehirne immunkompetenter Wurfgeschwister zu Astrozytomen, einschließlich des aggressivsten Subtyps, dem Glioblastom, das die histopathologischen Merkmale menschlicher Astrozytome rekapitulierte, einschließlich der diffusen Invasion des normalen Hirnparenchyms. Die Biolumineszenz-Bildgebung von orthotopen Allotransplantaten aus transformierten Astrozyten, die zur Expression von Luciferase entwickelt wurden, wurde verwendet, um das Tumorwachstum in vivo im Laufe der Zeit zu überwachen. Daher bieten Astrozytommodelle, die Astrozyten und NSC verwenden, die aus GEM mit bedingten onkogenen Allelen gewonnen wurden, ein integriertes System zur Untersuchung der Genetik und Zellbiologie der Astrozytom-Pathogenese in vitro und in vivo und können bei der präklinischen Arzneimittelentwicklung für diese verheerenden Krankheiten nützlich sein.

Einleitung

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Astrozytome sind die häufigsten primären Hirntumoren und Glioblastom (GBM), ein Astrozytom Grad IV, ist die häufigste und aggressive Subtyp mit einer medianen Überlebensrate von 12-15 Monaten 1,2. Invasion diffuse Astrozytome, insbesondere GBM, schließt die vollständige chirurgische Resektion, begrenzt die Wirksamkeit der adjuvanten und führt zwangsläufig zu Nachbehandlung Wiederholung 3. Patienten, die ursprünglich vorhanden entweder mit de novo (primären) GBM oder mit niedrigeren Astrozytomen, die unweigerlich fortschreitet, um (sekundär) 4 GBM. GBM ist genomisch heterogen und durch sich gegenseitig ausschließende und Co-vorkommende Mutationen in Genen, die drei Hauptsignalwege geregelt gekennzeichnet: der G 1 / S (Rb) Zellzyklus-Kontrollpunkt, Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK) und TP53 Pfade 5-7. GBM besteht aus vier Subtypen mit unterschiedlichen genomischen Expressionsprofile, die verschiedenen Hirnzelltypen ähneln, was darauf hindeutet, dass GBM-Subtyp ist beeindurch seine Ursprungszelle 6,8,9 beeinflusst. Besser Astrozytom Modelle erforderlich sind, um die Rolle von spezifischen Kombinationen von Mutationen in bestimmten Zelltypen während Astrozytom Pathogenese definieren. Nutzt diese Modelle für effizientere präklinischen Arzneimittelentwicklung wird letztlich helfen, Patienten zu verbessern. Aktuelle Astrozytom Modelle zählen etablierte humane Zelllinien, Patienten abgeleitet Xenografts (PDX), gentechnisch veränderte normalen menschlichen Astrozyten und neuronalen Stammzellen (NSC), und gentechnisch veränderte Mäuse (GEM) 10-14. Wir entwickelten eine alternative, nicht-Keimbahn-GEM (Ngem) Modell 15 Nutzung von Primärgehirnzellen - kortikalen Astrozyten und NSC - von GEM beherbergen verschiedene Kombinationen von floxed onkogenen Allele geerntet. Das Ziel war, Astrozytom Modelle mit genetisch definierten Zellen, die phänotypisch sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt charakterisiert werden konnte und möglicherweise für die präklinische Entwicklung von Arzneimitteln in i erzeugenmmune kompetenten Mäusen.

Etablierten humanen Zelllinien sind die am häufigsten verwendete Modell der Pathogenese Astrozytom und Drogenantwort in vitro und in vivo. Sie sind technisch unkompliziert, überall verfügbar und wurden Kinetik und Tumorbildung bei orthotopen xenografting in immundefizienten Mäusen 10,11,16-18 definiert . Ihre Nachteile sind die Unfähigkeit, etablierte Zelllinien von Low-grade-Astrozytome erzeugen, die Begrenzung Studie nur auf High-Astrozytome; Mangels einer definierten Ursprungszelle; die Anwesenheit von komplexer genomischer Anomalien, häufig mit genomischen Profile, die sich deutlich von der ursprünglichen Patientenprobe unterscheiden; und die Anfälligkeit für phänotypische und genotypische Drift während Serienkultur in Serum 11,17,19-22. Die phänotypische Folgen der einzelnen onkogenen Mutationen in etablierten humanen Zelllinien können GBM durch die Vielzahl von Anomalien, die tatsächlich vorhanden sind, die oft entgegensteht eluc maskiert werdendierung der direkten Genotyp-Phänotyp-Folgen.

PDX durch subkutane Gang von Patienten isoliert Astrozytomzellen in immundefizienten Mäusen oder durch die Kultur als nichthaft Sphäroide in definierten, serumfreien Medium vor der orthotopen Injektion in das Gehirn von immundefizienten Mäusen 12,23 erzeugt. PDX genauer Aufrechterhaltung der genomischen Landschaft der menschlichen Astrozytomen, aber ähnlich etablierten humanen Zelllinien kann die phänotypische Wirkung einzelner onkogenen Mutationen aufgrund ihrer genomischen Komplexität 19,24 maskiert werden. Um die phänotypischen Auswirkungen von spezifischen Mutationen onkogenen insbesondere als Reaktion auf neue Therapien zu definieren, werden Platten aus etablierten humanen Zelllinien oder PDX häufig verwendet, um Genotyp-Phänotyp-Korrelationen zu etablieren, zeigen Generalisierbarkeit und die Wahrscheinlichkeit von Zelllinie spezifische Effekte zu minimieren. Während PDX genau rekapitulieren die histopathologische Kennzeichen der menschlichen Astrozytomen, incLuding Invasion orthotopen Xenografts von etablierten humanen Zelllinien in der Regel nicht 21,23,25. Zusätzlich normalen menschlichen Astrozyten und NSC wurden mit definierten onkogenen Mutationen gentechnisch zu Astrozytom Tumorgenese in vitro und in vivo 13,14,26 modellieren. Diesen Zellen fehlt die genomische Komplexität der etablierten humanen Zelllinien und PDX und Menschen Astrozytom Histopathologie genau rekapitulieren, erfordern aber xenografting in immundefizienten Nagern in vivo. Da alle menschlichen Zellmodelle erfordern immundefiziente Nager Hosts immunvermittelte Abstoßung von Xenotransplantaten zu verhindern, sind diese Modelle nicht den nativen Tumor-Stroma-Interaktionen einer syngenen System rekapitulieren und es fehlt ein intaktes Immunsystem Begrenzungs präklinischen Untersuchung von Stroma-bezogenen und immunmodulatorischen Therapien 10,11.

GEM Genehmigung Untersuchung der phänotypischen Folgen der vorgegebenen Kombinationen von onkogenen mutagen in vivo während der Tumorgenese in situ. Während nicht-bedingten GEM Mutationen in allen Geweben während der Entwicklung haben bedingten GEM onkogenen Allele, die Targeting von Mutationen durch Beschränkung Cre-vermittelte Rekombination an spezifische Zelltypen durch die Verwendung von zelltypspezifischen Promotoren 10,11,15,18 ermöglichen floxed. Bedingte Astrozytom GEM wurden verwendet, um die funktionelle Rolle von onkogenen Mutationen in verschiedenen Zelltypen in einer intakten Gehirn 11 zu erläutern. Das präklinische Nützlichkeit in situ gliomagenesis mit bedingtem GEM wird durch eine Anzahl von Faktoren, einschließlich 1) das Fehlen eines in vitro-Korrelat, 2) Schwierigkeiten bei der Erzeugung von großen Kohorten von Mäusen mit komplexen Genotypen, 3) mit langer Latenzzeit von in situ Tumorentwicklung limitiert , 4) und stochastische Tumorprogression. Da in situ Tumorentstehung fehlt eine entsprechende in-vitro-Modell, können Drogentests in vitro nicht w durchgeführt werdenit herkömmlichen bedingten GEM-Modelle. Im Gegensatz zu anderen Krebsarten, sind bedingte GEM-Modelle von Astrozytomen selten von einzelnen onkogenen Mutationen 11 induziert. So werden komplexe Systeme benötigt, um Zucht bedingte GEM mit mehreren onkogenen Mutationen zu erzeugen. Darüber hinaus tritt Astrozytom Initiierung mit variabler Penetranz nach einer langen Latenzzeit in diesen Modellen, während das Fortschreiten zu hohen Astrozytomen erfolgt in der Regel in einer nicht gleichmäßigen, stochastische Weise und führt zu Tumoren mit komplexen genomischen Landschaften und das schnelle Wachstum Kinetik 27 letztlich 28. Die variable Penetranz und stochastische Natur der malignen Progression in bedingten GEM Modelle erfordert, dass einzelne Mäuse durch Röntgenaufnahmen untersucht, um das Vorhandensein und die Lage von hochwertigen Astrozytome vor ihrer Einschreibung in präklinischen Studien nachzuweisen. Zusammengenommen sind diese Einschränkungen behindern die Erzeugung und Prüfung der großen Kohorten von bedingten GEM für PR erforderlicheClinical Drogentests.

Die RCAS-TVA GEM-System, das Vogelgrippe retroviralen (RCAS)-Vektoren verwendet, um GEM entwickelt, um die viralen Rezeptor (TVA) auf bestimmten neuronalen Zelltypen infizieren auszudrücken, wurde ausgiebig genutzt, um die Tumorgenese Astrozytom 11 zu modellieren. Im Gegensatz zu bedingten GEM, ermöglicht dieses Modell die Systemeinführung von mehreren onkogenen Mutationen in bestimmten Zelltypen ohne das Erfordernis für komplexe Systeme Zucht. Es wird jedoch durch variable Penetranz der Anforderung aktiv teilenden Zellen, die virale Integration zu erreichen, und die zufällige Insertion von Transgenen in das Wirtsgenom 29 begrenzt.

Nicht-Keimbahn-GEM (Ngem) Modelle, die Zellen von GEM geerntet zu nutzen, werden immer wichtiger, weil sie zu überwinden viele der Einschränkungen von anderen Modellsystemen 15. Die Rolle der Einleitung Zelltyp und Co-auftretende Mutationen in Astrozytom Pathogenese sind schwer davon abhaltenMine verwendet etablierten humanen Zelllinien oder GBM PDX, weil sie aus im Endstadium Tumoren, die umfangreichen genetischen Mutationen in undefinierten Zelltypen während des Verlaufs der malignen Progression angesammelt haben, abgeleitet. Im Gegensatz dazu können alle Sorten von Astrozytomen mit Ngem durch Induzieren definierten genetischen Mutationen in spezifischen gereinigten Gehirnzelltypen 11,30 modelliert werden. Somit kann der Einfluss der spezifischen genetischen Mutationen und Zelltyp auf zelluläre und molekulare Phänotypen in vitro und in vivo bestimmt werden. Ähnlich etablierten humanen GBM-Zelllinien, können erste in-vitro-Wirkstoffprüfung mit Ngem verwendet werden, um Medikamente für in vivo-Tests unter Verwendung der gleichen Zellen zu priorisieren. Tumorentstehung in vivo kann dann durch Allotransplantation Ngem Zellen orthotopisch in die Gehirne von immunkompetenten syngenen Wurf 30 bestimmt werden. Diese orthotopen Allograft-Modelle in-vivo-Tests nicht nur von konventionellen zytotoxischen eine Genehmigung dahernd zielgerichtete Therapien, aber immunmodulatorischen und Stroma-zielgerichtete Therapien auch. Schließlich kann die Rolle der Mikroumgebung auf Tumor Initiation und Progression durch den Vergleich der Ergebnisse zwischen Ngem und GEM herkömmlichen Modellen unter Verwendung der gleichen Mutationen in den gleichen Zelltypen bestimmt werden.

Wir und andere haben Astrozytom Ngem entwickelt unter Verwendung von primären Zellen - Astrozyten, NSC oder Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) - von GEM 30-34 geerntet. Der Grund für die Entwicklung von einem Astrozytom Ngem war es, ein Modell, um die phänotypischen Folgen von onkogenen Mutationen in spezifischen Zelltypen, die möglicherweise für präklinischen Tests in vitro und in vivo in immunkompetenten Tieren verwendet werden könnte, zu bestimmen, zu erstellen. Wir ernteten phänotypisch WT kortikalen Astrozyten und NSC aus Nicht-Cre exprimieren, bedingte GEM auf einem> 94% C57 / Bl6 Hintergrund mit floxed RB Weg gepflegt - Rb1 loxP / loxP oder TgGZT121 - und floxed RTK / RAS / PI3K-Weg - Nf1 loxP / loxP, Kras G12D, Pten loxP / loxP - Gene in verschiedenen Kombinationen 35-39. Wir induzierte genetische Rekombination in vitro unter Verwendung von adenoviralen Vektoren, die Cre-Rekombinase codiert. Da kortikalen Astrozyten Ernten ein Gemisch von Zelltypen, verwendeten wir Ad5GFAPCre Vektoren oder dominant onkogenen Transgene, wie TgGZT 121 von der menschlichen GFAP-Promotor angetrieben wird, um für GFAP + kortikalen Astrozyten in diesen Kulturen zu bereichern. Wir definierten die phänotypischen Auswirkungen der G 1 / S (Rb), MAPK und PI3K Mutationen in kortikalen Astrozyten und NSC in vitro und in vivo. MAPK und PI3K-Weg-Aktiv G1 / S-defekt Astrozyten molekular nachgeahmten menschlichen proneurale GBM und auf orthotope Injektion gebildet Tumoren in einer vordefinierten Stelle mit einheitlichen Wachstumskinetik, kurze Latenzzeiten und der histopathologischenal Markenzeichen der menschlichen GBM 30. Längs Überwachung von Tumorwachstum in vivo unterstützt präklinischen Drogentests durch Normalisierung der Behandlung Kohorten und quantitative Analyse von Tumorwachstum in Reaktion auf die Behandlung 40. Wir bestimmten Tumorwachstum Kinetik durch Längs Biolumineszenz-Bildgebung von Mäusen mit Luciferase kortikalen Astrozyten injiziert. Daher kortikalen Astrozyten und NSC aus bedingtem GEM abgeleitet eine gefügig Modellsystem für die Definition der funktionellen Konsequenzen Astrozytom-assoziierte Mutationen und einem potenziellen Modellsystem für die präklinische Wirkstoffentwicklung.

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Protokoll

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Alle Tierversuche wurden von der Universität von North Carolina Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.

1. Die Züchtung kortikale Astrozyten von neugeborenen Mäusen

  1. Vorbereitung
    1. Zerknittern 2-3 heikle Aufgabe Gewebe aufnehmen und in den Boden eines Kolbens gegeben, enthaltend 70% Ethanol. Zeigen Dissektionsscheren, gebogenen Pinzette und 2 Paar gerade Mikropinzette in diesen Kolben. Die Gewebe werden verwendet, um zu vermeiden, das Biegen der Mikropinzette.
    2. 1 ml HBSS auf eine 60 mm-Gewebekulturschale. Bereiten Sie eine separate Schüssel für jedes Tier und pflegen Gerichte auf Eis.
    3. Betäuben Tiere pro institutionelle Regelungen.
    4. Warm 7 ml DMEM mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin (komplettem DMEM) für jedes Tier in einem 37 ° C Wasserbad. HINWEIS: Für 5 Mäuse, die Schritte 1.1.1-1.1.4 dauert ~ 15 min.
  2. Gewebe Ernte
    1. Opfern neonatalen Maus (Tag 1-3) pro Institutionalen Vorschriften.
    2. Entfernen Dissektionsscheren aus Ethanol, damit sie abtropfen, und machen einen sagittalen Schnitt in der Haut über dem Schädel aus dem Rückenmark in die Nase.
    3. Einen Schnitt im Schädel entlang der Pfeilnaht ausgehend von dem Rückenmark und an den Riechkolben erstreckt. Achten Sie darauf, die Scherenspitzen in der Nähe der Innenfläche des Schädels zu halten, um Hirngewebe Schaden zu minimieren.
    4. Verwendung einer gebogenen Pinzette vorsichtig abziehen jeder Hemisphäre des Schädels seitlich vom Gehirn.
    5. Verwendung von geraden Mikro Pinzette vorsichtig entfernt kneifen die dorsale Teil jeder kortikalen Hemisphäre und legen Sie sie in die Gewebekulturschale enthält HBSS. Achten Sie darauf, das Kleinhirn und Riechkolben zu vermeiden. Nehmen Sie keine Gewebe unterhalb des Corpus callosum.
    6. Mit einem Binokular und 2 Paar Mikropinzette, entfernen Sie vorsichtig die Hirnhäute von jeder kortikalen Hemisphäre. Liefert die Gewebekulturschale zu Eis bis Anfang Gewebe homogenization.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1 bis 1.2.6 für jedes zusätzliche Tier. HINWEIS: Für 5 Mäuse, die Schritte 1.2.1-1.2.7 dauert ~ 30 min.
  3. Gewebehomogenisierung
    1. Mit einem sauberen Rasierklinge fein würfeln kortikalen Hemisphären und bewegen Sie die Platte an einer Gewebekultur Kapuze.
    2. Übertragen Sie die gewürfelte Gewebe in einem sterilen 15 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die Platte mit 1 ml eiskaltem HBSS und Transfer zum Rohrgewebe enthalten.
    3. Warten Sie, bis Gewebe setzt sich am Boden der Röhre, dann vorsichtig überschüssige HBSS mit einer Pipette.
    4. 2 ml Raumtemperatur Trypsin / EDTA. Pipette ~ 10x mit einer 1 ml Pipette weiter distanzieren Zellen.
    5. Inkubieren der Zellsuspension bei 37 ° C für 15 - 20 min. Sorgfältig durch Umdrehen mischen alle 5 min.
    6. 3 ml komplettem DMEM Trypsin zu hemmen. Pipette ~ 10x mit einer 1 ml-Pipette, um die Lösung zu mischen.
    7. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
    8. Entfernender Überstand wurde mit einer 1 ml Pipette. Sie saugen das Medium nicht, weil das Pellet kann locker sein.
    9. Das Pellet in 4 ml 37 ° C DMEM abzuschließen. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 75 cm Schraubverschluss Zellkulturflasche. HINWEIS: Für 5 Mäuse, die Schritte 1.3.1-1.3.9 dauert ~ 50 min.
    10. Etwa 16 Stunden nach der Ernte Astrozyten, waschen Sie die Kolben mit 4 ml 37 ° C HBSS, dann 4 ml 37 ° C DMEM abzuschließen. Pflegen Sie die kortikale Astrozyten bei 37 ° C in 5% CO 2. HINWEIS: Der Reinigungsschritt ist wichtig für die Entfernung von nicht-adhärenten Zellen und Zelltrümmer aus dem Kulturschale.
    11. Wenn die Kultur ist ~ 95% konfluent, schütteln über Nacht bei 37 ° C in 5% CO 2, entfernen Sie die Medien mit den abgelösten Zellen, dann die Kolben mit 4 ml 37 ° C HBSS waschen. 4 ml von 37 ° C auf 37 ° C zu vervollständigen und zu halten DMEM Zellen in 5% CO 2. Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, um Kulturen für kortikale Astrozyten zu bereichern, wie gefährdend Mikroglia undOligodendrozyten-Vorläuferzellen zu trennen, und mit diesem Verfahren aus der Kultur 41 entfernt.
    12. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1-1.3.11 für jedes Tier.
  4. Induktion der genetische Rekombination
    1. 24 Stunden nach Abschluss von Schritt 1.3.11, ersetzen Sie das Medium mit 2 ml 37 ° C DMEM abzuschließen. 1 ml 37 ° C SCM mit 1 ul> 10 10 pfu / ml Ad5CMVCre oder Ad5GFAPCre. Inkubation für 6 Stunden bei 32 ° C in 5% CO 2 .CAUTION: Verwenden BSL2- Sicherheitsvorkehrungen beim Umgang mit rekombinanten Adenovirus.
    2. Entfernen Sie den Virus enthaltenden Medien und fügen 37 ° C komplett DMEM ohne Virus zu den kortikalen Astrozyten. ACHTUNG: Verwenden Sie BSL2- Sicherheitsvorkehrungen beim Umgang mit rekombinanten Adenoviren und entsorgen Sie die virushaltige Medien pro institutionelle Regelungen. HINWEIS: Für 5 Astrozytenkulturen Schritte 1.4.1 - 1.4.3 dauert ~ 15 min mit Ausnahme des 6-stündigen Inkubation.
    3. Erweitern kortikalen Astrozyten Kulturen invitro und in-vivo-Charakterisierung. HINWEIS: Bestimmen Sie die Anwesenheit von Mutationen nach Cre-Rekombination durch PCR mit spezifischen Gen für die rekombiniert oder durch Immunoblots entweder für die spezifische mutierte Protein oder seine Signal Folgen Primer. Die phänotypische Stabilisierung kortikalen Astrocytenkulturen nach Cre-Rekombination benötigte Zeit hängt von den verwendeten Mutationen sein und muss empirisch (Figur 2) bestimmt werden.

2. Kultivierung Neuronale Stammzellen aus neugeborenen Mäusen

  1. Vorbereitung
    1. Vor dem Start der Präparation herzustellen 4 ml Aufschlußlösung pro Gehirn durch Zugabe von 3,1 mg Papain und 1,3 mg Cystein zu 4 ml Dissoziation Medium - 98 mM Na 2 SO 4, 30 mM K 2 SO 4, 5,8 mM MgCl 2, 0,25 mM CaCl 2 , 1 mM HEPES (von 1 M HEPES pH 7,4 Lager) 20 mM Glukose, 0,001% Phenol rot, und 0,125 mM NaOH. Zugabe von Papainund Cystein der Dissoziation Medium wird die Lösung gelb.
    2. Inkubieren bei 37 ° C Wasserbad für 15 min. Regelmäßig mischen durch Umdrehen.
    3. Mit 0,1 M NaOH tropfenweise, bis die Verdauung wieder in Lösung rot leuchten.
    4. In einem Gewebekulturabzug, Sterilfilter der Aufschlußlösung mit einem Spritzenfilter (0,22 um Porengrße). Halten Sie die Aufschlusslösung auf Eis.
    5. Vorbereitung 50 ml Stammzellmedium (SCM) durch Mischen von 44,5 ml NSC Basal Medium, 5 ml NSC ergänzen, 0,5 ml Penicillin-Streptomycin, 50 ul 0,2% Heparin, 10 ul 100 ug / ml EGF und 10 ul 100 ug / ml bFGF. SCM für 1 Woche stabil, wenn bei 4 ° C gelagert.
    6. Vorbereitung abgeschlossen HBSS (cHBSS) durch Mischen von 50 ml 10x HBSS, 1,25 ml 1 M HEPES (pH 7,4), 15 ml 1 M D-Glucose, 5 ml 100 mM CaCl 2, 5 ml 100 mM MgSO 4, 2 ml 1 M NaHCO 3. Bringen des Gesamtvolumens auf 500 ml mit ddH 2 O.
    7. Filter sterilisieren cHBSS Witzha 0,2 um Porengröße Filter und bei 4 ° C.
    8. Zerknittern 2-3 heikle Aufgabe Gewebe aufnehmen und in den Boden eines Kolbens gegeben, enthaltend 70% Ethanol. Zeigen Dissektionsscheren, gebogenen Pinzette, und 2 Paar gerade Mikropinzette in diesen Kolben. Die Gewebe werden verwendet, um zu vermeiden, das Biegen der Mikropinzette. HINWEIS: Für 5 Mäuse, die Schritte 2.1.1-2.1.8 dauert ~ 45 min.
  2. Gewebe Ernte
    1. Opfern Neugeborenen (Tag 1-3) Mäuse pro institutionelle Regelungen.
    2. Entfernen Dissektionsscheren aus dem 70% Ethanol, damit sie abtropfen, und machen einen sagittalen Schnitt in der Haut über dem Schädel aus dem Rückenmark in die Nase.
    3. Einen Schnitt im Schädel entlang der Pfeilnaht ausgehend von dem Rückenmark und an den Riechkolben erstreckt. Achten Sie darauf, die Scherenspitzen in der Nähe der Innenfläche des Schädels zu halten, um Hirngewebe Schaden zu minimieren.
    4. Verwendung einer gebogenen Pinzette, löst sanft jeder Hemisphäre des Schädels seitlich vomGehirn.
    5. Entfernen Sie vorsichtig das gesamte Gehirn und in eiskaltem cHBSS.
    6. Mit Hilfe eines Dissektionsmikroskop, entfernen Sie vorsichtig Hirnhäute aus dem Gehirn mit feinen Sezierung Werkzeuge.
    7. Legen Sie das Gehirn auf seiner Bodenfläche und entfernen Kleinhirn / Hinterhirn und Riechkolben / frontalen Kortex mit vertikalen (koronalen) schneidet mit einer Größe 11 Skalpell.
    8. Drehen die verbleibende Gehirn um 90 °, um es auf dem Schwanzabschnitt zu platzieren, sodass eine koronare Ansicht des Gehirns. Suchen Sie die lateralen Ventrikel.
    9. Schneiden Sie ein würfelförmigen Abschnitt, der die Subventrikularzone (SVZ).
    10. Übertragen SVZ haltigen Gewebe bis zu einer 60-mm-Gewebekulturschale mit frischem eiskaltem cHBSS und Hackfleisch Gewebe mit Größe 11 Skalpell.
    11. Übertragen Sie die zerkleinerte Gewebe in eine sterile 15-ml-Tube. Das Röhrchen auf Eis.
    12. Waschen Sie die Petrischale mit 1-2 ml eiskaltem cHBSS. Übertragen Sie die Waschlösung in das Röhrchen Gewebe enthält.
    13. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1-2.2.12 mit zusätzlichen neonatal Mäusen, falls erforderlich. Übertragen Sie alle 15-ml-Röhrchen zu einer Gewebekultur Haube für den Rest des Protokolls. HINWEIS: Für 5 Mäuse, die Schritte 2.2.1 - 2.2.13 dauert ~ 45 min.
  3. Gewebehomogenisierung
    1. Legen Sie die Aufschlusslösung (in Schritt 2.1.1 vorbereitet) in einem 37 ° C Wasserbad für 5 min. Auch, warm 2 ml pro SCM Gehirn in einem 37 ° C Wasserbad.
    2. Den Überstand des zerkleinerten Gewebes entfernen Sie vorsichtig mit einer 1 ml Pipette. Aspirieren nicht.
    3. 2 ml 37 ° C Aufschlusslösung pro 15 ml Tube und vorsichtig mischen durch Umdrehen.
    4. Inkubieren bei 37 ° C Wasserbad für 15 min. Mischen durch Umdrehen alle 5 min.
    5. Fügen Sie eine weitere 2 ml 37 ° C Aufschlusslösung in jedes Röhrchen und wiederholen Sie Schritt 2.3.4.
    6. Lassen Sie die Zellen auf den Boden des Röhrchens durch die Schwerkraft zu regeln, dann entfernen Sie den Überstand aus verdauten Gewebe unter Verwendung einer 1 ml Pipette.
    7. 2 ml 10 uM E-64 in cHBSS verdünnt und vorsichtig mischen durch Umdrehen.
    8. Inkubieren für 3 min bei Raumtemperatur.
    9. Lassen Sie die Zellen auf den Boden des Röhrchens durch die Schwerkraft zu regeln, dann entfernen Sie den Überstand aus verdauten Gewebe.
    10. 1 ml 37 ° C cHBSS und homogenisieren mit einer 1 ml-Pipettenspitze (~ 20 Schläge). Vermeiden Sie Luftblasen beim Injizieren Gewebehomogenisierung.
    11. Übergeben Sie die Gewebehomogenat durch ein 40 um Porengröße Zelle Sieb, dann spülen Sie das Sieb mit 5 ml 37 ° C cHBSS.
    12. Zentrifugieren Gewebehomogenat bei 125 × g für 5 min.
    13. Entfernen Sie 95% der Überstand mit einer 1 ml Pipette ohne das Zellpellet zu stören. Sorgfältig resuspendieren Zellpellet in 200 ul 37 ° C SCM mit einer 200 ul Pipettenspitze.
    14. Fügen Sie 1,8 ml 37 ° C SCM und übertragen die Zellsuspension auf eine Vertiefung einer sterilen 6-Well-Platte. HINWEIS: Für 5 Mäuse, die Schritte 2.3.1-2.3.14 dauert ~ 75 min.
  4. Neural Stem Cell Culture
    1. Wieder aufzufüllen das Medium nach 3 Tagen durch Zugabe noch 2 ml 37 °C SCM.
    2. Nach 7 Tagen, übertragen Sie die Neurosphären zu einem 15-ml-Tube und lassen Sie die Neurosphären nieder durch die Schwerkraft> 5 min.
    3. Entfernen Sie den Überstand und 2 ml 37 ° C SCM.
    4. Übertragen Sie die Neurosphären zu einer neuen Vertiefung einer 6-Well-Platte.
    5. 2 ml 37 ° C SCM alle 3-4 Tage, und ändern Medium vollständig alle 7 Tage.
    6. Wenn Neurosphären sind> 100 um Durchmesser, sorgfältig distanzieren mit Stamm Zelldissoziationslösung und Ausstrich das NSC bei der gewünschten Zelldichte.
  5. Induktion der genetische Rekombination
    1. 1 ml 37 ° C SCM mit 1 ul> 10 10 pfu / ml Ad5CMVCre oder Ad5GFAPCre zu dem 2 ml SCM aktuell den Zellen. ACHTUNG: Verwenden Sie BSL2- Sicherheitsvorkehrungen beim Umgang mit rekombinanten Adenovirus.
    2. Inkubation für 6 h bei 32 ° C in 5% CO 2.
    3. Übertragen SCM mit Neurosphären in einen 15-ml-Tube und lassen Kugeln nieder durch die Schwerkraft für 5 min.
    4. Entfernen des Überstandes zunächst mit einer 1 ml Pipette, dann mit einer 200 ul-Pipette. ACHTUNG: Verwenden Sie BSL2- Sicherheitsvorkehrungen beim Umgang mit rekombinanten Adenoviren und entsorgen Sie die virushaltige Medien pro institutionelle Regelungen.
    5. 2 ml 37 ° C SCM ohne Virus an die NSC, dann übertragen auf eine 6-Well-Platte. HINWEIS: Für 5 NSC Kulturen, die Schritte 2.5.1-2.5.5 dauert ~ 15 min mit Ausnahme des 6-stündigen Inkubation.
    6. Am nächsten Tag, wiederholen Sie die Schritte 2.5.1-2.5.5, gefolgt von Neurosphäre Passagieren, wenn notwendig. Die Kugeln können nun für 2-3 Passagen vor In-vitro-Charakterisierung und orthotope Injektion in Mäusegehirnen in vivo erweitert werden. HINWEIS: Bestimmen Sie die Anwesenheit von Mutationen nach Cre-Rekombination durch PCR mit spezifischen Gen für die rekombiniert oder durch Immunoblots entweder für die spezifische mutierte Protein oder seine Signal Folgen Primer. Die phänotypische Stabilisierung der NSC Kulturen nach Cre-Rekombination benötigte Zeit hängt seinvon den verwendeten Mutationen und muß empirisch ermittelt werden (2 und 3).

3. Orthotope Injektion von Zellen Rekombinierte in das Gehirn des Empfängers Iimmunocompetent Mäuse

  1. Herstellung von 5% Methylcellulose
    1. Man löst 5 g 15 cPs Methylcellulose in vollentsalztem Wasser auf ein Endvolumen von 50 ml in einem 100-ml-Flasche mit Schraubverschluss. Das Pulver langsam unter Rühren bei 4 ° C, um ein Verklumpen zu verhindern. Es kann bis zu 24 Stunden Rühren bei 4 ° C für alle Methylcelluloselösung zu treten, zu berücksichtigen.
    2. Wiegen Sie die Flasche und das Gewicht aufgezeichnet.
    3. Autoklavieren von 5% Methylcellulose-Lösung. Sobald autoklaviert wird die Methylcellulose ein halbfestes Gel geworden.
    4. Wiegen Sie die Flasche und berechnen das Gewicht beim Autoklavieren verloren.
    5. Aseptisch 1 ml sterilem Wasser für jedes Gramm Gewicht verloren.
    6. Auf Eis und 50 ml eiskaltem 2x DMEM.
    7. Mischungs über Nacht mit einem Magnetrührer wurden bei 4 ° C ist. Sterile Technik, um die 5% Methylcellulose-Lösung in 20 ml Aliquots aufteilen. Shop Aliquots bei 4 ° C für bis zu sechs Monaten oder bis die 2x DMEM abläuft. HINWEIS: Herstellung von 5% Methylcelluloselösung in Schritten 3.1.1-3.1.7 wurden, 2,5 Tage in Anspruch nehmen ~.
  2. Vorbereitung der kortikalen Astrozyten zur Injektion
    1. Ernte kortikalen Astrozyten bei ~ 90% konfluent.
    2. Zu ernten, absaugen kompletten DMEM und Waschplatten mit dem gleichen Volumen von 37 ° C HBSS.
    3. Fügen Sie genug Trypsin, um die Platte zu bedecken. Vorsichtig kippen und tippen Sie auf die Platte, bis die Zellen beginnen zu lösen.
    4. Trypsin zu inaktivieren, mit einem gleichen Volumen von 37 ° C DMEM abzuschließen.
    5. Übertragungszellen zu einem 50 ml konischen Röhrchen und Waschen der Platte mit dem gleichen Volumen von 37 ° C in vollständigem DMEM 3.2.4 verwendet.
    6. Übertragen Waschmedium in das Röhrchen enthaltenden Zellen. Zentrifuge bei 200 xg für 3 min.
    7. Absaugen supernatant und Zellen in 1 ml 37 ° C zu vervollständigen DMEM.
    8. Zählen Sie die Zellsuspension mit einer Zählkammer oder einem anderen geeigneten Zellzähler, um zu bestimmen Anzahl von Zellen / ul.
    9. Übertragen der gewünschten Anzahl von Zellen in ein neues 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifuge bei 200 xg für 3 min.
    10. Die Zellen in 800 ul von 37 ° C zu vervollständigen DMEM. Bestimmen Sie das Volumen des Zellpellets (Gesamtvolumen der Zellsuspension - 800 ul). HINWEIS: Es ist wichtig, um eine genaue Zellkonzentration für die Injektion zu erzielen. Daher muß das Volumen des Zellpellets in diesem Schritt um das Volumen von 5% Methylcellulose zu berechnen, den Schritt 3.2.12 hinzuzufügen bestimmt werden.
    11. Übertragen Zellen in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und dann bei 200 xg zentrifugieren für 3 min.
    12. Absaugen Überstand aus dem Zellpellet resuspendieren und kortikalen Astrozyten in dem entsprechenden Volumen eiskalter 5% Methylcellulose (gewünschte Volumen - Volumendas Zellpellet), um die gewünschte Anzahl von Zellen / ul zu erhalten.
    13. Zellen auf Eis legen, bis der Injektion.
    14. Legen Sie eine 250 ul Glasspritze in einem wiederholenden Antigen Spender dann einen stumpfen 18 G Nadel auf die Spritze.
    15. Ziehen Sie den Kolben langsam mit der Nadel in den kortikalen Astrozyten Suspension; Es wird eine Luftblase über den Zellen, die entfernt werden müssen, da Luftblasen komprimiert und vermindern die tatsächlich in das Gehirn eingespritzte Volumen.
    16. Halten Sie die Spitze der Nadel knapp über dem kortikalen Astrozyten Federung und drücken Sie den Kolben in schnell. Die Luftblase wird schneller sein als der Zellsuspension bewegen und wird meist ausgeschlossen werden.
    17. Wiederholen Sie Schritt 3.2.16, bis alle Luftblasen von der Nadel entfernt.
    18. Füllen Sie die Spritze auf etwa ~ 200 ul, dann halten Sie die Nadel und ziehen Sie den Kolben bis zum Anschlag. Kleine Luftblasen kann durch Halten der Nadelspitze und schnelles Drücken der Kolben in etwa 5 entfernt werden0 ul dann langsam zieh die volle Kapazität.
    19. Halten Sie die Spitze aufrecht und wiederholen Sie Schritt 3.2.18 4-5x.
    20. Entsorgen Sie die 18-Gauge-Nadel und passen eine 27 G-Nadel auf die Spritze.
    21. Drücken Sie die Taste auf dem Antigen Spender, bis die Flüssigkeit aus der Nadel ausgestoßen. HINWEIS: Für 1 Astrozyten-Zelllinie, die Schritte 3.2.1-3.2.21 dauert ~ 60 min.
  3. Vorbereitung der NSC zur Injektion
    1. Wenn Neurosphären sind> 100 um im Durchmesser, Transfer zum 15-ml-Röhrchen und lassen Sie die Neurosphären nieder durch die Schwerkraft> 5 min.
    2. Entfernen des Überstandes und distanzieren die Neurosphären mit einer leichten Dissoziation Reagens, wie Stammzellen Dissoziation Lösung oder Accutase nach den Anweisungen des Herstellers oder mit 0,05% Trypsin-EDTA, wie beschrieben 42.
    3. Hemmen die Dissoziation Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers, ohne den NSC zu Serum. Zentrifuge bei 100 × g für 5 min.
    4. Überstand wird abgesaugt, und Resuspendieren der Zellen in 1 ml 37 ° C cHBSS um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen.
    5. Zähle die Zellen mit einer Zählkammer oder einem anderen geeigneten Zellzähler, um die Anzahl der Zellen / ul zu bestimmen.
    6. Übertragen der gewünschten Anzahl von NSC in eine neue 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifuge bei 100 × g für 5 min.
    7. Die Zellen in 800 ul von 37 ° C HBSS. Bestimmen Sie das Volumen des Zellpellets (Gesamtvolumen der Zellsuspension - 800 ul). HINWEIS: Es ist wichtig, um eine genaue Zellkonzentration für die Injektion zu erzielen. Daher muß das Volumen des Zellpellets in diesem Schritt um das Volumen von 5% Methylcellulose Berechnung in Schritt 3.3.9 hinzuzufügen bestimmt werden.
    8. Übertragen der Zellen in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und dann bei 100 xg für 5 Minuten zentrifugiert werden.
    9. Saugen Sie den Überstand und beenden die Vorbereitung der Zellen für die orthotope Injektion als in 3.2.12-3.2.21. HINWEIS: Für 1 NSC-Zelllinie, die Schritte 3.3.1-3.3.9 dauert ~ 60 min.
  4. Vorbereitung der Maus zur Injektion
    1. Betäuben Empfängertier über eine IP-Injektion von 250 mg / kg Avertin (2,2,2 Tribromethanol) oder 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Xylazin pro institutionellen IACUC Richtlinien. HINWEIS: Verwendetes hier sind Mäuse in 3-6 Monaten als Allograft Gastgeber. Mäuse in verschiedenen Altersstufen können verwendet werden, um die Auswirkungen der Mikroumgebungsentwicklungs Gehirn Alter auf die Tumorentstehung zu untersuchen.
    2. Rasur der Kopfhaut über der Einschnittstelle mit Klipper oder einer Schere.
    3. Sterilisieren der chirurgischen Stelle mit 3 abwechselnden Tupfer aus 70% Ethanol und Betadin.
    4. Bewerben Augensalbe für die Augen, um Schäden durch den Verlust von Blinkreflex verhindern.
    5. Beurteilen Narkosetiefe durch Pedal Rücktritt (toe Prise) Reflex. HINWEIS: Für 5 Mäuse, die Schritte 3.4.1-3.4.5 dauert ~ 15 min.
  5. Orthotopen Implantation
    1. Sichern Sie das Tier in der stereotaktischen Rahmen.
    2. MakE einen Schnitt über die Pfeilnaht ca. 0,5 cm lang zwischen den Ohren und Augen.
    3. Suchen Sie den Schnittpunkt der koronalen und sagittalen Nähten (Bregma), sowie den Schnittpunkt der Lambda und sagittalen Nähten (Lambda). Sicherzustellen, dass Bregma und Lambda sind in der gleichen horizontalen Ebene.
    4. Befestigen Sie die Spritze mit der Zellsuspension und Wiederholen Antigen Spender an der stereotaktischen Rahmen über den Kopf. Bringen Sie die Spitze des 27 G-Nadel in Kontakt mit Bregma. Dies ist der Ursprung, die für die Manipulation von dreidimensionalen Koordinaten verwendet wird.
    5. Heben Sie die Nadel etwas abseits der Schädeloberfläche und bewegen 2 mm und 1 mm Seiten rostral von Bregma.
    6. Senken Sie die Nadel vorsichtig durch den Schädel an seinen Bestimmungsort zu 4 mm ventralen von Bregma. HINWEIS: Wir verwendeten diese stereotaktischen Koordinaten, um die Basalganglien Ziel. Verschiedenen stereotaktischen Koordinaten verwendet werden, um die Auswirkungen der verschiedenen Mikroumgebung zu untersuchenHirnregionen auf der Tumorgenese.
    7. Injizieren 5 ul der Zellsuspension durch die Aktivierung des sich wiederholenden Antigen Spender einmal. Lassen Sie die Nadel in Platz für 2 min, damit Hirndruck ins Gleichgewicht.
    8. Ziehen Sie die Nadel über einen Zeitraum von 30 Sekunden langsamer. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um Druck auf jede Blutung, die auftreten können gelten.
    9. Nähern die Wundränder und schließen Sie den Schnitt mit Gewebekleber. Verwaltung 20 ul Lidocain subkutan an der Einschnittstelle. HINWEIS: Für 5 Mäuse, die Schritte 3.5.1-3.5.9 dauert ~ 50 min. Der UNC-IACUC genehmigt die postoperative Verwendung von nur Lokalanästhesie. Absprache mit lokalen institutionellen IACUC wird hinsichtlich der Anforderungen für die postoperative Analgesie nach dieser Prozedur empfohlen.
  6. Post-OP-Pflege
    1. Legen Sie die Tiere in einer sauberen, warmen Käfig zu erholen. Die Tiere sollten nicht direkt in Betten aufgestellt werden, als zufällig Aspiration auftreten.
    2. Beachten Sie dieTiere für die Wiederaufnahme des normalen Verhaltens wie Pflege, Essen und Stuhlgang. HINWEIS: Wiederaufnahme der normalen Verhalten kann ~ 60 min dauern.

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Ergebnisse

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Wir entwickelten ein Modellsystem mit Ngem kortikalen Astrozyten und NSC von Neugeborenen GEM Beherbergung geerntet floxed bedingten onkogenen Allele, die phänotypisch in vitro und in vivo charakterisiert werden können (Abbildung 1). Um die Folgen von onkogenen Mutationen insbesondere in kortikalen Astrozyten in vitro zu untersuchen, ist es wichtig, zunächst anreichern Astrozyten. Kortikalen Astrozyten Ernten enthalten eine Mischung von Mikrogliazellen, Astrozyten, Oligodendro...

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Diskussion

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Die wichtigsten Maßnahmen zur Gewährleistung der Ernte und Kultur der kortikalen Astrozyten 1) sicherzustellen, um den Kortex ohne Gewebe unterhalb des Balkens herauszuschneiden, 2), um die Hirnhaut zu entfernen, 3) vollständig zu dissoziieren, die Zellen, und 4), die für GFAP bereichern + Astrozyten. Obwohl wir verwendet mechanische (Zittern) und genetische (Einschränkung der genetischen Rekombination mit einem Ad5GFAPCre Vektor oder Nutzung einer beherrschenden Transformation Transgen (TgGZT 121)

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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CRM ist ein klinischer Prüfarzt von Damon Runyon-Genentech. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse an CRM von der Damon Runyon Cancer Research Foundation (CI-45-09), dem Verteidigungsministerium (W81XWH-09-2-0042) und dem University of North Carolina University Cancer Research Fund (UCRF) unterstützt. Die Autoren danken Daniel Roth für die Unterstützung bei der Mäusezucht. Die Autoren danken auch Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette und Susannah Krom für die Unterstützung bei der Gewebekultur und Immunfluoreszenz.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Invitrogen11995065DMEM kann auch von anderen Anbietern erworben werden, einschließlich GIBCOSigma und Cellgro
Fetal Bovine Serum, RegularCellgro35-010-CV
Penicillin-StreptomycinInvitrogen15140122
scharfspitze PräparierschereFisher Scientific08-395
Knorpel Daumenzange, gebogenFisher Scientific1631
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Pinzette, fein, 4Miltex17-301
Ethanol (200 Proof)Decon Labs2710
RasierklingenVWR55411-050
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), flüssigInvitrogen14175-095
TrypLE Express (1x), PhenolrotInvitrogen12605-010Andere Trypsin-Lösungen sind auch für kortikale Astrozyten und Kulturen geeignet
Kulturschale, 60 x 15 mmThomas Scientific9380H77
15 ml RöhrchenBD Biosciences352096
50 ml RöhrchenBD Biosciences352070
Adenovirus-StammGentransfer Vector Core, U. IowaAd5CMVCreLager in 5 & Mikro; l aliquote bei -80 °C. Gefährlich. Verwenden Sie die Sicherheitsvorkehrungen für Bsl2
Natriumsulfat (Na2SO4) Sigma-Aldrich238597
Kaliumsulfat (K2SO4)Sigma-Aldrich221325
Magnesiumchlorid (MgCl2)Sigma-AldrichM8266
Calciumchlorid (CaCl2)Sigma-Aldrich746495
HEPES KaliumsalzSigma-AldrichH0527
D-(+)- GlukoseSigma-AldrichG8270 
PhenolrotSigma-AldrichP3532
Natriumhydroxid (NaOH)Sigma-AldrichS5881
PapainWorthingtonLS003127
L-Cystein-HClSigma-AldrichC1276
Spritzenvorsatzfilter (0,22 &Mikro; m Porengröße)MilliporeSLGP033NS
Neurocult Proliferationskit, MausStemcell Technologies5702Dieses Kit enthält das NeuroCult NSC Basalmedium und das NeuroCult NSC-Supplement, das für die NSC-Kultur benötigt
wird 0,2% HeparinlösungStemcell Technologies7980
EGF InvitrogenPMG8041
bFGF InvitrogenPHG0261
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10x)Invitrogen14185-052
Magnesiumsulfat (MgSO4)Sigma-AldrichM7506
Natriumbicarbonat (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
E-64Sigma-AldrichE313210 mM auf Lager DMSO, lagern bei -20 Grad; C
6-Well-PlattenFisher Scientific07-200-83
Zellsieb (40 & Mikro; m Porengröße)Corning352340
Stammzell-DissoziationslösungStemcell Technologies5707Alternativ können Sie schonende Enzymlösungen wie Accutase
Methylcellulose 15cP Sigma-AldrichM7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2xMilliporeSLM-202-Bverwenden Zur Herstellung von 5%iger Methylcelluloselösung
1,7 ml Snap Cap MikrozentrifugenröhrchenCorning3620
Hamilton Spritze, 250 & Mikro; l LT ohne NadelFisher Scientific14-815-92
PB600-1 Antigen-DispenserHamiltonnbsp; 83700
Einwegnadeln 18 GFisher ScientificNC9015638
27 ga 1/2" Luer-SpitzennadelFisher Scientific14-826-48
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)Sigma-AldrichT48402
BetadineFisher ScientificNC9386574
Puralube AugensalbeFisher Scientific
Modell 900 Stereotaktischer RahmenKopf Instruments
VETBONDFisher ScientificNC9259532 Klebstoff für Gewebe 
Lidocain ShopMedVetRXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)PromegaG3580
Anti-SOX2MilliporeAB5603
Polyklonales Kaninchen Anti-Gliafibrilläres saures Protein (GFAP)DakoZ0334 
IVIS KineticPerkinElmerFür in vivo Bildgebung
D-Luciferin - K+ Salz BiolumineszenzsubstratPerkinElmer122796Für in vivo Biolumineszenz-Bildgebung
EdU Imaging KitInvitrogenC10340
MSCV Luciferase PGK-hygroAddgene18782
&NC9689910

Referenzen

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