水凝胶纳米颗粒采集血浆或尿液用于检测低丰度蛋白质

摘要

由于病理生物标志物在生物流体中浓度较低、存在降解酶以及大量高分子量蛋白质，目前的技术难以对其进行有效检测。经过化学功能化修饰的水凝胶纳米颗粒能够捕获、保存并富集低丰度蛋白质，从而实现对以往无法检测的生物标志物的检测。

摘要

新型生物标志物的发现对于实现更灵敏、更特异的疾病检测具有关键作用。然而，许多存在于生物体液中的低丰度生物标志物由于浓度极低、稳定性差，且常被白蛋白或免疫球蛋白等高丰度蛋白掩盖，难以通过质谱或免疫分析方法被有效检测。基于聚（N-异丙基丙烯酰胺）（NIPAm）并含有捕获探针的纳米颗粒能够克服这些生理屏障。该纳米颗粒可在一步操作中实现从体液中捕获、富集和保存生物标志物。低分子量分析物可进入纳米颗粒的核心，并被多种有机化学染料捕获，这些染料作为高亲和力的蛋白探针发挥作用。纳米颗粒能够将目标蛋白富集数个数量级。这种富集倍数足以显著提高蛋白浓度，使其达到当前质谱仪、Western印迹及免疫分析方法的检测限。该纳米颗粒可与多种生物体液共同孵育，能够显著富集低分子量蛋白和肽段，同时排除白蛋白及其他高分子量蛋白。我们的数据显示，特定分析物的浓度可实现高达10,000倍的扩增，从而使质谱和免疫分析能够检测到原本无法检出的生物标志物。

引言

尽管人类基因组测序已经完成，但在识别能够预测疾病早期阶段、与治疗效果或预后相关的生物标志物方面，进展仍然有限¹。造成这一进展缓慢的原因之一是，许多潜在重要的生物标志物浓度低于传统质谱技术及其他生物标志物发现平台的检测限。质谱法（MS）和多反应监测（MRM）的检测灵敏度通常高于50 ng/ml，而临床实验室中免疫测定所检测的大多数分析物浓度范围在50 pg/ml至10 ng/ml之间。这意味着许多生物标志物，尤其是在疾病早期阶段的标志物，无法通过传统的MS和MRM技术检测到²。此外，复杂生物体液中高丰度蛋白（如白蛋白和免疫球蛋白）的存在，常常以高达十亿倍的过量掩盖了低丰度、低分子量的蛋白质和肽段^3,4。因此，在进行质谱测序与鉴定之前，通常需要多个样品前处理步骤。其中一种前处理方法是使用 commercially available 的去除柱来去除高丰度蛋白^5-8。然而，这种方法会导致候选生物标志物的得率降低，因为这些标志物常通过非共价方式与正在被去除的载体蛋白结合。另一个挑战在于样品采集后候选生物标志物在体外（ex-vivo）的稳定性问题。蛋白质易受内源性或外源性蛋白酶的降解作用影响⁹。水凝胶纳米颗粒可通过将潜在生物标志物的浓度扩增至检测方法可识别的范围，同时保护蛋白质免于降解，从而克服这些关键挑战^10-13。

需要注意的是，血液....

方案

人血浆和尿液来自健康志愿者捐献者，采集过程遵循乔治梅森大学机构审查委员会批准的方案，并取得捐献者的书面知情同意。捐献者为25至42岁之间的高加索人种，男女数量相等。样本均单独分析，未进行混合。

1. 血清或血浆样本的纳米颗粒处理

在溶液中，利用水凝胶纳米颗粒捕获血浆中潜在的低丰度生物标志物。将纳米颗粒加入血浆中，孵育后通过离心分离，洗涤，并洗脱捕获的蛋白质。洗脱的蛋白质在氮气流下干燥，用于后续的质谱测序与鉴定。

1. 在微量离心管中，用50 mM TrisHCl pH 7将500 µl血清按1:2稀释（500 µl血清 + 500 µl TrisHCl）。
2. 加入500 µL聚(NIPAm/AAc)核纳米颗粒。在室温下孵育15分钟。
3. 在配备固定角转子的离心机中，以16,100 × g、25 °C离心10分钟。移除并弃去上清液。
4. 向沉淀中加入500 µl硫氰酸钠（25 mM）。通过反复剧烈吹打多次重悬纳米颗粒。
5. 在配备固定角转子的离心机中，以16,100 × g、25 °C离心10分钟。移除并弃去上清液。
6. 向纳米颗粒沉淀中加入500 µl MilliQ水。通过反复剧烈吹打多次重悬纳米颗粒。
7. 在配备固定角转子的离心机中，以16,100 × g、25 °C离心10分钟。移除并弃去上清液。

结果

水凝胶纳米颗粒的尺寸与均一性

Poly(NIPAm-AAc) 颗粒的制备具有极高的产率，且批间和批内重复性良好。这些颗粒在室温下具有良好的胶体稳定性，在蛋白质捕获、储存和洗脱所需的时间内（至少48小时）未观察到纳米颗粒沉淀（图1）¹¹。胶体稳定性对于纳米颗粒快速吸附蛋白质/多肽可能具有重要意义。

从血浆中获取的潜在低丰度生物标志物

染料诱饵的引入可促进溶液中分子的摄取，并确保捕获的分子免于降解^{13, 15, 25}。因此，在样本预处理过程中无需使用蛋白酶抑制剂。这种纳米颗粒的特性使其非常适合作为一种保存技术，用于野外样本采集以及生物液体在室温条件下的运输。

诱饵分子可通过共聚或与纳米颗粒中存在的功能基团共价结合的方式掺入水凝胶颗粒中。例如，通过零长度交联酰胺化反应，将含氨基的.......

讨论

临床意义

血清或血浆样本被认为含有低丰度的循环蛋白和多肽，这些成分可为机体整体状态提供丰富的信息来源。尽管血清蛋白质组学具有广阔前景，但存在三个基本且严重的生理学障碍，阻碍了生物标志物的发现及其向临床应用的转化^{10, 11, 16, 25}。

1. 重要的诊断生物标志物在血液中可能以极低的丰度（浓度）存在。早期病变组织（如转移前癌变病灶）的体积可能小于几立方毫米³。从如此微小的组织体积释放到循环系统中的生物标志物，在整体血容量中会被高度稀释。相关分析物的浓度可能低于质谱和传统免疫分析方法的检测限。

2. 高丰度蛋白（如白蛋白和免疫球蛋白）可掩盖低丰度生物标志物/蛋白，这些高丰度蛋白可占血浆蛋白质组的90%¹⁴。

3. 蛋白质和肽在静脉采血及样本运输/储存后易受内源性和外源性蛋白酶的降解。蛋白质降解可能导致假阳性或假阴性结.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
水凝胶纳米颗粒	Ceres Nanoscience	CS003	NanoTrap ESP 颗粒
18 MΩ-cm 水			1 级试剂级水
Tris HCl，50 mM，pH 7.0	VWR	IC816116	50 mM，pH 7
乙腈	BDH	BDH1103-4LP	可从 VWR 购得
氢氧化铵 NH4OH	BDH	BDH3014	可从 VWR 购得，氨含量测定为 28–30% NH3
硫氰酸钠 25 mM	Acros Organics	419675000	用于血清/血浆样本
多组分尿液检测试纸条	西门子（Siemens）	2161	用于尿液样本
Tris-甘氨酸 SDS 样品缓冲液（2X）	Life Technologies	LC2676	室温使用，防止 SDS 沉淀
干浴孵育器（100 oC），带加热模块	Barnstead	11-715-125DQ	不可使用沸水浴替代
氮吹浓缩仪歧管	Organomation Associates	Microvap118	用于血清/血浆样本
离心机，摆动转子	Sorvall	Legend 系列	50 ml 离心管容量，离心力 3,700 × g
离心机，固定角转子	Eppendorf	5424	1.7 ml 微量离心管容量，离心力 16,000 × g
50 ml 圆锥形离心管	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	14-432-22	带螺旋盖，用于尿液样本
1.5 ml 微量离心管	Eppendorf	22363204
涡旋混合器	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	50-949-755
计时器	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	S04782	以秒/分钟为单位