血浆或尿液的水凝胶纳米粒子收获检测低丰度蛋白

Summary

几种病理生物标志物在生物体液中的浓度低、存在降解酶和大量高分子量蛋白质，因此目前的技术不容易检测到。化学功能化的水凝胶纳米颗粒可以收获、保存和浓缩低丰度蛋白质，从而能够检测以前无法检测到的生物标志物。

Abstract

新型生物标志物的发现在提供更多的敏感性和特异性疾病检测至关重要的作用。不幸的是许多存在于生物流体中低丰度生物标记物不能容易地与质谱法或免疫测定法，因为它们存在于非常低的浓度，是不稳定的，并且往往是由高丰度蛋白质，如白蛋白或免疫球蛋白掩蔽检测。诱饵含聚（N-异丙基丙烯酰胺）（NIPAM）基于纳米颗粒是能够克服这些生理屏障。在一个步骤中，他们能够捕捉，集中和保持体液的生物标记物。低分子量的分析物进入所述纳米颗粒的核心，由不同的有机的化学染料，它作为高亲和力蛋白诱饵被捕获。该纳米颗粒可以由几个数量级集中感兴趣的蛋白质。这个浓度因子是足以增加蛋白质水平，使得蛋白质内的目前质谱仪，免疫印迹和免疫检测限。纳米颗粒可以一起孵育过多的生物体液和它们能够极大丰富的低分子量蛋白质和肽的浓度，同时排除白蛋白和其它高分子量的蛋白质。我们的数据表明，在特定分析物的浓度的10,000倍放大，可以实现，使质谱和免疫检测以前无法检测的生物标志物。

Introduction

尽管完成了人类基因组测序，显著进展尚未作出确定的生物标志物预测的早期阶段的疾病，或与治疗结果，或预测¹相关。其中一个原因缺乏进展是，很多潜在的生物标志物显著以低于传统质谱和其他生物标志物发现平台的检测极限浓度存在。质谱（MS）和多反应监测（MRM）具有典型的检测灵敏度大于50纳克/毫升，而在50 pg / ml和10毫微克/毫升在临床实验室下降了免疫测定的范围广大的分析物的。这意味着许多生物标志物，特别是在疾病的早期阶段无法通过常规的MS和MRM ²被检测到。除了高丰度蛋白质，如白蛋白和免疫球蛋白的复合物的生物流体的存在往往掩盖由十亿倍货存ESS的低丰度，低分子量蛋白质和肽^3，4。为此几个样品的准备步骤之前所需要质谱测序和鉴定。一个这样的预备步骤中采用的高丰度蛋白质的与市售的耗尽列^5-8的耗尽。不幸的是这一步骤导致候选生物标志物的产率的降低，因为它们通常是非共价地与该被除去的载体蛋白相关联。另一个挑战是候选生物标志物前体的稳定性表示，一旦样品的采集。蛋白质是发生降解内源性或外源性蛋白酶^9。水凝胶的纳米颗粒可以通过扩增推定的生物标志物的浓度，以测定的范围内的电平超越这些关键的挑战，同时保护蛋白免受降解^10-13。

要注意个很重要在LMW在血液中的蛋白质是小完整蛋白质以及大蛋白的片段的混合物。组织来源的蛋白质比60 kDa的较大的过....

Protocol

人血浆和尿液是从健康志愿捐献者采集，并以书面的知情同意书，下面的乔治·梅森大学机构审查委员会批准的协议。捐助者平均分配白人男性和女性之间的25和42样品进行单独分析岁之间，并没有合并。

血清或血浆样品1纳米工艺

在等离子体电势低丰度生物标记物被捕获，在溶液中，用凝胶粒子。将粒子加入到等离子体中，温育，通过离心分离，洗涤，和所捕获的蛋白被洗脱。将洗脱的蛋白质根据用于下游质谱测序和鉴定的氮气流中干燥。

1. 在离心管2与50毫米TrisHCl pH值为7（500微升血+500微升TrisHCl）的稀释：500微升血清1。
2. 加入500μl聚（异丙基丙烯酰胺/ AAC）核心nanop的文章。孵育15分钟，在室温。
3. 在装有固定角转子的离心旋转的样品在16,100 XG，25℃下进行10分钟。拆下并丢弃上清液。
4. 加入500μl加入硫氰酸钠（25毫摩尔）的粒料。通过剧烈上下吹打多次重悬的纳米颗粒。
5. 在具有固定角度转子离心机旋转样品在16,100 XG，25℃下进行10分钟。拆下并丢弃上清液。
6. 加入500微升的MilliQ水的纳米颗粒沉淀。通过剧烈上下吹打多次重悬的纳米颗粒。
7. 在具有固定角度转子离心机旋转样品在16,100 XG，25℃下进行10分钟。拆下并丢弃上清液。
8. 准备新鲜的洗脱缓冲液：加入70....

Results

水凝胶纳米粒子大小和均匀度

聚（NIPAM-AAC）颗粒已产生极高的收益率和可重复性的和批次内。所述颗粒具有在RT非常好的胶体稳定性期间需要用于捕获，存储，和蛋白质的洗脱（至少48小时）的时间，以及纳米颗粒沉淀没有被观察到（ 图^1）11。胶体稳定性可能是由该纳米颗粒快速蛋白质/肽的摄取很重要。

从血浆中收获潜在的低丰度生物标志物

染料诱饵的掺入驱动在溶液分子的吸收和保证了捕获分子被降解^{13，15，18，25}保留。出于这个原因，样品前处理过程中不需要蛋白酶抑制剂。纳米粒子的这种属性使得它们Šuitable作为一种保鲜技术在该领域的样品采集和生物液体在室温发货。

诱饵分子可以通过共聚合或共价结合至存在于纳米粒子的官能团的水凝胶颗粒掺入。作为一个例子，聚（NIPAM-CO-的.......

Discussion

临床意义

血清或血浆样品被认为含有低丰度循环的蛋白质和多肽可提供的信息有关的生物体作为一个整体的国家的丰富来源。尽管血清蛋白质组学的承诺，有三个基本的和严重的生理障碍，阻碍生物标志物的发现和翻译临床获益^{10，11，16，25。}

一，重要诊断标志物可能存在于非常低丰度（浓度）在血液中。早期病变组织，例如预转移性癌症病灶，可以构成小于几个毫米^3。生物标志物从这样一个小的组织体积脱落到循环会变得高度稀释在整个血液量。相关分析物可能存在以下质谱和常规免疫测定的检测限。

2，低丰度生物标志物/蛋白质是由高丰度蛋白质，如白蛋白和免疫球蛋白，它们代表最高达90％的血浆蛋白质组¹⁴的存在掩蔽。

3，蛋白质和肽是由内源性和外源性蛋白酶容易退化下列静脉穿刺和样品运输/储存。蛋白质降解可能导致假阳性或假阴性结果^35。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
水凝胶纳米颗粒	Ceres Nanoscience	CS003	NanoTrap ESP 颗粒
18 MΩ-cm 水			1 型试剂级水
Tris HCl，50 mM pH 7.0	VWR	IC816116	50 mM，pH 7
乙腈	BDH	BDH1103-4LP	可从 VWR 获得
氧化铵 NH4OH	BDH	BDH3014	可从 VWR 获得，在 28-30% NH3
氰酸钠 25 mM	Acros Organics	419675000	用于血清/血浆样品
多分析物尿液试剂条	Siemens	2161	用于尿液样品
Tris-甘氨酸 SDS 样品缓冲液 （2X）	Life Technologies	LC2676	在室温下使用以防止 SDS 沉淀
干浴培养箱 （100 oC） 带加热块	Barnstead	11-715-125DQ	不要用沸水浴
气蒸发器 歧管	Organomation Associates	Microvap118	用于血清/血浆样品
离心机，水平转子	Sorvall	Legend 系列	50 ml 管容量，rcf 3,700 x g
离心机，固定角转子	Eppendorf	5424	1.7 ml 微量离心机容量，RCF 16,000 x g
50 ml 锥形离心机 试管	Fisher Scientific	14-432-22	带螺旋盖，用于尿液样品
1.5 ml 微量离心管	Eppendorf	22363204
涡旋混合器	Fisher Scientific	50-949-755
计时器	Fisher Scientific	S04782	秒/分钟