Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.
اكتشاف العلامات البيولوجية رواية يلعب دورا حاسما في توفير أكثر حساسية ومحددة كشف المرض. للأسف كثير من المؤشرات الحيوية منخفضة الوفرة التي توجد في السوائل البيولوجية لا يمكن الكشف عنها بسهولة مع مطياف الكتلة أو المناعية لأنها موجودة في تركيز منخفض جدا، هي عطوب، وغالبا ما يخفيها وفرة البروتينات عالية مثل الألبومين أو المناعي. الطعم تحتوي على بولي (N-isopropylacrylamide) (NIPAm) النانوية استنادا قادرة على التغلب على هذه الحواجز الفسيولوجية. في خطوة واحدة أنها قادرة على التقاط، والتركيز والحفاظ على المؤشرات الحيوية من سوائل الجسم. منخفضة الوزن الجزيئي التحاليل تدخل جوهر جسيمات متناهية الصغر وأسرت من قبل مختلف الأصباغ الكيميائية العضوية، والتي تكون بمثابة الطعم تقارب عالية البروتين. النانوية قادرة على تركيز البروتينات من الاهتمام من قبل عدة أوامر من حجمها. هذا العامل هو تركيز كاف لزيادة مستوى البروتين مثل أن البروتينات هي ضمنحد الكشف من الطيف الحالية الكتلة، النشاف الغربي، والمناعية. يمكن تحضين النانوية مع مجموعة كبيرة من السوائل البيولوجية وأنها قادرة على تخصيب كثيرا من تركيز البروتينات منخفضة الوزن الجزيئي والببتيدات مع استبعاد الزلال وغيرها من البروتينات عالية الوزن الجزيئي. تظهر بياناتنا أن 10،000 التضخيم أضعاف في تركيز الحليلة معين لا يمكن أن يتحقق، مما الطيفي والمناعية للكشف عن المؤشرات الحيوية لا يمكن الكشف عنها سابقا.
على الرغم من الانتهاء من تسلسل الجينوم البشري، لم يتم إحراز تقدم كبير في تحديد المؤشرات الحيوية التنبؤية المرض مرحلة مبكرة، أو التي ترتبط مع نتائج علاجية، أو التكهن 1. وأحد أسباب ذلك عدم إحراز تقدم هو أن العديد من المؤشرات الحيوية الهامة المحتملة توجد بتركيز أقل من حد الكشف عن مطياف الكتلة التقليدية وغيرها من منصات اكتشاف العلامات البيولوجية. مطياف الكتلة (MS) ومتعددة رصد رد الفعل (MRM) لديهم حساسية الكشف عادة أكبر من 50 نانوغرام / مل في حين أن الغالبية العظمى من التحاليل المناعية تقاس في سقوط المختبر السريري في نطاق بين 50 جزء من الغرام / مل و 10 نانوغرام / مل . وهذا يعني أن العديد من المؤشرات الحيوية، وخاصة في المرحلة المبكرة من المرض لا يمكن الكشف عنها بواسطة MS التقليدية وMRM 2. وبالإضافة إلى ذلك وجود وفرة عالية من البروتينات مثل الألبومين والغلوبولين المناعي في السوائل البيولوجية المعقدة غالبا ما تخفي من مليار أضعاف مريض بالحبوفاق سطيف منخفضة وفرة، منخفضة الوزن الجزيئي البروتينات والببتيدات 3، 4، ولهذا السبب هناك حاجة العديد من الخطوات التحضيرية عينة قبل التسلسل الطيف الكتلي وتحديد الهوية. إحدى هذه خطوة تمهيدية توظف استنزاف البروتينات عالية فرة مع الأعمدة استنزاف المتاحة تجاريا 5-8. للأسف هذه الخطوة تؤدي إلى تخفيض العائد من المؤشرات الحيوية مرشح لأنها غالبا ما تكون مرتبطة تساهميا مع غير البروتينات الحاملة التي يتم إزالتها. ويمثل تحديا آخر من استقرار المؤشرات الحيوية مرشح فيفو السابقين مرة واحدة يتم جمع العينات. بروتينات قابلة للتحلل بواسطة البروتياز الذاتية أو الخارجية 9. يمكن النانوية هيدروجيل تجاوز هذه التحديات الحرجة عن طريق تضخيم تركيز العلامات البيولوجية المفترضة إلى مستوى ضمن نطاق الفحص، مع حماية البروتين من تدهور 10-13.
من المهم أن نلاحظ عشرفي LMW البروتينات في الدم هي مزيج من البروتينات سليمة الصغيرة وكذلك أجزاء كبيرة من البروتينات. البروتينات المشتقة من الأنسجة أكبر من 60 كيلو دالتون كبيرة جدا للدخول بشكل سلبي مجرى الدم من خلال الغشاء القاعدي الأوعية الدموية، ولكنها يمكن أن تمثل في الدم والببتيدات أو شظايا البروتين 14. هدفنا هو قياس المؤشرات الحيوية تعميم الرواية التي يمكن أن تكون مرشحة للكشف المبكر عن المرض، والطبقية المريض للعلاج، ومراقبة الاستجابة للعلاج. يتم إنشاء النانوية جهدنا لاستبعاد انتقائي المناعية وفرة عالية والزلال، في وقت واحد أثناء التقاط البروتينات والببتيدات الصغيرة والتركيز عليها ما يصل إلى 100 أضعاف اعتمادا على حجم انطلاق.
حددت مجموعتنا مجموعة من الأصباغ العضوية الصغيرة التي يمكن أن تعمل بنجاح تقارب عالية والطعوم الجزيئية للبروتينات والببتيدات. ويعتقد ملزم البروتين صبغ أن يكون نتيجة لمزيج من التفاعل مسعور وكهرباءق. الحلقات العطرية على صبغ تعشيق مع البروتينات عبر جيوب مسعور على سطح البروتين 11.
الطعوم، اعتمادا على الكيمياء، وتظهر تقارب معين لفئات مختارة من التحاليل. الطعوم تتنافس مع البروتينات الحاملة، مثل الزلال، على البروتينات أو الببتيدات. منخفضة الوزن الجزيئي البروتينات / الببتيدات تصبح المحاصرين في الجسيمات. يتم منع البروتينات عالية الوزن الجزيئي مثل الألبومين والغلوبولين المناعي من دخول الجسيمات بسبب القدرة النخل بسبب المسام تقييدا من هيدروجيل 11 (الشكل 1).
وقد تم تجميع الجسيمات النانوية هيدروجيل من قبل هطول البلمرة التي بدأها بيرسلفات الأمونيوم 11. N-isopropylacrylamide (NIPAm)، يسمح شارك أحادية من حمض الاكريليك (AAC) وآليلامين (AA) وعبر رابط N، N'-Methylenebisacrylamide (BIS) للرد على 70 درجة مئوية لمدة 6 ساعة في ظروف المخففة 11، 13، وتقارب نسبة عالية من البروتين ملزمة من بولي (N-isopropylacrylamide-CO-حمض الاكريليك) (بولي (NIPAm-CO-AAC) nanoparticlesis من خلال دمج تساهميا الأصباغ التي تحتوي على الأمينية (أي.، والأصباغ sulfonatedanthraquinonetriazine) في الجسيمات النانوية من خلال تحقيق رد فعل amidation أجريت في المذيبات المائية أو العضوية تبعا ل/ خصائص ماء مسعور من 11 الأصباغ، يستخدم 13. استبدال أليف النواة للمجموعات الأمينات في جسيمات متناهية الصغر مع ذرة كلور لصبغ anthraquinonetriazine لخلق بولي تحتوي على صبغة (NIPAm -co-آليلامين) (AA) النانوية 11، 12. يتم استغلال عملية البلمرة من خطوتين لخلق الجسيمات النانوية هيدروجيل تحتوي على الغلاف الخارجي من حمض vinylsulfonic (VSA) 11، 13.
النانوية هيدروجيل يمكن تطبيقها على السوائل البيولوجية المختلفة، بما في ذلك الدم الكامل، والبلازما، المصل، السائل النخاعي، والعرق، والبول. في خطوة واحدة، في الحل، نanoparticles إجراء سريع (في غضون دقائق) عزل وتركيز منخفض الوزن الجزيئي التحاليل 10، 11، 13، 15-18. ومزال البروتينات في وقت لاحق من الجسيمات النانوية والكشف باستخدام ويسترن النشاف 19-21، مطياف 10، 11، 13، 15، 18، 22 كتلة (23 عاما) المناعية / ELISA 10، 11، 15، 18، أو مرحلة عكس البروتين ميكروأري 16، 24 المقايسات. النانوية بين functionalized مع الطعم الكيميائية، وتقديم الأساسية أو الأساسية قذيفة الهندسة المعمارية، والتقاط وتركز البروتينات على أساس الخصائص الفيزيائية الطعم / شل. لذا سوف الأصباغ المختلفة دمجها في التقاط الجسيمات النانوية مجموعات فرعية مختلفة من البروتينات مع اختلاف الكفاءة على أساس تقارب صبغ، ودرجة الحموضة من الحل، وحضور / غياب المنافسة بروتينات عالية وفيرة 13. وعلاوة على ذلك، فإن كمية الجسيمات النانوية فيما يتعلق حجم الحل يؤثر على العائد البروتين من الجسيمات النانوية. هذه الجوانب منوأظهرت هيدروجيل حصاد جسيمات متناهية الصغر باستخدام ثلاثة جسيمات متناهية الصغر الطعوم المختلفة للبروتينات الحصاد من عينات البلازما التي تحتوي على كميات عالية من البروتين، وعينات من البول والتي عادة لا تحتوي على كميات كبيرة من البروتين. في هذا البروتوكول نظهر الحصاد والتركيز عامل نخر الورم ألفا (TNFα) من عينات البلازما باستخدام بولي (NIPAm-CO-AAC)، بولي (NIPAm / صبغ)، وقذيفة النانوية الحدقة (بولي (NIPAm-CO-VSA)) . وتظهر بولي (NIPAm / صبغ) الجسيمات النانوية للتركيز المستضد الأنواع المتفطرة التي تم إضافتها إلى عينات البول الإنسان، لتقليد السل المتفطرة الأفراد المصابين.
الصلة السريرية
ويعتقد أن المصل أو البلازما عينة لاحتواء منخفضة وفرة البروتينات والببتيدات المنتشرة التي يمكن أن توفر مصدرا غنيا للمعلومات عن حالة الكائن الحي ككل. على الرغم من الوعد البروتينات في الدم، وهناك ثلاثة حوا?…
The authors have nothing to disclose.
مايكل هنري، جامعة مدينة دبلن، يرجى المساعدة في جمع البيانات وتحليلها هو مبين في الشكل 5. وأيد هذا العمل جزئيا من قبل (1) جامعة جورج ماسون، (2) الإيطالية IstitutoSuperiore دي سانيتا "في إطار ايطاليا / الولايات المتحدة الأمريكية اتفاقية تعاون بين وزارة الصحة والخدمات الإنسانية، جامعة جورج ماسون، والوزارة الإيطالية للصحة العامة، (3) NIH، برنامج المنح IMAT 1R21CA137706-01 و1R33CA173359-01 إلى LAL، و (4) سيريس العلوم النانوية، وشركة .
hydrogel nanoparticles | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP particles |
18 MΩ-cm water | Type 1 reagent grade water | ||
Tris HCl, 50mM pH7.0 | VWR | IC816116 | 50mM, pH 7 |
Acetonitrile | BDH | BDH1103-4LP | available from VWR |
Ammonium Hydroxide NH4OH | BDH | BDH3014 | available from VWR, assayed at 28-30% NH3 |
sodium thiocyanate 25mM | Acros Organics | 419675000 | for serum/plasma samples |
Multi-analyte Urine Reagent Strips | Siemens | 2161 | for urine samples |
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Life Technologies | LC2676 | use at room temperature to prevent SDS from precipitating |
Dry bath incubator (100 oC) with heating block | Barnstead | 11-715-125DQ | do not substitute a boiling water bath |
Nitrogen evaporator manifold | Organomation Associates | Microvap118 | for serum/plasma samples |
Centrifuge, swing-out rotor | Sorvall | Legend series | 50ml tube capacity, rcf 3700 x g |
Centrifuge, fixed angle rotor | Eppendorf | 5424 | 1.7ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g |
50ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | with screw caps for urine samples |
1.5ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22363204 | |
Disposable plastic transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | at least 1ml capacity |
Vortex mixer | Fisher Scientific | 50-949-755 | |
Timer | Fisher Scientific | S04782 | seconds/minutes |