Präparation und Immunfärbung von Imaginalscheiben aus Drosophila melanogaster

Zusammenfassung

Die adulten Strukturen von Drosophila stammen von sackartigen Strukturen ab, die imaginale Scheiben genannt werden. Die Analyse dieser Scheiben bietet Einblicke in viele Entwicklungsprozesse, einschließlich der Gewebebestimmung, der Etablierung von Kompartimentgrenzen, der Zellproliferation, der Spezifikation des Zellschicksals und der planaren Zellpolarität. Dieses Protokoll wird verwendet, um imaginale Scheiben für die Licht-/Fluoreszenzmikroskopie vorzubereiten.

Zusammenfassung

Ein wesentlicher Teil der Post-embryonalen Entwicklung in der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, findet innerhalb einer Reihe von sackartigen Strukturen genannt Imaginalscheiben. Diese Scheiben führen zu einem hohen Prozentsatz der erwachsenen Strukturen, die in die erwachsene Fliege zu finden sind. Hier haben wir ein Protokoll, das so optimiert wurde, um diese Scheiben zu erholen und bereiten sie für die Analyse mit Antikörpern, Transkriptions Reporter und Protein-Traps zu beschreiben. Dieses Verfahren ist am besten für dünne Gewebe wie Imaginalscheiben geeignet, kann aber leicht für die Verwendung mit dicker Gewebe modifiziert werden, wie die Larven und erwachsene Gehirn Eierstock. Die schriftliche Protokoll und begleitende Video den Leser / Betrachter durch die Zerlegung des dritten Larvenstadium, Fixierung von Gewebe, und die Behandlung von Imaginalscheiben mit Antikörpern führen. Das Protokoll kann verwendet werden, um Imaginalscheiben von jüngeren ersten und zweiten Larvenstadium sowie sezieren werden. Der Vorteil dieses Protokolls ist, daß sie relativ kurz ist, und es hat seinen für die hohe Qualität Erhaltung der sezierten Gewebe optimiert. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Fixierung Verfahren, das eingesetzt wird, funktioniert gut mit der überwiegenden Anzahl von Antikörpern, die Drosophila-Proteine ​​zu erkennen. Nach unserer Erfahrung gibt es eine sehr kleine Anzahl von empfindlichen Antikörper, die nicht gut mit diesem Verfahren arbeiten. In diesen Situationen wird das Heilmittel zu sein, um eine alternative Fixierung Cocktail nutzen und dabei die Richtlinien, die wir weiter für die Dissektion Schritte und Antikörperinkubationen haben zu folgen.

Einleitung

Seit mehr als einem Jahrhundert die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, ist einer der führenden System-Entwicklung, Verhalten und Physiologie zu studieren. Embryonalen und post-embryonale mit viel der letzteren stattfindet in Mono Epithelien genannt Imaginalscheiben ^1-3: Entwicklung in der Fliege können in zwei große Phasen unterteilt werden. Zeichnungen von Imaginalscheiben wurden erstmals im Jahre 1864 von August Weismann als Teil seines breiten Monographie über Insektenentwicklung ¹ veröffentlicht. Diese Scheiben ihrer Entwicklung beginnen während der Embryogenese, werden während der Larvenstadien gemustert, überleben die massiven Histolyse der frühen Puppenstadien und schließlich führen zu einem hohen Prozentsatz der erwachsenen Strukturen, die in der Erwachsenen gefunden werden fliegen ^1-14. Während Larvenentwicklung jede Scheibe macht mehrere kritische Entscheidungen in Bezug auf das Schicksal, Form und Größe. Innerhalb der ersten und zweiten Larvenstadien werden die Discs mit der Annahme einer primären Schicksal beauftragt, establisHing Fach Grenzen, die Annahme der richtigen Form und die Erzeugung der erforderlichen Anzahl von Zellen ^15-16. Während des dritten Larvenstadium und frühen Pre-Puppenstadium, die Imaginalscheiben weiter teilen und strukturiert, wie Zellen ihre Schicksale Terminal ¹⁶ erlassen.

Während der frühen Geschichte der Drosophila Entwicklungsbiologie, wurden fast ausschließlich Imaginalscheiben im Rahmen der normalen Entwicklung und in den wenigen Fällen, in denen ein Verlust oder Gewinn-of-function-Mutante lebensfähig war sucht. Die Verwendung von Röntgenstrahlen zu veran mitotische Rekombination zur letalen Mutationen erlaubt, in Zellklone in den Larven und erwachsenen Geweben analysiert werden. Dieses Verfahren wurde durch die Einführung von transgenen Verfahren verbessert worden, um den Verlust zu analysieren und gain-of-function Mutationen sowohl Larven und adulten Geweben. Die Anzahl der Antikörper, Transkriptions Reporter und Protein-Traps für die Beschreibung der molekularen Landschaft von Wildtyp und Mutante Gewebe ist auch constantly wächst. Mit Hilfe dieser molekularen Marker, um den Verlust zu analysieren und gain-of-function-Mutante Zellklone hat es immer möglich, eine Echtzeit-Verständnis, wie mutierten Zellen während der Entwicklung von ihren Wildtyp abweichen Vettern zu gewinnen. Um richtig nutzen diese Werkzeuge und Reagenzien ist es wichtig, qualitativ hochwertige Präparate von Imaginalscheiben, die angezeigt werden können, fotografiert und analysiert haben. Das Ziel dieses Manuskript ist, um ein optimiertes Protokoll für die Isolierung und Herstellung der augenAntennenScheibe Komplex (Figur 1A) zu liefern. Es kann auch erfolgreich verwendet, um eine Vielzahl von zusätzlichen Scheiben einschließlich derjenigen, die zu den Flügeln halteres, T1-T3 Beine und die Genitalien (1B-E) erhalten wird, zu isolieren. Dieses Verfahren, mit geringfügigen Modifikationen, wurde verwendet, um Imaginalscheiben von Drosophila für fast 80 Jahre zu isolieren.

Wie oben beschrieben, da die meisten Gene während mu exprimiertltiple Entwicklungsstufen und in einer Vielzahl von Geweben, ist es oft nicht möglich, die Effekte zu untersuchen, dass Null-Mutanten wurden auf der gesamten Augen das Tier stirbt, und vor dem dritten Larvenstadium Larvenstadium. Vier Methoden wurden die Untersuchung weiter entwickelten Geweben wie der Retina wesentlich leichter handhabbar gemacht. Die erste ist die Flippase (FLP) / Flippase Rekombination Target (FRT) Verfahren zur Erzeugung von Mutanten-Zellklone in einem ansonsten Wildtyp-Gewebe ^17-19. In diesem Fall wird das mutierte Gewebe wird durch das Fehlen einer visuellen Markierung, wie Green Fluorescent Protein (GFP) identifiziert und an die umliegenden Wildtyp-Gewebe, in dem GFP vorhanden ist (2D) verglichen werden. Das zweite ist das "FLP-out"-Methode, in der ein Transgen in einer Population von Zellen ²⁰ ausgedrückt. In diesem Fall sind die Zellklone werden durch die Anwesenheit von GFP identifiziert und auf die umliegenden Wildtyp-Gewebe, das die GFP-Reporter fehlt (Abbildung Vergleich2E). Die dritte ist die Mosaik-Analyse mit einem Reprimierbare Zellmarker (MARCM)-Technik, die Elemente des FLP / FRT-Mutante Klon und FLP-out-Expressionssysteme ²¹ verbindet. Mit diesem Verfahren wird ein Transgen in einer Population von Zellen, die gleichzeitig für einen einzelnen mutierten genetischen Locus exprimiert werden. Wie FLP-out-Klone sind Klone MARCM durch die Anwesenheit von GFP identifiziert und im Vergleich zu den umliegenden Wildtyp-Gewebe, das die GFP-Markierung (2F) fehlt. Und schließlich können die Gene und RNAi-Konstrukten in imaginal Gewebe unter der Kontrolle spezifischer Promotor GAL4-Konstrukten exprimiert werden. Diese vier Methoden haben das Interesse an einem Studium Imaginalscheiben seit Mutante oder Überexpression Klone oder Muster können direkt miteinander verglichen werden, um benachbarte Wildtyp-Gewebe erhöht. Die in diesem Verfahren beschriebenen Methode wurde so entwickelt, dass Forscher, die die post-embryonale Entwicklung von adulten Geweben in Drosophila zu untersuchen,insbesondere aus dem Blickantennenscheibe stammen, werden in der Lage, qualitativ hochwertige Gewebe für die Analyse zu erhalten. Obwohl einzelne Forscher haben leichte Modifikationen vorgenommen, hat der Kern dieses Verfahrens (die wir hier beschreiben) weitgehend unverändert geblieben. Seit Erlangung hochwertigen Gewebe ist entscheidend, um das Studium der Imaginalscheiben wir hoffen, dass dieses Protokoll geschrieben und dazugehörige Video wird als wertvolles Lehrmittel dienen.

Protokoll

1. Herstellung von Larven

1. Füllen Sie eine 35 mm Petrischale mit Dissektion Puffer.
2. Zeigen Larven in Petrischale und es ihnen ermöglichen, um für ein paar Minuten (Selbstreinigungsschritt) zu schwimmen.
3. Übertragen Larven zu einem Pool von Präparation Puffer auf Silikonbasis Schneideplatte. Dieser Pool ist an einer Kante der Platte ist. Die Schneideplatte aus einer Silikonlösung, die gegossen wurde und in einer Glaspetrischale ausgehärtet.
4. Mit einer Pasteurpipette, legen Sie einen größeren Pool von Dissektion Puffer in der Mitte der Platte Dissektion.
5. Mit # 5 Zangen, übertragen eine einzelne gereinigt Larve aus dem kleinen Pool in den größeren Pool von Dissektion Puffer.

2. Grob Dissektion der Larven

1. Während die Larve noch im großen Pool von Dissektion Puffer umklammern die Larve mit der Zange. Eine Pinzette sollte verwendet werden, um die Mundhaken greifen werden, während das andere Paar der Pinzette wird die anim haltenal noch (greifen die Larve sanft 03.01 Körperlänge).
2. Hold Steady die Zange, die die Oberhaut in der Nähe der Mundhaken, während schnell Ziehen der Rest des Körpers weg mit dem zweiten Paar der Pinzette.
3. Wenn die Larve beginnt zu zerreißen Sie eine leichte Freisetzung in Spannung zu spüren. Lassen Sie die Larve aus der Zange und damit für die "Innereien" der Larve zu verschütten. Dies ermöglicht die Imaginalscheiben in ihre normale Konformation bleiben und verhindert, dass sie verformt wird.
4. Mit einer Pinzette fassen die Mundhaken wieder auf das vordere Ende der Larve in Position zu halten. Mit der anderen Pinzette entfernen Sie die unteren zwei Drittel der Larven einschließlich der inneren Mut. Hinweis: ein Komplex der Mundhaken, die Augenantennenscheiben, Gehirnhälften, ventralen Ganglion, die Speicheldrüsen, einige Discs mit Bein, und die darüber liegende Oberhaut wird bleiben.
5. Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen darüberliegenden Oberhaut, der Speicheldrüsen, Beinscheiben undandere Gewebe. Hinweis: nur Gewebe, die bleiben, ist die Mundhaken, Augenantennenscheiben, Gehirnhälften sollte, und ventralen Ganglion (Abbildung 3).
6. Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.5 mit zusätzlichen Larven für 15-20 min. Hinweis: Imaginalscheiben in Präparation Puffer für längere Zeit bleiben neigen zum Abbau und letztendlich als weniger ideal Proben fotografiert werden angezeigt. So, nach maximal 20 min alle seziert Gewebe sollte der PLP Fixiermittel übertragen werden (siehe unten).

3. Fixierung und Färbung von Gewebe mit Antikörper

1. Mit Hilfe eines P-200 Pipetman, übertragen Sie die sezierten Gewebe auf ein Uhrglas mit kaltem Paraformaldehyd-Lysin-Periodatoxidation (PLP) Fixiermittel. Limit Volumen der übertragenen Dissektion Puffer zu 50 ul der Verdünnung von PLP zu minimieren. Achten Sie darauf, die Spitze mit einer Rasierklinge geschnitten, so dass die Spitze Öffnung groß genug, um die Gewebe seziert aufzunehmen. Verwendung einer Pinzette odereine Wolfram-Nadel sicherzustellen, dass die sezierten Gewebe völlig in Ordnung für die richtige Fixierung auftreten getaucht. Inkubieren seziert Gewebe in kaltem PLP Fixiermittel für 45 min. Diese Inkubation Ort bei RT ohne Rühren erfolgen.
2. Mit Hilfe eines P-200 Pipetman, übertragen Sie die sezierten Gewebe Puffer waschen (RT) mit einem anderen geschnitten gelben Spitze für 45 min. Grenze Volumen übertragen PLP zu 50 ul der Verdünnung des Waschpuffers zu minimieren. Hinweis: Alle seziert Gewebe sollte vollständig eingetaucht werden.
3. Übertragen 20-30 Sätze von seziert Gewebe in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Wenn eine größere Anzahl von Blickantennenscheibe Komplexe werden im Rohr kombiniert werden, gibt es eine Möglichkeit, dass das Gewebe an der Unterseite des Rohres nicht richtig an die Antikörper ausgesetzt werden. Für optimale Ergebnisse sollte nicht mehr als 20-30 Augenantennenscheibe Komplexe in einem einzigen Rohr vorhanden sein. Die sezierten Gewebe werden auf dem Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu regeln. Daher wird in den nachfolgenden Schritten uSE Pipetman zu entfernen und zu ersetzen Waschpuffer, Blocklösung und Antikörper.
4. Waschpuffer zu entfernen und ersetzen mit 100 l Blocking-Lösung: 10% normalem Ziegenserum in Waschpuffer. Inkubation bei RT unter leichtem Drehen auf einer Tischdreheinrichtung für 10 min.
5. Blockierlösung entfernen und ersetzen mit 100 ul primären Antikörper, die entsprechend in 10% normalem Ziegenserum verdünnt worden. Inkubation bei RT mit sanften Dreh für 16 Stunden.
6. Primären Antikörper zu entfernen und ersetzen mit 750 ul Waschpuffer. Die Röhrchen auf einem Kolbenpendel und lassen bei RT für 10 min nutieren. Hinweis: Der primäre Antikörper kann (Lagerung bei 4 ° C) gespeichert und später wiederverwendet werden. Wiederverwendung von Antikörpern mehrere Male bei der Verringerung der nicht-spezifischen Bindung zu helfen.
7. Ermöglichen, sich an die Unterseite des Rohres absetzen, dann entfernen Waschpuffer und 100 l Sekundärantikörper, die entsprechend in 10% Normalserum verdünnt worden. Inkubation bei RT mit sanften Dreh für 2̵1, 4 Stunden.
8. Entfernen Sekundärantikörperlösungen aus Gewebe und ersetzen mit 500 ul Waschpuffer. Gewebe ermöglichen, auf den Boden des Röhrchens zu begleichen.
9. Mit Hilfe eines P-200 und einen Schnitt gelber Spitze, übertragen alle Gewebe seziert, um einen Pool von Waschpuffer, die auf dem Seziertisch Schale gelegt wurde. Während mit dem nächsten Schritt der Fein Dissektion fortfahren, wird das Gewebe in der Waschpuffer inkubiert. Dies hilft, überschüssige Sekundärantikörper zu entfernen.

4. Fein Dissektion der Eye-Antennallobus Disc-Komplexe und Montage auf Folien

1. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Nagelhaut von den Mundhaken mit der Bauchseite des Komplexes nach unten falten. Mit einer zweiten Pinzette entfernen Sie die beiden Hirnlappen durch Schließen der zweiten Pinzette in den Raum zwischen dem Gehirn und Auge-Discs (Bild 3, roter Pfeil) und schnell zieht das Gehirn weg von den Mundhaken.
2. Während Sie auf die Mundhaken halten, kneifen Siedas Gewebe so nahe wie möglich an der Verbindung zwischen dem Antennenteil des Blickantennenscheibe und den Mund Haken (3, blauer Pfeil). Hinweis: Die Augenantennenscheibe Komplexe sollte frei von allen Geweben (Abbildung 1A) sein. Fortfahren, bis alle gewünschten gewünschte Gewebe, die auf Objektträger platziert werden können wurde seziert. Dieses Protokoll kann angepasst an Flügel, Haltere, Bein-und Genital Imaginalscheiben (Abbildung 1B-E) zu isolieren.
3. Fügen Sie zwei kleine Stücke von Tissue-Papier (Größe der Deckgläser) in ca. 3. Auseinander auf dem Seziertisch Gericht. Ein Glasobjektträger, auf dem Teller - die zwei Stücke von Tissue-Papier soll unter den Enden des Schiebers sein. Dies wird die Folie vom Kleben an der Silikonbasis der Seziersaal Gericht zu verhindern.
4. Verwendung eines P-20 mit einem ungeschnittenen Spitze hinzuzufügen 9 ul eines Anti-Bleichmittels zu der Mitte der Glasobjektträger. Dies verhindert, dass Bleichen der Gewebe, wenn mit fluoreszierenden angesehenLicht.
5. Mit der gleichen uncut Spitze, sammeln alle Augenantennenscheiben und fügen Sie sie der Tropfen Anti-Bleichmittel. Minimieren Sie die Anzahl der Waschpuffer, die über durchgeführt wird. Versuchen, die Menge an Waschpuffer auf 10 ul oder weniger zu begrenzen.
6. Verwenden Sie eine Pinzette zu trennen und verteilen Sie die Augenantennenscheiben innerhalb des Tropfens von Anti-Bleichmittel. Lassen Sie Discs in der Anti-Bleichmittel für einige Minuten inkubiert. Hinweis: Scheiben wird sich klar, wie das Gewebe absorbiert die Anti-Bleichmittel.
7. Mit einem feinen Pinsel vorsichtig senken einen Deckglas auf die Probe. Dies verhindert die Bildung von Luftblasen.
8. Objektträger bei -20 ° C bis bereit, die Auge-anten oder andere Imaginalscheiben mit Hilfe von Licht oder Fluoreszenzmikroskopie zu sehen.

Ergebnisse

Die Methode, die oben beschrieben ist zuverlässig produziert hochwertige Material für die Analyse mit In-situ-Sonden, Transkriptions Reportern, Protein-Traps und Antikörper. In Abbildung 1 zeigen wir Augen Antenne, genital, Flügel, Haltere und Beinscheiben, die routinemäßig mit diesem Verfahren gewonnen werden. Diese Scheiben sind mit einer Phalloidin-konjugierten Fluorophor, die F-Aktin bindet und daher beschreibt jede Zelle behandelt. Wenn das Gewebe richtig dann die morphogenetischen Furche ...

Diskussion

Obgleich dieses Verfahren weitgehend auf die Isolierung und nachfolgende Behandlung von Augenantennenscheiben konzentriert, ist es zugänglich ist zur Isolierung und Analyse des Flügels Haltere, Bein-und Genitalscheiben (4). Die einzige erforderliche Änderung des Protokolls zur Isolierung dieser Scheiben (im Gegensatz zum Auge-Antennenscheibe) ist die Methode der Grob Dissektion (Abschnitt 2 des Protokolls). Die ersten Brustbein (T1) Paar wird an der vorderen der Larve gefunden und kann durch das Protoko...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Sylgard 184 Silikonelastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0,5 KG	Wird verwendet, um eine Basis für die Sezierplatte zu erstellen
Pryex Glas Petrischale 150 x 20 mm	Dow Corning	3160-152CO	Verwenden Sie die Abdeckung für die Sezierplatte
#5 Präparierzange	Ted Pella	525	Pinzette muss sehr scharf gehalten werden
9 gut Uhrenglas	Vairous Vendors		Wird zur Fixierung von imaginalen Scheibenkomplexen
verwendet 50 ml Erlenmeyerkolben	Verschiedene Anbieter
Kleiner Rührstab	Verschiedene Anbieter		Klein genug, um in den Erlenmeyerkolben zu passen
50 ml Konische Röhrchen	Verschiedene Anbieter
1,5 ml Mikrofuge-Röhrchen	Verschiedene Anbieter		nach Anwendung Klar oder dunkel
Mikrofuge-Gestell	Verschiedene Anbieter
Tischrotator	Verschiedene Anbieter		100 μ l Volumen sollte bei niedriger Einstellung nicht spritzen
Paraformaldehyd	Macron Chemicals	2-26555-1	Dient als Fixiermittel
Natriumphosphat Monobasic	Sigma Chemical Co	S-3139	Wird zur Herstellung von Dissektions- und Waschpuffern verwendet
Natriumphosphat Dibasic	Sigma Chemical Co	71636	Wird zur Herstellung von Dissektions- und Waschpuffern
verwendet Lysin	Acros Organics	125221000	Wird in der Fixierlösung
Sodium Periodate	Sigma Chemical Co	S-1878	Verwendet in der Fixierlösung
Triton X-100	EMD Chemicals	MTX1568-1	Wird verwendet, um Imaginalscheiben zu perforieren
Natriumhydroxid	EM Science	SX0593-3	Wird verwendet, um Paraformaldehyd aufzulösen
100% normales Ziegenserum	Jackson Laboratories	005-000-121	Dient als Blockierungslösung
Primäre Antikörper	Verschiedene Anbieter		Verdünnen in 10 % Ziegenserum nach Anweisung des Herstellers
Sekundäre Antikörper	Verschiedene Anbieter		Verdünnen in 10 % Ziegenserum nach Anweisung des Herstellers
Vectashield	Molekulare Sonden	H-1000	Verhindert das Ausbleichen von Proben
Objektträger	Fischer Scientific	48312-003
Glas-Deckgläser 18 x 18 mm	Fischer Scientific	12-542A
Kimwipe Tissue	Verschiedene Anbieter		Verhindert das Anhaften von Objektträgern an der Silikonbasis
Panit Brush 000	Verschiedene Anbieter		Zum sanften Absenken des Deckglases auf Proben