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方法文章

水凝胶纳米颗粒采集血浆或尿液用于检测低丰度蛋白质

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DOI：

10.3791/51789

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2014年8月7日

 ,  ,  ,  , 
1Center for Applied Proteomics and Molecular Medicine, George Mason University, 2Ceres Nanosciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

由于病理生物标志物在生物流体中浓度较低、存在降解酶以及大量高分子量蛋白质，目前的技术难以对其进行有效检测。经过化学功能化修饰的水凝胶纳米颗粒能够捕获、保存并富集低丰度蛋白质，从而实现对以往无法检测的生物标志物的检测。

摘要

新型生物标志物的发现对于实现更灵敏、更特异的疾病检测具有关键作用。然而，许多存在于生物体液中的低丰度生物标志物由于浓度极低、稳定性差，且常被白蛋白或免疫球蛋白等高丰度蛋白掩盖，难以通过质谱或免疫分析方法被有效检测。基于聚（N-异丙基丙烯酰胺）（NIPAm）并含有捕获探针的纳米颗粒能够克服这些生理屏障。该纳米颗粒可在一步操作中实现从体液中捕获、富集和保存生物标志物。低分子量分析物可进入纳米颗粒的核心，并被多种有机化学染料捕获，这些染料作为高亲和力的蛋白探针发挥作用。纳米颗粒能够将目标蛋白富集数个数量级。这种富集倍数足以显著提高蛋白浓度，使其达到当前质谱仪、Western印迹及免疫分析方法的检测限。该纳米颗粒可与多种生物体液共同孵育，能够显著富集低分子量蛋白和肽段，同时排除白蛋白及其他高分子量蛋白。我们的数据显示，特定分析物的浓度可实现高达10,000倍的扩增，从而使质谱和免疫分析能够检测到原本无法检出的生物标志物。

引言

尽管人类基因组测序已经完成，但在识别能够预测疾病早期阶段、与治疗效果或预后相关的生物标志物方面，进展仍然有限1。造成这一进展缓慢的原因之一是，许多潜在重要的生物标志物浓度低于传统质谱技术及其他生物标志物发现平台的检测限。质谱法（MS）和多反应监测（MRM）的检测灵敏度通常高于50 ng/ml，而临床实验室中免疫测定所检测的大多数分析物浓度范围在50 pg/ml至10 ng/ml之间。这意味着许多生物标志物，尤其是在疾病早期阶段的标志物，无法通过传统的MS和MRM技术检测到2。此外，复杂生物体液中高丰度蛋白（如白蛋白和免疫球蛋白）的存在，常常以高达十亿倍的过量掩盖了低丰度、低分子量的蛋白质和肽段3,4。因此，在进行质谱测序与鉴定之前，通常需要多个样品前处理步骤。其中一种前处理方法是使用 commercially available 的去除柱来去除高丰度蛋白5-8。然而，这种方法会导致候选生物标志物的得率降低，因为这些标志物常通过非共价方式与正在被去除的载体蛋白结合。另一个挑战在于样品采集后候选生物标志物在体外（ex-vivo）的稳定性问题。蛋白质易受内源性或外源性蛋白酶的降解作用影响9。水凝胶纳米颗粒可通过将潜在生物标志物的浓度扩增至检测方法可识别的范围，同时保护蛋白质免于降解，从而克服这些关键挑战10-13。

需要注意的是，血液中的低分子量蛋白质是小的完整蛋白质以及大分子蛋白质片段的混合物。来源于组织且分子量大于60 kDa的蛋白质因体积过大，无法通过血管基底膜被动进入血液循环，但它们可以以肽段或蛋白质片段的形式存在于血液中14。我们的目标是检测新型循环生物标志物，这些标志物有望用于疾病的早期发现、患者的治疗分层以及治疗反应的监测。我们设计的纳米颗粒能够选择性排除高丰度的免疫球蛋白和白蛋白，同时捕获较小的蛋白质和肽段，并根据起始体积将其浓缩高达100倍。

本研究团队鉴定出一组小分子有机染料，可成功作为高亲和力的蛋白质和多肽分子诱饵。蛋白质与染料的结合被认为是由疏水作用和静电相互作用共同介导的。染料上的芳香环通过蛋白质表面的疏水口袋与蛋白质发生交错结合11。

根据化学性质的不同，捕获探针会对特定类别的分析物表现出特异性亲和力。这些捕获探针会与白蛋白等载体蛋白竞争结合蛋白质或多肽。低分子量的蛋白质或多肽被截留在颗粒内部，而由于水凝胶的孔径限制具有筛分效应，高分子量蛋白质（如白蛋白和免疫球蛋白）则无法进入颗粒内部11（图1）。

通过过硫酸铵引发的沉淀聚合法合成水凝胶纳米颗粒11在稀释条件下，将N-异丙基丙烯酰胺（NIPAm）、丙烯酸（AAc）和烯丙胺（AA）共聚单体以及交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（BIS）于70 °C反应6小时11, 13聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-丙烯酸)（poly(NIPAm-co-AAc)）纳米颗粒的高蛋白结合亲和力是通过共价引入含氨基染料实现的即通过酰胺化反应将磺化蒽醌三嗪类染料（sulfonated anthraquinone triazine dyes）引入纳米颗粒中，反应溶剂根据染料的亲水/疏水特性选择水相或有机相11, 13利用纳米颗粒中的胺基对蒽醌三嗪染料的氯原子进行亲核取代反应，制备含染料的聚(N-异丙基丙烯酰胺-共-烯丙胺)（AA）纳米颗粒11, 12采用两步聚合工艺制备含有乙烯基磺酸（VSA）外层的水凝胶纳米颗粒11, 13.

水凝胶纳米颗粒可应用于多种生物流体，包括全血、血浆、血清、脑脊液、汗液和尿液。在一步溶液反应中，这些纳米颗粒可在数分钟内快速捕获并富集低分子量分析物。10, 11, 13, 15-18随后通过纳米颗粒洗脱蛋白质，并利用蛋白质印迹法进行检测19-21，质谱法10, 11, 13, 15, 18, 22, 23免疫测定/酶联免疫吸附测定10, 11, 15, 18，或反相蛋白微阵列16, 24 检测。通过化学诱饵功能化的纳米颗粒，具有核或核壳结构，可根据诱饵/壳层的理化特性捕获并富集蛋白质。由于染料亲和性、溶液pH值以及是否存在高丰度竞争蛋白的影响，掺入不同染料的纳米颗粒将因此以不同效率捕获不同亚群的蛋白质。13此外，纳米颗粒的数量与溶液体积的比例会影响从纳米颗粒中获得的蛋白质产量。本实验方案通过三种不同的纳米颗粒诱饵，展示了水凝胶纳米颗粒收获过程中的这些关键因素，用于从富含蛋白质的血浆样本以及通常蛋白质含量较低的尿液样本中富集蛋白质。在本方案中，我们展示了利用聚(NIPAm-co-AAc)、Poly(NIPAm/dye) 和核-壳结构纳米颗粒（Poly(NIPAm-co-VSA)）从血浆样本中富集和浓缩肿瘤坏死因子α（TNFα）。结果显示，Poly(NIPAm/dye) 纳米颗粒能够有效浓缩 分枝杆菌 添加至人尿液样本中以模拟的物种抗原 结核分枝杆菌 感染者

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方案

人血浆和尿液来自健康志愿者捐献者，采集过程遵循乔治梅森大学机构审查委员会批准的方案，并取得捐献者的书面知情同意。捐献者为25至42岁之间的高加索人种，男女数量相等。样本均单独分析，未进行混合。

1. 血清或血浆样本的纳米颗粒处理

在溶液中，利用水凝胶纳米颗粒捕获血浆中潜在的低丰度生物标志物。将纳米颗粒加入血浆中，孵育后通过离心分离，洗涤，并洗脱捕获的蛋白质。洗脱的蛋白质在氮气流下干燥，用于后续的质谱测序与鉴定。

  1. 在微量离心管中，用50 mM TrisHCl pH 7将500 µl血清按1:2稀释（500 µl血清 + 500 µl TrisHCl）。
  2. 加入500 µL聚(NIPAm/AAc)核纳米颗粒。在室温下孵育15分钟。
  3. 在配备固定角转子的离心机中，以16,100 × g、25 °C离心10分钟。移除并弃去上清液。
  4. 向沉淀中加入500 µl硫氰酸钠（25 mM）。通过反复剧烈吹打多次重悬纳米颗粒。
  5. 在配备固定角转子的离心机中，以16,100 × g、25 °C离心10分钟。移除并弃去上清液。
  6. 向纳米颗粒沉淀中加入500 µl MilliQ水。通过反复剧烈吹打多次重悬纳米颗粒。
  7. 在配备固定角转子的离心机中，以16,100 × g、25 °C离心10分钟。移除并弃去上清液。
  8. 现配洗脱缓冲液：在洁净离心管中，将700 µl乙腈加入300 µl氢氧化铵中。注意：氢氧化铵具有腐蚀性，需在适当通风条件下操作。注意：洗脱缓冲液必须在使用前立即配制，不可储存。
  9. 向纳米颗粒沉淀中加入300 µl洗脱缓冲液。通过反复剧烈吹打多次重悬纳米颗粒。在室温下孵育15分钟。
  10. 在配备固定角转子的离心机中，以16,100 × g、25 °C离心10分钟。将洗脱液转移至洁净、标记好的微量离心管中保存。
  11. 重复步骤1.9–1.10。将两次获得的洗脱液合并至同一微量离心管中。
  12. 在氮气吹扫蒸发装置中，于42.1 °C、气流设定为8的条件下，用氮气流吹干洗脱液（图2F）。
  13. 在进行质谱、Western blot或ELISA检测（可选）之前，将干燥的洗脱物在室温下过夜保存，或在-20 °C长期保存。

2. 尿液样本的纳米颗粒处理

正常尿液中蛋白质含量低于 30 mg/dl，血含量低于 1+。然而，许多疾病或状况可能改变尿液中蛋白质和血的正常水平。为了帮助确定向尿液样本中添加纳米颗粒的最佳体积，需在纳米颗粒富集前进行尿液分析。尿液生物标志物的浓度可能极低，这可能需要优化纳米颗粒与尿液体积的比例。本实验方案描述了用于后续 Western 印迹分析的尿液样本纳米颗粒富集方法。

  1. 在洁净、干燥的塑料杯中收集尿液样本，所需最小体积为 22 ml。将尿液样本在 -80 °C 下保存，直至准备进行分析。
  2. 在室温或 4 °C 过夜（O/N）条件下解冻冷冻尿液。短暂涡旋混匀。将至少 22 ml 尿液倒入一个 50 ml 圆锥底聚丙烯管中。
  3. 使用配备摆动转子的离心机，在 3,700 × g 条件下离心尿液 15 分钟。将上清液（不扰动沉淀）倾入另一个洁净的 50 ml 圆锥底聚丙烯管中，弃去沉淀。
  4. 使用多组分“尿液试纸条”试剂条进行尿液分析。注意：试剂条应保存在密闭容器中，避免阳光直射和潮湿17, 18。
    1. 将试剂条正面朝上平放在洁净、干燥的纸巾上。
    2. 使用一次性移液器吸取步骤 2.3 中制备的尿液 1 ml。
    3. 设定计时器为 2 分钟，但暂不启动。迅速在试剂条的每个测试垫上滴加 1–2 滴尿液，然后立即启动计时器。注意：切勿将试剂条直接浸入尿液容器中，否则试剂条中的染料/化学指示剂可能从试纸中渗出并进入尿液容器。
    4. 根据试剂条包装容器上标注的时间，通过将各试剂垫的颜色与容器上的色码指示进行比对，记录试剂条上各分析物的定性结果。典型的正常尿液结果为：血（正常或阴性）、蛋白（正常或阴性）、白细胞（正常或阴性）、亚硝酸盐（正常或阴性）、葡萄糖（正常或阴性）、酮体（正常或阴性）、胆红素（正常或阴性）和尿胆原（正常或阴性）；尿液 pH 值（5.5–7.0）；比重（1.001–1.020）。注意：尿液中高浓度蛋白可能与目标蛋白竞争纳米颗粒上的结合位点。为最大化利用纳米颗粒富集蛋白，可调整纳米颗粒体积与尿液体积的比例，以减少高丰度蛋白的竞争，或优化用于富集极低浓度蛋白的条件。若尿液蛋白检测结果为 1+ 或更高，在下方步骤 2.5 中应加入 2 倍体积的纳米颗粒。若目标分析物为极低丰度蛋白，可能需要将纳米颗粒体积增加至 2 ml (图 3)。
  5. 将步骤 2.3 中澄清的尿液 20 ml 转移至一个洁净的 50 ml 圆锥底聚丙烯管中。注意不要扰动尿液管底部可能存在的任何残渣或沉淀。向 20 ml 尿液样本中加入 200 µl 纳米颗粒，短暂涡旋混匀。注意：若尿液蛋白检测结果为 1+ 或更高，则向 20 ml 尿液中加入 400 µl 纳米颗粒。
  6. 在室温下孵育尿液/纳米颗粒混合物 30 分钟，期间不进行摇动或混合。
  7. 使用配备摆动转子的离心机，在 3,700 × g 条件下离心尿液/纳米颗粒悬液 10 分钟。注意：若离心后未见明显沉淀，可再延长离心 2–7 分钟。
  8. 移除并弃去上清液。向纳米颗粒沉淀中加入 500 µl MilliQ 水。
  9. 通过反复剧烈吹打多次重悬纳米颗粒。将纳米颗粒溶液转移至一个洁净的 1.5 ml 微量离心管中。
  10. 使用配备固定角转子的离心机，在 16,100 × g 条件下离心纳米颗粒 10 分钟。注意：若离心后未见明显沉淀，可再延长离心 2–7 分钟。
  11. 移除并弃去上清液。
  12. 用 200 µl MilliQ 水重复步骤 2.8 和 2.11 两次，以洗涤纳米颗粒。
  13. 现配洗脱缓冲液：在洁净的离心管中，将 970 µl 乙腈加入 30 µl 氢氧化铵中。注意：氢氧化铵具有腐蚀性，应在适当通风条件下操作。注意：洗脱缓冲液必须在使用前立即配制，不可储存。
  14. 向纳米颗粒沉淀中加入 20 μl 洗脱缓冲液。通过反复剧烈吹打多次重悬纳米颗粒，并在室温下孵育 15 分钟。
  15. 在 16,100 × g 条件下离心纳米颗粒样品 10 分钟。将上清液小心移出并保存至一个洁净的 1.5 ml 微量离心管中。注意不要扰动纳米颗粒沉淀。将沉淀丢弃至生物危害垃圾桶中。
  16. 将样品置于通风橱内的试管架上，打开管盖，在室温下孵育 30 分钟。或者，也可将样品置于 40 °C 氮气流下吹干（1–2 小时）。
  17. 向样品中加入 15 µl Tris-甘氨酸 SDS 样品缓冲液（2x）。在干式加热块中 100 °C 加热 5 分钟（管盖打开），或加热至管内剩余体积不超过 20 µl。注意：不可使用沸水浴，水浴中的湿气会阻碍缓冲液的蒸发。
  18. 盖上管盖，将离心管从加热块上取下。样品可立即用于后续的 Western blot 分析，或在 -80 °C 下保存。

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结果

水凝胶纳米颗粒的尺寸与均一性

Poly(NIPAm-AAc) 颗粒的制备具有极高的产率，且批间和批内重复性良好。这些颗粒在室温下具有良好的胶体稳定性，在蛋白质捕获、储存和洗脱所需的时间内（至少48小时）未观察到纳米颗粒沉淀（图1）11。胶体稳定性对于纳米颗粒快速吸附蛋白质/多肽可能具有重要意义。

从血浆中获取的潜在低丰度生物标志物

染料诱饵的引入可促进溶液中分子的摄取，并确保捕获的分子免于降解13, 15, 25。因此，在样本预处理过程中无需使用蛋白酶抑制剂。这种纳米颗粒的特性使其非常适合作为一种保存技术，用于野外样本采集以及生物液体在室温条件下的运输。

诱饵分子可通过共聚或与纳米颗粒中存在的功能基团共价结合的方式掺入水凝胶颗粒中。例如，通过零长度交联酰胺化反应，将含氨基的...

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讨论

临床意义

血清或血浆样本被认为含有低丰度的循环蛋白和多肽，这些成分可为机体整体状态提供丰富的信息来源。尽管血清蛋白质组学具有广阔前景，但存在三个基本且严重的生理学障碍，阻碍了生物标志物的发现及其向临床应用的转化10, 11, 16, 25。

1. 重要的诊断生物标志物在血液中可能以极低的丰度（浓度）存在。早期病变组织（如转移前癌变病灶）的体积可能小于几立方毫米3。从如此微小的组织体积释放到循环系统中的生物标志物，在整体血容量中会被高度稀释。相关分析物的浓度可能低于质谱和传统免疫分析方法的检测限。

2. 高丰度蛋白（如白蛋白和免疫球蛋白）可掩盖低丰度生物标志物/蛋白，这些高丰度蛋白可占血浆蛋白质组的90%14。

3. 蛋白质和肽在静脉采血及样本运输/储存后易受内源性和外源性蛋白酶的降解。蛋白质降解可能导致假阳性或假阴性结...

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披露

Benjamin Espina 是 Ceres Nanosciences, Inc. 的员工，该公司生产本文所用的试剂。Lance Liotta、Alessandra Luchini 和 Virginia Espina 拥有本文所用纳米颗粒技术的相关专利（美国专利 7,935,518 和/或 8,497,137）。作为大学雇员，根据大学政策，他们有权从这些专利中获得专利使用费。Lance Liotta 和 Alessandra Luchini 是 Ceres Nanosciences 的股东，并任职于科学咨询委员会。

致谢

都柏林城市大学的 Michael Henry 协助完成了 图5 所示的数据收集与分析工作。本研究的部分资助来自：(1) 乔治梅森大学；(2) 意大利国家卫生研究院（Istituto Superiore di Sanita’），依据美国卫生与公共服务部、乔治梅森大学与意大利公共卫生部之间的意美合作协定；(3) 美国国立卫生研究院（NIH）IMAT 项目基金 1R21CA137706-01 和 1R33CA173359-01（授予 LAL）；以及 (4) Ceres Nanosciences 公司。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
水凝胶纳米颗粒Ceres NanoscienceCS003NanoTrap ESP 颗粒
18 MΩ-cm 水1 级试剂级水
Tris HCl，50 mM，pH 7.0VWRIC81611650 mM，pH 7
乙腈BDHBDH1103-4LP可从 VWR 购得
氢氧化铵 NH4OHBDHBDH3014可从 VWR 购得，氨含量测定为 28–30% NH3
硫氰酸钠 25 mMAcros Organics419675000用于血清/血浆样本
多组分尿液检测试纸条西门子（Siemens）2161用于尿液样本
Tris-甘氨酸 SDS 样品缓冲液（2X）Life TechnologiesLC2676室温使用，防止 SDS 沉淀
干浴孵育器（100 oC），带加热模块Barnstead11-715-125DQ不可使用沸水浴替代
氮吹浓缩仪歧管Organomation AssociatesMicrovap118用于血清/血浆样本
离心机，摆动转子SorvallLegend 系列50 ml 离心管容量，离心力 3,700 × g
离心机，固定角转子Eppendorf54241.7 ml 微量离心管容量，离心力 16,000 × g
50 ml 圆锥形离心管 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）14-432-22带螺旋盖，用于尿液样本
1.5 ml 微量离心管Eppendorf22363204
涡旋混合器赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）50-949-755
计时器赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）S04782以秒/分钟为单位

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