Diversi biomarcatori patologici non possono essere facilmente rilevati dalle tecniche attuali a causa della loro bassa concentrazione nei fluidi biologici, della presenza di enzimi degradanti e di grandi quantità di proteine ad alto peso molecolare. Le nanoparticelle di idrogel chimicamente funzionalizzate possono raccogliere, conservare e concentrare proteine a bassa abbondanza consentendo il rilevamento di biomarcatori precedentemente non rilevabili.
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Articolo metodologico
Hydrogel nanoparticelle raccolta di plasma o nelle urine per il rilevamento di proteine a basso Abbondanza
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Scoperta di biomarcatori romanzo gioca un ruolo cruciale nel fornire il rilevamento delle malattie più sensibile e specifica. Purtroppo molti biomarcatori bassa abbondanza che esistono nei fluidi biologici non possono essere facilmente individuati con la spettrometria di massa o immunologici perché sono presenti in concentrazioni molto basse, sono labili, e sono spesso mascherati da proteine ad alta abbondanza, come l'albumina e immunoglobulina. Bait contenente poli (N-isopropilacrilammide) (NIPAM) nanoparticelle a base sono in grado di superare queste barriere fisiologiche. In un passo sono in grado di catturare, concentrare e preservare biomarcatori da fluidi corporei. Analiti basso peso molecolare entrano nel nucleo della nanoparticella e vengono catturati da diversi coloranti chimici organici, che fungono da alta affinità esche proteiche. Le nanoparticelle sono in grado di concentrare le proteine di interesse di parecchi ordini di grandezza. Questo fattore di concentrazione è sufficiente aumentare il livello di proteina tale che le proteine sono all'internolimite di rilevazione di spettrometri di massa attuali, western blotting e saggi immunologici. Le nanoparticelle possono essere incubate con una pletora di fluidi biologici e sono in grado di arricchire notevolmente la concentrazione di proteine a basso peso molecolare e peptidi, escludendo albumina e altre proteine ad alto peso molecolare. I nostri dati mostrano che una piega amplificazione 10.000 nella concentrazione di un particolare analita può essere raggiunto, consentendo spettrometria di massa e test immunologici per rilevare biomarker precedentemente non rilevabili.
Introduzione
Nonostante il completamento del sequenziamento del genoma umano, non sono stati compiuti progressi significativi in biomarcatori predittivi di identificazione di malattia in stadio precoce, o che la correlazione con il risultato terapeutico, o la prognosi 1. Uno dei motivi di questa mancanza di progresso è che esistono molti biomarcatori potenzialmente significative ad una concentrazione al di sotto del limite di rilevazione di spettrometria di massa convenzionale e altre piattaforme di scoperta biomarker. La spettrometria di massa (MS) e multipla Reaction Monitoring (MRM) hanno una sensibilità di rilevamento tipicamente superiore a 50 ng / ml, mentre la m....
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Protocollo
Plasma umano e nelle urine sono stati raccolti da donatori volontari sani, con il consenso informato scritto, seguendo George Mason University Institutional Review Board protocolli approvati. I donatori sono stati equamente distribuiti tra maschi caucasici e femmine di età compresa tra 25 e 42 campioni sono stati analizzati individualmente tra e non sono stati riuniti.
1 nanoparticelle Elaborazione di siero o plasma
Basso potenziale di biomarcatori abbondanti nel plasma vengono catturati, in soluzione, con nanoparticelle idrogel. Le particelle vengono aggiunti al plasma, incubato, separato per centrifugazione, l....
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Risultati
Hydrogel nanoparticelle Dimensioni e uniformità
Poli (NIPAM-AAC) le particelle sono state prodotte con altissima resa e riproducibilità tra e all'interno di lotti. Le particelle hanno una buona stabilità colloidale a RT per il tempo necessario per l'acquisizione, la memorizzazione e l'eluizione delle proteine (almeno 48 ore), e nanoparticelle precipitazione non è stato osservato (Figura 1) 11. La stabilità colloidale può essere molto importante .......
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Discussione
Rilevanza clinica
Un campione di siero o plasma è pensato per contenere bassa abbondanza di proteine e peptidi in grado di fornire una ricca fonte di informazioni per quanto riguarda lo stato dell'organismo nel suo complesso circolante. Nonostante la promessa di proteomica del siero, ci sono tre barriere fisiologiche fondamentali e gravi contrastare scoperta di biomarcatori e la traduzione di beneficio clinico 10, 11, 16, 25.
Pos.......
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Dichiarazioni
Benjamin Espina è un dipendente di Ceres Nanosciences, Inc. che produce i reagenti utilizzati in questo articolo. Lance Liotta, Alessandra Luchini e Virginia Espina sono titolari di brevetti (brevetto USA 7.935.518 e/o 8.497.137) sulla tecnologia delle nanoparticelle utilizzata in questo articolo. In qualità di dipendenti dell'università, hanno diritto a ricevere royalties da questi brevetti in base alla politica universitaria. Lance Liotta e Alessandra Luchini sono azionisti di Ceres Nanosciences e fanno parte del Comitato Consultivo Scientifico.
Ringraziamenti
Michael Henry, Dublin City University, gentilmente aiutato con la raccolta e analisi dei dati illustrato in Figura 5. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da (1) George Mason University, (2) l'italiano IstitutoSuperiore di Sanita 'nel quadro della Italia / USA accordo di cooperazione tra il Dipartimento di Salute e Servizi Umani, George Mason University, e il Ministero della Salute pubblica italiana, (3) NIH, borse di programma IMAT 1R21CA137706-01 e 1R33CA173359-01 a LAL, e (4) Ceres Nanoscienze, Inc .
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nanoparticelle di idrogel | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP particelle |
| 18 MΩ-cm di acqua | Reagente di tipo 1 | ||
| Tris HCl, 50 mM pH 7.0 | VWR | IC816116 | 50 mM, pH 7 |
| Acetonitrile | BDH | BDH1103-4LP | Disponibile da VWR |
| Idrossido di ammonio NH4OH | BDH | BDH3014 | Disponibile da VWR, dosato al 28-30% NH3 |
| Sodium tiocianato 25 mM | Acros Organics | 419675000 | Per campioni di siero/plasma |
| Strisce di reagenti per urine multi-analita | Siemens | 2161 | Per campioni di urina |
| Tris-glicina SDS Sample Buffer (2X) | Life Technologies | LC2676 | a RT per prevenire la precipitazione di SDS |
| Incubatore a bagno secco (100 oC) con blocco riscaldante | Barnstead | 11-715-125DQ | Non sostituire un bagno d'acqua bollente |
| Collettore dell'evaporatore di azoto | Organomation Associates | Microvap118 | Per campioni di siero/plasma |
| Centrifuga, rotore oscillante | Sorvall | Legend | Capacità provette 50 ml, rcf 3.700 x g |
| Centrifuga, rotore ad angolo fisso | Eppendorf | 5424 | Capacità microcentrifuga 1,7 ml, RCF 16.000 x g |
| Centrifuga conica da 50 ml provette | Fisher Scientific | 14-432-22 | Con tappi a vite per campioni di urina |
| Provette per microcentrifuga da 1,5 ml | Eppendorf | 22363204 | |
| Miscelatore a vortice | Fisher Scientific | 50-949-755 | |
| Timer | Fisher Scientific | S04782 | Secondi/minuti |
Riferimenti
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
- Gerszten, R. E., et al. Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs.<....
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Ristampe e permessi
