Schnelle Analyse von Chromosomenaberrationen in Maus-B-Lymphozyten durch PNA-FISH

Zusammenfassung

DNA-Reparaturwege sind wichtig für die Erhaltung der genomischen Integrität und Mutation verhindert und Krebs. Das Ziel des Protokolls ist es, genomische Instabilität durch direkte Beobachtung von Chromosomenaberrationen in Metaphase-Spreads Quantifizierung von Maus-B-Zellen unter Verwendung von Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) für Telomer-DNA-Wiederholungen.

Zusammenfassung

Defekten DNA-Reparatur zu genomischer Instabilität, die die Ursache für Mutationen, die zu Tumorentstehung führen wird erhöht. Analyse der Häufigkeit und Art der Chromosomenaberrationen in verschiedenen Zelltypen ermöglicht Defekte in DNA-Reparaturwege aufgeklärt werden. Verständnis Säugetierbiologie DNA-Reparatur hat sich stark durch die Produktion von Mäusen mit Knockouts in bestimmten Genen geholfen. Das Ziel des Protokolls ist es, genomische Instabilität in Maus-B-Lymphozyten zu quantifizieren. Kennzeichnung der Telomere mit PNA-FISH-Sonden (Peptid-Nukleinsäure - Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung) ermöglicht die schnelle Analyse von genomischen Instabilität in Metaphasechromosom Spreads. B-Zellen haben spezifische Vorteile gegenüber Fibroblasten, weil sie normale Ploidie und eine höhere mitotische Index haben. Kurzzeitkultur von B-Zellen ermöglicht daher eine genaue Messung der genomischen Instabilität in einer primären Zellpopulation, die voraussichtlich weniger Neben genetische Mutation ists als das, was in der Regel in transformierten Fibroblasten oder Patientenzelllinien gefunden.

Einleitung

Krebs wird durch die Akkumulation von Mutationen, die Gene, die die normale Zellwachstum regulieren verursacht. Mutation ist eine Folge von Änderungen in der Struktur und Sequenz des Genoms von DNA-Schäden verursacht. DNA-Schädigungen können durch eine Vielzahl von Verfahren, einschließlich exogener Agenzien wie ionisierende Strahlung auftritt, und als ein Nebenprodukt des normalen Zellstoffwechsels, wie zum Beispiel spontane Desaminierung von Nukleotidbasen oder Beschädigung durch Kontakt mit reaktiven Sauerstoffspezies ¹ auftritt.

Obwohl Säugetierzellen besitzen eine Reihe von Aktivitäten, die Reparatur von DNA-Schäden rückgängig zu machen oder wiederherzustellen die Reihenfolge Bruchstellen können Mutationen dennoch während der gesamten Lebensdauer einer Zelle akkumulieren. DNA-Schädigungen können ferner dazu beitragen, Seneszenz und Verlust der Potenz von Stammzellen, zwei Verfahren, die mit dem Altern verbundene Erkrankung ² zugeordnet sind. Das Verständnis der Reparatur von DNA-Schäden ist daher von zentraler Bedeutung bei der Bewältigung zwei Zeichenificant in der öffentlichen Gesundheit. Zunehmende Hinweise darauf, dass Säugetier-DNA Reparaturwege können auf die Entwicklung der Krebszellgenom ^3,4 beitragen, so dass es umso wichtiger, die Prozesse bei der Unterdrückung Mutation auf molekularer Ebene zu verstehen.

Direkte Visualisierung von Chromosomenaberrationen ist ein leistungsfähiges und quantitative mittels Bestimmung des Ausmaßes der genomische Instabilität in einem bestimmten Zelltyp. Kondensierte Chromosomen von Zellen in der Metaphase kann isoliert und untersucht unter Verwendung von Licht oder Fluoreszenzmikroskopie. Solche zytogenetische Ansätze wurden in der Praxis seit Jahrzehnten und kann verwendet werden, um das Auftreten von Translokationen oder spezifische Typen von Chromosomenaberrationen unter Verlust von DNA-Reparatur-Aktivitäten assoziiert nachzuweisen. Das Protokoll eignet sich für mehrere potenzielle Erweiterungen: Chromosomen können mit Sonden zur spektralen Karyotypisierung (SKY) oder mehrfarbige Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung gekennzeichnet werden(MFISH) für die Umsiedlung ^5,6 identifizieren. Diese Techniken ermöglichen auch die Häufigkeit der Chromosomentranslokationen und die Struktur komplexer Chromosomentranslokationen zu bestimmen, die über das mit diesem Protokoll ist es möglich zusätzliche Informationen bietet. Alternativ können sequenzspezifische Sonden erzeugt und verwendet, um die Häufigkeit von DNA-Bruch an ausgewählten Standorten genomischen ⁷ getestet werden.

In diesem Protokoll beschreiben wir Herstellung von Metaphasen-Chromosomen-Spreads von B-Lymphozyten. Ein fluoreszenzmarkierten Peptid-Nukleinsäure (PNA) Sonde für Telomerabschnitten verwendet wird, die wirksam markiert Telomere in Metaphase-Chromosomen verteilt Dieses Protokoll hat mehrere Vorteile. B-Zellen induziert werden kann, um bei hohen Mitoseindex wachsen, so dass hochwertige Spreads konsistent hergestellt werden. B-Zellen von genetisch veränderten Mäusen sind auch viel weniger wahrscheinlich, dass sekundäre genetische Mutationen, die die Analyse des Beitrags verwechseln können, enthaltenspezifischer Gene zu genomischen Integrität. Die PNA-FISH-Ansatz kann in einem Tag abgeschlossen werden, und ermöglicht eine genauere Wertung der Chromosomenbrüche. Durch die Nutzung dieser Ansatz, insbesondere in Kombination mit in diesem Protokoll beschriebenen spezifischen Geräten ist es möglich, sehr konsequent, hochwertige Brotaufstriche produzieren und schnell analysieren die Geschwindigkeit und Art der genomische Instabilität.

Protokoll

Dieses Verfahren wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Rutgers, der State University of New Jersey genehmigt. Die Mäuse wurden in Übereinstimmung mit der NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren behandelt. Wissenschaftler sollten ihre nationalen und institutionellen Tierorganisationen für etablierte und genehmigten Richtlinien konsultieren.

Bevor Sie beginnen, bereiten die in Tabelle 1 aufgeführten Lösungen.

1. B-Zell-Isolierung und Aktivierung

Euthanize eine Maus mit CO _2, gefolgt durch zervikale Dislokation. Bewegen Sie die Maus, so dass die linke Seite des Körpers ist und sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol, bis das Fell ist feucht. Sezieren die Milz und in einem 35-mm-Gewebekulturschale mit 2 ml Waschpuffer. In einer Steril, sanft brechen die Milz in der Gewebekulturschale mit dem flachen Ende einer 5-ml-Spritze.

1. Legen Sie eine 70 um Nylon-Mesh in einen 50ml-Tube und die Milz Probentransfer in 2 ml Waschpuffer in die Nylon-Mesh. Stören Sie vorsichtig die Milz in die Maschen mit dem flachen Ende der Spritze.
2. Spülen Sie die Rückseite der Spritze und die 35 mm-Platte mit 8 ml Waschpuffer und filtern durch die 70 um Nylon-Mesh. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C ist.
3. Absaugen und den Überstand verwerfen und das Pellet in 3 ml ACK-Lysepuffer. Pipette auf und ab kurz, um Klumpen zu stören und Inkubation für 5 min. 10 ml Waschpuffer und Zentrifugieren bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C ist.
4. Absaugen und den Überstand verwerfen und das Pellet durch Antippen der Boden der Röhre dann durch Pipettieren in 1 ml Waschpuffer. Fügen Sie 50 ul von anti-CD43 MACS-Mikroperlen und Inkubation auf Eis für 30 min. 10 ml Waschpuffer, vorsichtig mischen und zentrifugieren bei 300 g für 10 min bei 4 ° C. 10 ml Waschpuffer, vorsichtig mischen und zentrifugieren bei 300 g für 10 min bei 4 ° C.
5. Richten Sie einMini-MACS-Säule, indem Sie eine Spalte auf der MACS-Magnet. Positionieren Sie eine markierte 15 ml konischen Röhrchen unter der Spalte. 1 ml Waschpuffer, um Spalte und zu ermöglichen, durch den 15-ml-Tube laufen.
6. Aspiration des Überstands und Resuspendieren in 1 ml Waschpuffer. Legen Sie die Probe in der Spalte nach der Waschpuffer durchgelaufen ist.
7. Nachdem die Probe durch die Säule laufen, 1 ml Waschpuffer, um die Säule zu waschen. 7 ml Waschpuffer direkt mit der gesammelten Probe in 15 ml Röhrchen.
8. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Übertragen Sie das erforderliche Volumen der Zellen, die für 5.000.000 Zellen benötigt / Well in einer 50 ml Tube. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C ist. Supplement B-Zell-Medium mit LPS 1: 500 und IL4 1: 1.000.
9. Saugen Sie den Überstand und die erforderliche Menge von B-Zell-Medium ergänzt für die endgültige Konzentration von 1.000.000 Zellen / ml benötigt.
10. Plattenzellen in 6-well-Platten mit 5 ml Zellen bei 1.000.000 Zellen / ml und in einer humidifiED Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C, 5% CO _2.

2. B-Zell-Fixierung

1. Dann werden 50 ul Colcemid in die Vertiefung, die 5 ml von B-Zellen (bei einer Endkonzentration von 100 ng / ml) und Inkubation 1 h bei 37 ° C aufweist. Vorwärmen 75 mM KCl-Lösung in einem 37 ° C Wasserbad. Übertragen Sie die B-Zellen mit einer markierten 15-ml-Tube. Decken das Etikett mit Band und Zentrifuge bei 300 g für 10 min bei 4 ° C.
2. Saugen Sie den Überstand, wobei 1 ml in die Röhre und das Pellet durch Pipettieren. 5 ml des vorgewärmten KCl Tropfen für Tropfen, während die Erschließung oder pulsierend auf einem Vortex.
3. 10 ml KCl und mischen durch Invertieren. Inkubieren in einem 37 ° C Wasserbad für 15 min. 5 Tropfen frischen Fixiermittel und Mischung durch Umdrehen. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C ist. Saugen Sie den Überstand, wobei 1 ml in der Tube und Pellet erneut durch Pipettieren von oben und unten.
4. 5 ml frischem Fixativ tropfen beim Tippen oder pulsierend auf einem VORtex. Fügen Sie eine zusätzliche 10 ml Fixiermittel und Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
5. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C ist. Saugen Sie den Überstand, wobei 1 ml in Rohr und resuspendieren durch Pipettieren. Hinzufügen 14 ml frisches Fixiermittel und Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C ist.
6. Wiederholen Sie Schritt 2.7 noch zweimal.
7. Fügen Sie 14 ml frischem Fixativ. Verschließen Sie die Kappen mit Parafilm und über Nacht bei -20 ° C.

3. Vorbereitung der Metaphasechromosom Spreads

1. Stellen Sie eine geregelte Klimakammer auf 22,9 ° C und 52% Luftfeuchtigkeit.
2. Zentrifuge die Fest B-Zellen bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C ist. Absaugen lassen Fixativ 70 ul in der Röhre und resuspendieren durch Pipettieren.
3. Zeigen markierten Folien in der Feuchtkammer bei 35 ° Winkel. Fallen 35 ul der resuspendierten B-Zellen auf einem Objektträger und legen zwei Folien pro Probe. Die Objektträger in der feuchten Kammer für 30 Minuten trocknen dann speichern Sie die Folienin einer Dia-Box bei 37 ° C aufweist.

4. Telomere PNA FISH

1. Vorbereitung der Probe
   1. Vorwärmen entionisiertem Formamid bis 37 ° C beträgt. Mix 2 ul Telomer PNA-Sonde mit 7 ul entionisiertem Formamid vorgewärmt und bei 37 ° C unter Schütteln für 1 Stunde.
   2. Pre-Master-Mix warmen FISH auf 37 ° C. Hinzufügen 7 ul vorgewärmt FISH Master-Mix auf die Mischung aus Schritt 4.1.1 und bei 37 ° C für 1-3 Stunden.
   3. Denaturierung der Sonde Gemisch 8 min bei 80 ° C aufweist. Pre-Annealing der Sonde für 1 Stunde bei 37 ° C aufweist.
2. Vorbehandlung der Chromosomen Slides
   1. Pre-wärmen einen Objektträger aus Glas-Küvette mit 50 ml 0,01 M HCl auf 37 ° C in einem Wasserbad.
   2. Die Objektträger in einem anderen Glasträger-Färbung Gefäß mit 2x SSC für 5 min bei Raumtemperatur.
   3. Add 2 ul Pepsin Lager an die vorgewärmten Objektträger aus Glas-Küvette und mischen durch Invertieren. Die Objektträger in diesem Glas slide-Küvette und Inkubation 90 Sekunden bei 37 ° C.
   4. Waschen Sie die Slides 2x in einer anderen Glasträger-Küvette aus 1x PBS für jeweils 5 min bei Raumtemperatur unter Schütteln. Dann waschen Sie die Folien für 5 min in 1x PBS / MgCl ₂ bei Raumtemperatur, Zittern.
   5. Die Objektträger in einem Glasobjektträger-Küvette mit frisch zubereiteten 1% Formaldehyd / 1x PBS / MgCl ₂ für 10 min bei Raumtemperatur.
   6. Waschen Sie die Folien für 5 min in einem anderen Glasträger-Küvette aus 1x PBS bei Raumtemperatur unter Schütteln.
   7. Bereiten Sie eine Ethanol-Dehydratisierung Serie von mit getrennten Glasobjektträger-Küvetten mit 70%, 90% und 100% Ethanol.
   8. Die Objektträger in jedes Glas für 3 min, beginnend mit 70% Ethanol, 90% Ethanol, dann, und dann 100% Ethanol. Zeigen Ethanol Gläser bei -20 ° C, wenn Sie fertig.
   9. Lassen Sie die Folien an der Luft trocknen, indem überschüssige Ethanol auf ein Papiertuch und stützte Objektträger bei 35 ° Winkel. Einmal trocken, mark ein 18 x 18 mm-Bereich für eine Hybridisierung an der Rückseite der Führungen mit einem Diamantstift.
3. Denaturierung der Objektträger für FISH
   1. Gelten 120 ul 70% deionisiertem Formamid / 2X SSC zu einem 24 x 60 mm Deckglas. Tippen Sie auf die Folie, um das Deckglas. Denaturieren die Folie bei 80 ° C auf einer Heizplatte für 90 Sekunden.
   2. Schnell und vorsichtig aus dem Deckglas und legen Sie die Folie in eiskaltem 70% Ethanol für 3 min, gefolgt von 90% Ethanol und 100% Ethanol jeweils für 3 min. Lassen Sie die Folien an der Luft trocknen.
   3. Bereiten Sie eine feuchte Kammer von Futter eine Kunststoff-Box mit einem dichten Deckel und nasse Seidenpapier. Das Papier sollte feucht sein, aber nicht mit Wasser gesättigt ist.
   4. In einer feuchten Kammer, gelten die vorgeglüht Sonden-Mix aus Schritt 4.1.3 markierten Bereich auf der Folie, Deckel mit einem 18 x 18 mm Deckglas und bei 37 ° C für 1 Stunde.
4. Post-Inkubation Waschanlagen
   1. Pre-warmen 50% Formamid / 2x SSC, 1x SSC, und 4x SSC / 0,1% Tween-20 in einem 45 °; C Wasserbad.
   2. Entfernen Sie vorsichtig die Deckgläser und waschen Sie die Folien in vorgewärmten 50% Formamid / 2x SSC 3xfor jeweils 5 min im Dunkeln und Schütteln. Jedem Wasch die Folien in vorgewärmten 1x SSC 3xfor 5 min Schütteln. Schließlich, waschen Sie die Folien in vorgewärmten 4x SSC / 0,1% Tween-20 3xfor jeweils 5 min.
   3. Färben die Folien für 3 min in DAPI in einem lichtgeschützten Glasobjektträger-Küvette.
   4. Für 5 min in 2x SSC waschen Sie die Dias, schüttelnd. Bewerben 35 ul Mowiol Mounting Medium, Deckel mit 24 x 60 mm Deckgläser und Objektträger bei 4 ° C.

5. Die mikroskopische Analyse der Chromosomen

1. Analysieren Sie die Metaphase Dias mit einem Standard-Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskop. Verwenden Sie ein Imaging-Plattform mit einem automatisierten Stufe wie die MetaSystems Metafer Plattform, um die besten Ergebnisse zu erhalten. Für jeden Metaphasespreitung ein Bild für das Fluoreszenzsignal von der Telomer-p, sammeln ein Bild für DAPI-Fluoreszenz zu Chromosomen sichtbar zu machen, undRobe. (ZB sind Cy3 andere Fluorophore verfügbar und arbeiten gleich gut.)
2. Überlagern die Bilder mit einem Bildanalyse-Programm und zu analysieren.

Ergebnisse

Metaphase-Chromosomen aus einer Zelle stamm eine diskrete Cluster, die 40 Chromosomen (bei ​​Verwendung von Mauszellen) (1A) zu bilden. Jedes Chromosom hat einen Zentromer an einem Ende, die als Licht blaue Kugel sichtbar ist. Im normalen Chromosomen sind zwei Telomer Signale am Ende der Chromatiden und zwei Signale, die von jedem Romer gesehen. Interphase-Kernen auf der Folie zugegen sein. Diese werden als blaue Kugeln, mit rotem Telomer-Signale, aber keine kondensierten Chromosomen (siehe zum Beispiel...

Diskussion

Wohingegen aktivierte B-Lymphozyten sind besonders zur Herstellung von mitotischen Chromosomen-Spreads geeignet, können andere Zelltypen verwendet werden. T-Lymphozyten zu teilen viele der Vorteile von B-Zellen, wie sie aus der Milz oder den Lymphknoten gereinigt werden, und haben einen hohen mitotischen Index, wenn durch das Wachstum in Medium mit geeigneter Mitogene ⁸ stimuliert. Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) sind auch für Metaphasechromosom Analyse ⁹ geeignet. Wenn diese nicht vorhanden sin...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
50% Dextransulfat	Intergen	S4030
deionisiertes Formamid	Ambion	9342
Pepsin (5 g)	Sigma	P 6887
FCS	Gemini	100-106
LPS (100 mg)	Sigma	L2630
IL-4 (5 μ g)	Sigma	I1020
PNA Telomersonde	PNA Bio Inc	F1002	(CCCTAACCCTAACCCTAA)
Colcemid	Roche	295892
Mowiol 4-88	Sigma	81381-50g
CD43 (ly-48_) Mikrokügelchen	Miltenyl Biotec.	130-049-801
DAPI	Sigma	32670-5MG
Eclipse E800	Nikon
AxioImager.Z2	Zeiss
CDS-5 Zytogenetische Trockenkammer	Thermotron