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Methodenartikel

A Novel In vivo Gentransfer-Technik und In-vitro- Zellbasierte Assays für das Studium der Knochenverlust in Skeletterkrankungen

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DOI:

10.3791/51810

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8. Juni 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Rheumatology, Allergy and Clinical Immunology, University of California, Davis, 2Institute for Pediatric Regenerative Medicine, Shriners Hospitals for Children - Northern California, 3Department of Dermatology, University of California, Davis

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Differenzierung von Vorläuferzellen in Osteoklasten wird durch Zytokine und Wachstumsfaktoren reguliert. Hier werden eine neuartige Gentransfertechnik zur Differenzierung von Osteoklasten in vivo und Zellkulturprotokolle zur Differenzierung von Vorläuferzellen in Osteoklasten in vitro als Methode zur Untersuchung der Auswirkungen von Zytokinen auf die Osteoklastogenese beschrieben.

Zusammenfassung

Die Differenzierung und Aktivierung von Osteoklasten spielt eine Schlüsselrolle bei der Entstehung von Muskel-Skelett-Erkrankungen, da diese Zellen hauptsächlich an der Knochenresorption beteiligt sind. Osteoklasten können in vitro aus Monozyten-/Makrophagen-Vorläuferzellen in Gegenwart bestimmter Zytokine erzeugt werden, die das Überleben und die Differenzierung fördern. Hier werden sowohl in vivo- als auch in vitro-Techniken demonstriert, die es den Wissenschaftlern ermöglichen, verschiedene Zytokinbeiträge zur Differenzierung, Signalgebung und Aktivierung von Osteoklasten zu untersuchen. Das Minicircle-DNA-Verabreichungs-Gentransfersystem bietet eine alternative Methode zur Etablierung eines Osteoporose-bezogenen Modells, das besonders nützlich ist, um die Wirksamkeit verschiedener pharmakologischer Inhibitoren in vivo zu untersuchen. In ähnlicher Weise ermöglichen In-vitro-Kultivierungsprotokolle zur Herstellung von Osteoklasten aus menschlichen Vorläuferzellen in Gegenwart spezifischer Zytokine den Wissenschaftlern, die Osteoklastogenese in menschlichen Zellen für translationale Anwendungen zu untersuchen. In Kombination haben diese Techniken das Potenzial, die Wirkstoffforschung für osteoklastenspezifische zielgerichtete Therapeutika zu beschleunigen, von denen Millionen von Osteoporose- und Arthritis-Patienten weltweit profitieren können.

Einleitung

Muskel-Skelett-Erkrankungen betreffen Millionen von Menschen in den Vereinigten Staaten und Gegenwart schwerwiegende Folgen für die nationalen und lokalen Gesundheitssysteme ein. Diese Erkrankungen sind durch den Verlust von Knochen-und Gelenkfunktion, die umfangreiche Behandlung und lange Erholungsphasen erfordern gekennzeichnet. Üblicherweise wird eine relative Erhöhung der Anzahl und / oder Aktivität von Osteoklasten, spezialisierte Zellen zu Knochenresorption, Osteoporose und Arthritis beobachtet 2. Unter physiologischen Bedingungen ist die Anzahl und Aktivität von Osteoklasten durch Rezeptor-Aktivator-von Kernfaktor κ-B-Liganden (RANKL), die von Osteoblasten produziert wird geregelt. Osteoprotegerin (OPG), wird ein Köder Rezeptor für RANKL auch durch Osteoblasten 3 erzeugten In-vivo-Tiermodelle, die systemische Überexpression von sRANKL oder Deletion von OPG einzubeziehen sind sehr wertvoll bei Osteoporose-Forschung. Allerdings erfordern diese Verfahren die Herstellung von transgenen Mäusen 4,5. Hier wird eine neuartige AlternativeVerfahren überexprimieren sRANKL für die Untersuchung von Muskel-Skelett-bedingten Erkrankungen beschrieben. Insbesondere Minicircle (MC) DNA-Technologie und hydrodynamischen Versandmethoden wurden verwendet, um Gen-Transfer von sRANKL in vivo zu erreichen und überexprimieren Maus sRANKL systemisch 6.

Diese Methode ist auch eine Ergänzung zu anderen in-vivo-Modelle von Osteoporose, wie hormonelle Modulation der Osteoklasten folgenden ovariectomy 7 und diätetische Intervention durch kalziumarme Ernährung 8. Diese Modelle sind sehr nützlich, um verschiedene Aspekte des Bewegungsbedingten Störungen aber sie erfordern chirurgische Verfahren und kann bis zu mehreren Monaten, was mit erheblichen Kosten 9 studieren. Ovariektomierte (OVX) Nagetier-Modell ist ein Modell, bei dem Versuchstier Entfernung der Eierstöcke führt zu Östrogenmangel, wodurch menschliche postmenopausalen Osteoporose 10 imitiert. Menschen postmenopausalen Osteoporose, eine Erkrankung, bei Östrogen deficirenz führt zu einem erhöhten Risiko von Knochenbrüchen und Osteoporose rund acht Millionen Frauen allein in den Vereinigten Staaten. Obwohl die OVX Modell ist nützlich für postmenopausalen Osteoporose bietet begrenzte Vorteile bei der Untersuchung von Osteoporose im Allgemeinen. Östrogen unterdrückt Knochenverlust, durch Induktion von Osteoklasten und Osteoblasten Hemmung der Apoptose, also in seiner Abwesenheit eine erhöhte Aktivität der Osteoklasten beobachtet 10-12. Ein RANKL-OPG-Verhältnis Ungleichgewicht, das die Knochenresorption begünstigt wird auch beobachtet, 13. Jedoch Östrogenmangel in vivo auch begleitet von verringerten Niveaus des transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF β), erhöhte Interleukin-7 (IL-7) und TNF, IL-1 und IL-6 14,15. Da diese Zytokine Knochenumbau modulatorische Funktionen der RANKL Weg unabhängig bekannt ist, ist es unmöglich, eine Osteoklastenaktivierung nur auf die RANKL-RANK-Achse zuzuordnen. Die in diesem Dokument beschriebene Modell ermöglicht es Forschern, in viv studierenRANKL-RANK-o-Achse in Osteoklastogenese und Knochenverlust ohne pro-inflammatorischen Zytokinen im Vergleich zu OVX Nagetiermodellen.

Zusätzlich kann in vitro Osteoklastogenese Techniken sind wesentliche Instrumente zur Aktivierung der Osteoklasten für mögliche therapeutische Behandlungen von Muskel-Skelett-Erkrankungen zu studieren. Frühere Studien haben auch gezeigt, dass die Kultivierung Knochenmark der Maus Makrophagen (BMM) mit Maus-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) und Maus sRANKL können, um die Differenzierung von Osteoklasten 3,16,17 führen. Hier werden die Protokolle kernige Osteoklasten-ähnliche Zellen aus Maus-Knochenmark sowie aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) in vitro zu erzeugen 18 beschrieben. Die zellbasierte Assays erforderlich, um eine reife terminal differenzierten und voll funktions Osteoklasten definieren ebenfalls kurz beschrieben. Diese in-vitro-Techniken ergänzen den Roman in vivo Ansatz zusammen und dienen als powerful Untersuchungswerkzeuge, um die Differenzierung von Osteoklasten und Aktivierung zu studieren. Mit Hilfe dieser Systeme sind die Wissenschaftler in der Lage, die Osteoklasten in vivo und in vitro zu erzeugen und definieren Sie die Reize und Signale für ihre Verbreitung und Aktivierung erforderlich sowie testen die Wirksamkeit von pharmakologischen und biologischen Inhibitoren.

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Protokoll

1. Hydrodynamische Lieferung der sRANKL MC DNA

  1. Hydrodynamische Lieferung über Mausschwanzvene
    1. Wiegen Sie die Maus vor der Schwanzveneninjektion. Verdünnen sRANKL oder grün fluoreszierende Protein (GFP) MC in Ringer-Lösung (pre-warmen bei 37 ° C) in einem Gesamtvolumen von ca. 10% der Mauskörpergewicht.
    2. Wärmen Sie die Maus in einem Käfig für 10 Minuten vor der Injektion, um die Blutgefäße erweitern und machen seitlichen Venen (LVs) sichtbar. Überwachen Sie die Maus sorgfältig zu Dehydrierung und Hyperthermie zu vermeiden.
    3. Sobald die LVs sind erweitert und sichtbar, übertragen Sie die Maus auf den Restrainer und den Stecker weit genug in den Lauf, um die Bewegung zurückzuhalten. Überwachen Sie die Maus für die normale Aktivität wie Atmung. Stellen Sie den Stecker des Restrainer, wenn nötig.
    4. Desinfizieren Sie die Injektionsbereich 3/4 von der Spitze des Schwanzes mit einem Alkoholtupfer. Verwenden Sie eine 27 bis 30 G-Nadel für die Mausschwanzveneninjektion. Halten Sie den Schwanz mit einer Hand fest und legen Sie die Nadel inin die Schwanzvene. Üben Sie Druck auf die Spritze und füllen Sie die Injektion innerhalb von 5-7 Sekunden.
    5. Entfernen Sie die Nadel aus der Schwanzvene und Druck mit einem Wattebausch auf die Injektionsstelle, um Blutungen zu stoppen. Überwachen Sie die Maus für 15-30 min, übertragen Sie dann die Maus wieder auf, sobald das Vivarium Atemfrequenz wird auf seiner normalen Geschwindigkeit reduziert.
  2. Bestätigung der Maus Systemische sRANKL Expression und Quantifizierung der Maus Serum TRACP5b Beitrag Gentransfer
    1. Wärmen Sie die Maus in einem Käfig für 5-10 min, um die Blutgefäße erweitern und machen LVs sichtbar. Überwachen Sie die Maus sorgfältig zu Dehydrierung und Hyperthermie zu vermeiden.
    2. Machen Sie einen kleinen Schnitt mit einem Messer an der Maus den Schwanz an einem Ort, ein Viertel von der Spitze des Schwanzes.
    3. Sammeln Sie etwa 100 ul Blut im Serum Trennung Röhren.
    4. Serumtrennröhrchen bei Raumtemperatur inkubiert für 30 min.
    5. Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 xg für 5 min und sammeln Serum. Store Serum -80 ° C zur weiteren Analyse.
    6. Führen sRANKL ELISA und Mausserum TRACP5b Assay auf Serum-Proben unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits.

2. Osteoklasten in vitro Generierung von Maus BMM

  1. Isolierung und Kultivierung von BMM
    1. Die Isolierung des Schien-und Oberschenkelknochen: Euthanize den Spender-Maus mit CO 2, und desinfizieren Sie die Beine mit 70% Ethanol. Präparieren Sie vom Schambein zu dem Fersenbein, um die Oberschenkel und Schienbein Knochen entfernen intakt.
    2. Entfernen Sie die Haut-und Muskel sorgfältig, ohne die Knochen. Platzieren verarbeitet Femur und Tibia Knochen in eine Petrischale mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
    3. Entfernung von Knochenmark: Schneiden Sie die Spitze auf der einen Seite der Oberschenkel und Schienbein Knochen und spülen, die Knochenmark in einen 50-ml-Tube mit einer 1 ml-Spritze mit einer 25 G-Nadel, mit α-MEM mit 1% Penicillin / Streptomycin belastet (Osteoklasten Kultur Medium / OCM).
    4. Prozessknochenmark: Mix und übertragen Knochenmark-Suspension auf einen neuen 50-ml-Tube, indem es durch einen 70 um Nylon Zellsieb. Zentrifugation der Zellen bei 300 × g und resuspendieren in α-MEM, das 1% Penicillin / Streptomycin und 10% FBS (Osteoklasten-Kulturmedium / OCM (+)).
  2. Kultur von Makrophagen
    1. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer oder automatische Zellzähler.
    2. Platte 1 x 10 6 Zellen pro Well einer 6-Well-Platte oder 3 × 10 5 Zellen auf Glasdeckgläschen (5 mm) oder Dentinscheiben in 96-Well-Platte gelegt und bei 37 ° C
    3. Saugen Sie alle Medien, die nicht-adhärenten Zellen und Inkubation Zellen bei 37 ° C mit frischem OCM (+) mit 25 ng / ml Maus M-CSF für 48 Stunden.
    4. Saugen Sie alle Medien Zellen und Inkubation bei 37 ° C mit frischem OCM (+)-Medien mit 25 ng / ml Maus M-CSF und 30 ng / ml Maus sRANKL Osteoklastogenese zu initiieren. Tanken Medien alle 3 Tage nach Bedarf.
    5. Zellen wachsenca. 6-8 Tage, um das riesige Mehrkernzellen, die Resorption Knochen zu bilden. Sobald kernige Zellen erscheinen, führen TRAP (Tartrat-resistente saure Phosphatase)-Färbung mit einem kommerziell erhältlichen Kit, und als voll ausgereift, führen Funktionstests. Visualisieren F-Aktin-Ringe auf Deckgläsern mit Phalloidin-Färbung und Bild die Zellen angebracht, um Scheiben durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM), wie zuvor beschrieben 19 Dentin.

3. Osteoklasten in vitro-Erzeugung aus Menschen PBMCs

  1. Isolierung von humanen PBMCs
    1. 10 ml vorgewärmten Histopaque-1077 in ein 50-ml-Tube.
    2. Leere Leukozytenfilter aus Blutbank mit sterilem PBS erhalten in einen 50-ml-Tube (1:1-Verhältnis von Blut mit PBS). Schicht die verdünnte Blut über die Histopaque Lösung sehr langsam, dafür sorgen, dass das Blut nicht mit dem Histopaque mischen.
    3. Zentrifuge Proben bei 1000 g für 20 min bei 18 ° C. Folgening Zentrifugation sorgfältig isolieren weiß Buffy-Coat-Schicht, die die weißen Blutkörperchen und übertragen auf ein neues 50-ml-Tube.
    4. Zellen mit PBS verdünnen und Zentrifuge wieder bei 650 g für 5 min, um die Zellen zu sammeln.
    5. Überstand entfernen und resuspendieren Zellen in OCM (-) Medien und zählen Zellen mit Zellzähler.
  2. Plating und Kultivierung PBMCs
    1. Resuspendieren der Zellen in OCM (+)-Medium und der Platte 8 x 10 6 Zellen / ml pro Vertiefung einer 6-Well-Platte oder 1 x 10 6 Zellen / ml pro Vertiefung in 96-Well-Platte. Platten Zellen auf Glasdeckgläschen (5 mm), die für Immunfluoreszenz-Bildgebung als auch auf Knochenscheiben für Knochenresorption Assays, wie zuvor beschrieben 20 erforderlich.
    2. Änderung Kulturmedien, Auffüllen der Zellen mit menschlichen M-CSF alle 2-3 Tage oder nach Bedarf. Dann Differenzierungsschritt am Tag 5 gehen durch Zugabe von 30 ng / ml humanes sRANKL zusammen mit 25 ng / ml menschlichen M-CSF in OCM (+)-Medium zu initiieren osteoclastogenesist.
    3. Wachsen Zellen für ca. 14 bis 21 Tage, um das riesige Mehrkern Zellen zu bilden. Sobald kernige Zellen angezeigt werden, können diese Zellen dann für TRAP beschriftet werden, und als voll ausgereift, können funktionelle Assays durchgeführt werden. F-Actin-Ringe können auf Deckgläsern mit Phalloidin-Färbung sichtbar gemacht werden. Die Morphologie der Zellen in Zellen angebracht, um Scheiben von SEM Dentin untersucht werden.

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Ergebnisse

Hier wird ein neuartiges Gentransfertechnik zur Differenzierung von Osteoklasten in vivo Zellkulturprotokolle zur Differenzierung in Osteoklasten-Vorläuferzellen in vitro als ein Verfahren, um die Wirkungen von Cytokinen auf die Entstehung von Osteoclasten zu studieren beschrieben. In Fig. 1 sind die repräsentativen Ergebnisse erfolgreicher Gentransfer von GFP und Maus sRANKL MC in Mäusen gezeigt. In Abbildung 2 sind die repräsentativen Bilder von Knochenmark der Maus ...

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Diskussion

Erkrankungen des Bewegungsapparats sind die führenden Ursachen von Morbidität und Behinderung und werden von über 150 Krankheiten und Syndrome besteht; Auswirkungen auf heute etwa 90 Millionen Amerikaner. Gelenkentzündungen und Knochenzerstörung wiegen Merkmale Erkrankungen des Bewegungsapparats, einschließlich Arthritis und Osteoporose. Osteoporose ist eine Erkrankung, die Knochen schwächt Integrität, die häufig Frakturen der Knochen führt. Arthritis ist eine chronische, schwächende Erkrankung, die durch Entzündung der...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Forschung wurde teilweise durch die NIH-Forschungszuschüsse R01 AR062173 und SHC 250862 an IEA unterstützt. ES ist Empfänger des NIH T32 CTSC Predoctoral Fellowship

.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
alpha-MEMLife Technologies 12561-056
Humaner M-CSFMiltenyi Biotec130-096-492
Maus M-CSFMiltenyi Biotec130-094-643
Humaner RANK-Ligand - löslichMiltenyi Biotec130-094-631
Maus RANK-Ligand - löslichMiltenyi Biotec130-094-076
Tailveiner Suspension für MäuseBraintreeTV-150 STD
Maus TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit Forschung & Forschung D systemsMTR00
Saure Phosphatase, Leukozyten (TRAP) KitSigma387A
MouseTRAP Assay immundiagnostische SystemeSB-TR103

Referenzen

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